Fondo
mtodos
Seis cepas de P. falciparum con diferentes mutaciones pfmdr1 se cargaron con Fluo-4 PM. La
acumulacin del fluorforo en el DV se midi utilizando microscopa confocal. El papel de un
aminocido mutacin clave se verific utilizando parsito clones seleccionados con mutaciones
puntuales en pfmdr1 aminocido posicin de 1042. Igualdad de expresin de pfmdr1 fue
confirmada por Western blot.
resultados
Conclusin
Este estudio demuestra que Fluo-4 se puede utilizar para investigar pfmdr1 dinmica de
transporte en ambos parsitos sensibles a frmacos y resistentes a. Adems, la evidencia
directa de transporte alterado Fluo-4 en pfmdr1 est vinculado a una nica mutacin de
aminocidos en el bolsillo de unin al sustrato. Este sistema ofrece una gran herramienta para
investigar el papel del transporte sustrato por pfmdr1 y las mutaciones necesarias para apoyar
el transporte, lo que llevara a nuevas perspectivas para el desarrollo de nuevos frmacos
contra la malaria.
material complementario electrnico
Ir:
Fondo
Hay dos factores que se han propuesto para desempear un papel en la alteracin de
sensibilidad a los medicamentos especficos para medicamentos contra la malaria:
polimorfismos pfmdr1 y duplicaciones de genes pfmdr1. La resistencia se ha asociado con una
o ms variaciones en cinco posiciones de aminocidos en el transportador, con pfmdr1 de tipo
salvaje pfmdr1 que contiene los aminocidos N86, Y184, S1034, N1042, D1246. El aumento de
pfmdr1 nmero de copias se han vinculado a la mefloquina (MQ), lumefantrina (LF),
halofantrina (HF), la quinina (QN) y la artemisinina (AS) Resistencia [7-9], mientras que las
mutaciones de aminocidos pfmdr1 S1034C, N1042D, eran D1246Y encontrado para mejorar
la susceptibilidad del parsito a MQ, HF y AS, independiente del nmero de copias de genes [2,
10].
Pruebas adicionales para el transporte del frmaco alterada en de tipo salvaje frente a
mutante pfmdr1 se muestra a travs de la expresin de diferentes variantes pfmdr1 en oocitos
de Xenopus laevis. De tipo salvaje pfmdr1 transportado QN y la cloroquina (CQ), pero no HF,
mientras que el mutante pfmdr1 transportado HF pero no QN o CQ [11]. Adems, los residuos
184 altera la cintica de transporte independientes de la unin de drogas especificidad [12].
modelos computacionales de pfmdr1 describen un bolsillo de unin al sustrato, que incluye los
residuos de aminocidos 1034 y 1042 [4, 13]. La unin de varios medicamentos contra la
malaria se investig el uso de simulaciones de acoplamiento dentro del bolsillo de unin al
sustrato pfmdr1. Entre los frmacos probados, MQ era el nico candidato cuya capacidad de
formar un enlace de H con residuos de 1042 fue abolido por completo a travs de la
sustitucin N1042D [13].
Ir:
mtodos
Tres CQ-sensible (CQS) (3D7, D10, HB3) y tres CQ-resistente (CQR) (Dd2, FCR3, FCB) cepas de P.
falciparum, as como transfectadas de forma estable clones de P. falciparum, derivadas de las
lneas parentales GC03 y 3BA6, se utilizaron en este estudio. Las dos cepas GC03 y 3BA6 son la
progenie del cruce gentico HB3 Dd2 [15] y el puerto de la variante de pfmdr1 HB3 pero
difieren en su fenotipo y el genotipo PfCRT (Tabla 1). pfmdr1 mutantes derivados de GC03 y
3BA6 fueron producidos por Sidhu y colegas a travs de la sustitucin de genes pfmdr1 parcial
que sustituy el cido asprtico en la posicin 1042 con asparagina, dejando los residuos de
aminocidos en 1034 y 1246 sin cambios. Los clones resultantes fueron: SNDGC03 (S1034,
N1042, D1246 en un fondo gentico GC03), SND3BA6 (S1034, N1042, D1246 en un fondo
gentico 3BA6), as como el control de SDDGC03 recombinante y SDD3BA6 [10]. Todas las
cepas se cultivaron de forma continua, como se describe por Trager y Jensen [16], con
modificaciones. Brevemente, los parsitos se propagan a 5% de hematocrito en medio de
cultivo que contiene RPMI 1640 (Life Technologies, Burlington, ON, Canad) suplementado con
HEPES 25 mM, 2 mM L-glutamina, gentamicina (20 mg / ml) (Life Technologies, Burlington, ON,
Canad), 100 mM de hipoxantina (Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canad), 0,5% Albumax I (Life
Technologies, Burlington, ON, Canad). Los parsitos se mantuvieron a 37 C con una
atmsfera de 5% de CO2, 3% de O2 y 92% de N2. glbulos rojos A + se obtuvieron del Banco de
Sangre de un estado a otro (Memphis, TN, EE.UU.). frotis de sangre teidos con Giemsa se
prepararon diariamente para controlar el crecimiento del parsito. Para la sincronizacin, los
parsitos se trataron con 5% d-sorbitol (Bioshop Canad, Burlington, ON, Canad) durante 10
min a 37 C; sorbitol se retir y los parsitos se lavaron una vez antes de ponerlos de nuevo en
la cultura. Para obtener cultivos de parsitos altamente sncronos, se repiti el tratamiento de
sorbitol despus de 6-8 h.
tabla 1
tabla 1
La secuencia de longitud completa de la secuencia pfmdr1 y parcial de pfcrt fue verificada para
todas las cepas. cepas de parsitos se cultivaron a 5% de parasitemia y el ADN se extrajo
usando el kit de ADN QIAamp Blood Mini (Qiagen, Toronto, ON, Canad) de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. ADN se amplific en la superposicin de las fracciones de PCR
usando ADN polimerasa HotStarTaq (Qiagen, Toronto, ON, Canad). Para tener en cuenta el
contenido de nucletidos rica en AT en el genoma de P. falciparum, dNTPs (Invitrogen Canad,
Burlington, ON, Canad) se mezclaron a 75% a 25% y GC. Para la optimizacin de PCR, MgCl2 2
mM, 300 mM dNTPs y 300 nM primers se utilizaron para la reaccin. Para cada mezcla de
reaccin, se utiliz ADN genmico 20 ng. Las reacciones de PCR consistieron en una etapa de
activacin inicial de 94 C durante 3 min, seguido de 35 ciclos de 94 C durante 60 s, 49 a 61
C (ajustado para cada par de cebadores) durante 30 s, y 72 C durante 1 min. Los cebadores
usados para la secuenciacin de genes pfmdr1 se describen en [14]. Los cebadores utilizados
para la secuenciacin de la regin del gen pfcrt que contiene los principales sitios de mutacin
fueron: pfcrt_F: 5'-GGAGGTTCTTGTCTTGGTAAATG, pfcrt_R: 5'-
TGGTAGGTGGAATAGATTCTCTTATAAA. Las muestras fueron enviadas para la secuenciacin del
genoma de Quebec, Canad y analizados utilizando el software Bioedit [17].
expresin de protenas
Para determinar los niveles de protena pfmdr1, 20 g de protena de clulas enteras lisados se
cargaron en cada carril de un gel de acrilamida 8% que contiene SDS. Las protenas se
transfirieron a una membrana de PVDF, que despus se bloque O / N a 4 C con 5% de leche
(w / v) y 0,05% de Tween-20 (ACP Chemicals, St-Leonard, QC, Canad) en fosfato tamponada
de solucin salina (PBS). La membrana se incub con la dilucin adecuada de primaria anti-
pfmdr1 (amablemente proporcionado por el profesor Cowman, Walter y Eliza Hall Institute,
VIC, Australia) o anti-PfHSP70 (Genway Biotech, San Diego, CA, EE.UU.) anticuerpo (1: 2.000)
en PBS-T + 5% de leche durante 1 h (RT), despus se lav y se incub con HRP-conjugado anti-
IgG de conejo secundaria de anticuerpos (Abcam, Toronto, ON, Canad) (1: 20.000) durante 1
h (RT ). Las bandas inmunorreactivas se detectaron con ImmunStar WesternC
quimioluminiscente Kit (Bio-Rad Laboratories, Mississauga, ON, Canad) usando un myECL
Imager (Thermo Scientific, Burlington, ON, Canad). Para confirmar la igualdad de protenas de
carga, la intensidad de la quimioluminiscencia de los pfmdr1 se calcularon para cada clon
parsito con relacin a la respectiva quimioluminiscencia PfHSP70 usando ImageJ 1.47q
(Institutos Nacionales de Salud, EE.UU.).
Resultados y discusin
De los cinco sitios de mutacin en pfmdr1 sabe que juega un papel en la resistencia a los
medicamentos, las cepas de parsitos utilizados para estos experimentos contenan
mutaciones en las posiciones de aminocido 86, 184 y 1042, que se encuentran principalmente
en los aislados asiticos [7 africano y, 22-24 ]. Para determinar si las mutaciones en estos
residuos influyen en el transporte de Fluo-4 a travs de pfmdr1, la acumulacin de Fluo-4 en el
DV se midi en parsitos vivos utilizando microscopa confocal. Todas las cepas de parsitos,
excepto HB3, mostraron alta acumulacin de Fluo-4 en el DV (Figura 1a, b). Fluo-4
acumulacin en el DV fue impedida por pre-incubacin de los parsitos con tariquidar (TQ)
(Figura 1b), un inhibidor especfico de los transportadores de Pgp [25]. Es importante destacar
que, Fluo-4 acumulacin en el DV se demostr que era independiente de la mutacin PfCRT
K76T, lo que sugiere que la mutacin PfCRT solo no tiene ningn efecto Fluo-4 de acumulacin.
Figura 1
Figura 1
Fluo-4 de fluorescencia en los parsitos P. falciparum. Los parsitos se incubaron con 5 M Fluo-
4. unas imgenes representativas de los eritrocitos infectados por P. falciparum. La barra de
escala 5 micras. b Proporcin de media de fluorescencia Fluo-4 (DV / citosol) SEM. ...
El HB3 cepa del parsito, que no se acumula Fluo-4 en el DV, alberga dos polimorfismos de
Y184F y pfmdr1 N1042D-no se encuentra en las otras cepas de P. falciparum ensayadas (Tabla
1), lo que sugiere que uno de estos dos residuos es responsable de la alteracin del transporte
de Fluo-4 visto en los parsitos HB3. Previamente se ha demostrado para el homlogo humano
de pfmdr1 que la mutacin Y184F no influye en la especificidad de drogas [12]. Adems, este
residuo aument slo ligeramente la resistencia a frmacos en comparacin con otros sitios de
mutacin pfmdr1 [4]. Por el contrario, la posicin de aminocido 1042 se cree que es parte de
las interacciones de bolsillo y forma electrosttica con amodiaquina, CQ, MQ (slo en
presencia de asparagina), HF, vinblastina y vincristina [4, 10, 13] de unin a transportador. Por
lo tanto, el papel de las mutaciones pfmdr1 en la posicin 1042 se investig con ms detalle.
Figura 2
Figura 2
Como control, los clones parsito SDDGC03 y SDD3BA6, que alberga la misma mutacin que
GC03 y 3BA6, revel que la mutacin pfmdr1 N1042D no transport Fluo-4 en el DV (figura 2a,
b). transporte Fluo-4 solamente se estableci con la introduccin de asparagina en el residuo
1042 para ambos clones (SNDGC03 y SND3BA6). El transporte era independiente de la
mutacin PfCRT K76T, ya que el transporte de Fluo-4 se vea afectada por igual en GC03 y 3BA6
lneas parentales, as como los controles y SDDGC03 SDD3BA6, y slo se ve en los clones
SNDGC03 y SND3BA6 (Figura 2a, b). especificidad de transporte para pfmdr1 en los clones
SNDGC03 y SND3BA6 se confirm a travs de pre-incubacin de las muestras con el TQ
inhibidor de Pgp (Figura 2b; archivo adicional 1: Figura S1). Estos resultados indican un papel
fundamental para la asparagina en la pfmdr1 residuo 1042 en el transporte de Fluo-4,
independiente de PfCRT.
Adems de los polimorfismos pfmdr1, aumento del nmero de copias del gen pfmdr1 [8, 9, 26]
y los niveles de expresin de protenas tambin se ha sugerido que desempear un papel en la
resistencia a frmacos o la susceptibilidad. Para verificar que Fluo-4 acumulacin en el DV de
clones SNDGC03 y SND3BA6 no estaba vinculado a una mayor expresin pfmdr1, se analizaron
los niveles de protena pfmdr1 de estos clones parsito (Figura 2C). No se detect ningn
aumento significativo en la expresin pfmdr1 para el GC03 y 3BA6 lneas parentales o sus
clones que albergan la sustitucin D1042N (p> 0,05). Por lo tanto, Fluo-4 acumulacin en el DV
de estos clones se halla asociada con la mutacin en el residuo pfmdr1 1042.
Efecto del polimorfismo N1042D de sensibilidad a los medicamentos
Tabla 2
Tabla 2
competicin por el sustrato de medicamentos contra la malaria con Fluo-4 para determinar el
transporte de frmacos por pfmdr1
figura 3
figura 3
La competencia del transporte de Fluo-4 con medicamentos contra la malaria. una parsitos se
pre-incubaron con diferentes concentraciones de cloroquina (CQ), mefloquina (MQ) o quinina
(QN), o se deja sin tratar antes de la adicin de Fluo-4 a.m.. b Los parsitos se preincubaron ...
Figura 4
Figura 4
Ir:
Conclusin
Este estudio proporciona evidencia directa para el transporte de sustrato impulsado por
pfmdr1 reducido a travs de la mutacin de un solo aminocido N1042D, que se encuentra en
el bolsillo de unin al sustrato. La relevancia de esta mutacin de aminocidos puede haber
sido subestimado y necesita ms investigacin. Adems, ahora es posible probar mutaciones
adicionales dentro del bolsillo de unin de pfmdr1 para verificar su papel potencial en el
transporte de frmacos. En consecuencia, el uso de Fluo-4 en ensayos de competicin de
drogas proporciona una poderosa herramienta para examinar mejor la cintica de transporte
de frmacos a travs de pfmdr1. Esta informacin recin adquirida puede ayudar a dilucidar el
papel de pfmdr1 en el transporte de drogas, que se ha mantenido controvertido durante
dcadas. Por ejemplo, mientras que las investigaciones anteriores han sugerido una relacin
entre la resistencia MQ y asparagina en la posicin pfmdr1 aminocido 86 en aislados
procedentes de Tailandia y frica Occidental [30, 33], otros han asociado de tipo salvaje
pfmdr1 y el aumento de nmero de copias de genes con resistencia MQ [ 3, 34]. publicaciones
ms recientes han encontrado una fuerte evidencia de un papel para el N1042 en la resistencia
MQ en los aislados de Tailandia [35, 36], lo que sugiere que la importancia de esta mutacin se
ha subestimado en estudios de campo anteriores. La importancia de N1042 para la resistencia
MQ se demostr de manera similar in vitro a travs de sustituciones de aminocidos
combinados que generaron una cepa del parsito que alberga las mutaciones S1024C,
N1042D, D1246Y [2]. Esta cepa recin generado era aproximadamente tres veces ms
susceptibles a la exposicin MQ comparacin con la cepa parental [2]. Los resultados
presentados aqu apoyan el papel potencial de la pfmdr1 N1042 en la resistencia del parsito a
MQ. Ms investigaciones ayudarn a esclarecer el significado de este polimorfismo en el
transporte de sustrato.
Ir:
SJR y PR dise el estudio; SJR realiz experimentos y se cuantifica los datos; SJR y PR escribi
el manuscrito. Ambos autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.
Expresiones de gratitud
Este estudio fue apoyado en parte por becas del Servicio Alemn de Intercambio Acadmico
(DAAD) (SJR), la Beca Robert P. Harpur (SJR), el Centro de Interaccin parsito-anfitrin
(FRQNT) (SJR), y subvenciones del Natural Ciencias e Ingeniera de Investigacin (NSERC)
Descubrimiento Grant (PR) y la Fundacin Canadiense para la Innovacin (CFI) Lderes
Opportunity Fund (PR).
El cumplimiento de las normas ticas
la disposicin
Figura S1. La inhibicin del transporte de Fluo-4 a travs tariquidar. clones de Plasmodium
falciparum se pre-incubaron con 100 nM tariquidar durante 10 min a 37 C, a continuacin, se
aadi 5 M Fluo-4 a.m. para 50 min. Fluo-4 acumulacin en la vacuola digestivo fue
disminuida. Los experimentos se realizaron por triplicado en das diferentes. Estas imgenes
son suplementarios a los datos obtenidos para la Figura 2. La barra de escala, 5 micras.