TRABAJO FIN DE ESTUDIOS

Ttulo

Caracterizacin bioqumica y biotecnolgica de la

levadura "Saccharomyces cerevisiae" GL15

Autor/es

Miriam Gonzlez Lzaro

Director/es

Fernanda Ruiz Larrea y Mara Teresa Tena Vzquez de la Torre

Facultad

Facultad de Ciencias, Estudios Agroalimentarios e Informtica

Titulacin

Mster en Qumica Avanzada

Departamento

Curso Acadmico

2013-2014
 Caracterizacin bioqumica y biotecnolgica de la levadura "Saccharomyces
cerevisiae" GL15, trabajo fin de estudios
de Miriam Gonzlez Lzaro, dirigido por Fernanda Ruiz Larrea y Mara Teresa Tena
Vzquez de la Torre (publicado por la Universidad de La Rioja), se difunde bajo una
Licencia
Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 3.0 Unported.
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titulares del copyright.

El autor
Universidad de La Rioja, Servicio de Publicaciones, 2014
publicaciones.unirioja.es
E-mail: publicaciones@unirioja.es
2014

Miriam Gonzlez Lzaro

Master en Qumica Avanzada

Caracterizacin bioqumica y
biotecnolgica de la levadura
Saccharomyces
Saccharomyces cerevisiae
cerevisiae GL 15
FERNANDA RUIZ LARREA, Catedrtica del rea de Bioqumica y Biologa Molecular del
Departamento de Agricultura y Alimentacin de la Universidad de La Rioja.

MARA TERESA TENA VZQUEZ DE La TORRE, Catedrtica de Qumica Analtica de la

Universidad de La Rioja.

CERTIFICAN:

Que el presente trabajo de investigacin titulado CARACTERIZACIN BIOQUMICA Y

BIOTECNOLGICA DE LA LEVADURA Saccharomyces cerevisiae GL15 ha sido realizado en el
Departamento de Agricultura y Alimentacin junto con el departamento de Qumica Analtica
de la Universidad de La Rioja y en colaboracin con el el laboratorio del Dr. Claudio Voget del
CINDEFI (Universidad Nacional de La Plata -CONICET, Argentina), bajo nuestra direccin,
autorizando su presentacin para optar al ttulo de Mster en Qumica Avanzada.

Logroo, junio de 2014

Fdo.: Dra. Fernanda Ruiz Larrea Dra.: M. Teresa Tena Vzquez de la Torre

1
Antes de comenzar con la memoria quiero agradecer a todas las personas que con su ayuda y
apoyo han hecho que esto sea posible.

En primer lugar quiero agradecrselo a mis Directoras del Mster. A Fernanda, por todas las
oportunidades y conocimientos que me ha brindado a lo largo de todos estos aos. A Teresa
por su disposicin y su gran ayuda con la estadstica en esta memoria.

A toda la gente del CINDEFI. En especial al Doctor Tato Cavalitto que fue la primera cara amiga
que vi al llegar a Argentina, me ayud en todo lo posible y hasta me prest su SUBE. Al Doctor
Claudio Voget, quien me acept en su grupo de trabajo y me abri las puertas de su casa,
gracias tambin por todos los mails tras la vuelta. A toda la gente linda del laboratorio 1 y
vecinos, no slo por su paciencia y ayuda en el laboratorio sino tambin por los ratos de mates
en el box, las cervezas en Antares y los planes que cada uno de ellos hizo conmigo para hacer
mi estancia en Argentina inolvidable.

A mis compaeros y amigos del 229 y 228. A toda la gente con la que he coincidido en ellos en
los casi cuatro aos que he estado colaborando, ya sea porque estaban haciendo sus tesis o
porque venan de estancia. Y sobre todo a los que casi viven en ellos actualmente, Paula,
Carmencita, Sara, Andrea, Dani, Enrique y Filipe. Por los cafs, los ratos de desesperacin
compartida, las conversaciones de laboratorio pero sobre todo por haberos convertido en
amigos y por los ratos que pasamos juntos fuera del laboratorio. Y mencin especial a Roco,
quien me ense y lleva aguantndome desde el principio y con quien he padecido las
maravillas del HPLC.

A mis amigos de la Universidad, con quien he compartido grandes momentos y sin los que esto
no hubiese sido igual. Adems, ellos comprenden mejor que nadie lo bonita y horrible que
puede ser la investigacin.

A mis amigas y amigos por estar ah siempre dispuestos a celebrar cuando las cosas iban bien y
para animarme cuando no lo van tanto.

A mis hermanas y sobrinas por apoyarme siempre, por preguntarme qu tal aunque no
tuviesen ni idea de que les estaba hablando. A mi padre, que sabe mejor que nadie los malos y
buenos ratos que he pasado. Pero que sobre todo, ha tenido que sufrir y aguantar con
paciencia los malos.

Y por ltimo quiero agradecer al proyecto PGYSYS EXCHANGE del FP7-People de la UE por
concederme la beca Marie Curie International Research Staff Exchange Scheme (IRSES) que
me ha permitido realizar parte de la investigacin que presento en esta memoria en Argentina.

2
ABREVIATURAS

GL Genovesa levadura

Km Kilmetro

SO Suroeste

NO Noroeste

Km2 Kilmetro cuadrado

ha hectrea

kg kilogramo

mg miligramo

l litro

h horas

min minutos

seg segundos

DNA cido desoxirribonucleico

rDNA cido desoxirribonucleico ribosomal

OPA Ortofalaldehdo

PITC Fenilisotiocianato

FMOC-Cl 9-Fluorenilmetil cloroformato

HPLC Cromatografa lquida de alta eficacia

DEEMM Dietil etoximetilnmalonato

HILIC Cromatografa de interaccin hidroflica

ESI MS Espectrometra de masas con ionizacin mediante electronebulizacin

YPD Yeast Peptone Dextrose

YM Medio de mantenimiento, es igual que el MYGP

MYGP Malt Yeast Glucose Peptone

GPY Glucose Peptone Yeast

DO Densidad ptica

3
 micras

C grados centgrados

r.p.m revoluciones por minuto

PCR Reaccin en Cadena de la Polimerasa

S-N Somogyi- Nelson

GOD glucosa oxidasa

POD peroxidasa

4-AF 4-aminofenazona

m micrmetro

nm nanmetro

ANOVA Anlisis de la varianza

u.a/h unidades arbitrarias por hora

pb pares de bases

GABA cido gamma-aminobutrico

Glu cido glutmico

Gln glutamina

Arg arginina

DAD Detector de fila de diodos

LOD Lmite de deteccin

LOQ Lmite de cuantificacin

4
ndice
RESUMEN ...................................................................................................................................... 7
I. INTRODUCCIN .................................................................................................................... 8
OBJETIVOS ................................................................................................................................... 16
II. MATERIALES Y MTODOS................................................................................................... 17
II.1 MICROORGANISMOS Y CONDICIONES DE CULTIVO........................................................ 18
II.1.1 Conservacin de la cepa GL15.................................................................................... 18
II.1.2 Medios de cultivo ....................................................................................................... 18
II.2 PRUEBAS DE IDENTIFICACIN MICROBIOLGICA. ............................................................ 23
II.3 CARACTERIZACIN DE LA LEVADURA MEDIANTE ANLISIS DE BIOLOGA MOLECULAR. . 24
II.3.1 Extraccin de DNA de la levadura .............................................................................. 24
II.3.2 Cuantificacin del DNA............................................................................................... 24
II.3.3 Anlisis por PCR .......................................................................................................... 24
II.3.4 Electroforesis en gel de agarosa ................................................................................ 25
II.3.5 Secuenciacin ............................................................................................................. 26
II.4 CARACTERIZACIN BIOQUMICA DE LA LEVADURA GL15 ................................................ 26
II.4.1 Requerimientos nutricionales .................................................................................... 26
II.4.2 Estudio comparativo frente a distintas fuentes de N ................................................ 27
II.4.3 Comportamiento fermentativo(15) y crecimiento anaerbico .................................... 28
II.4.4 Determinacin de azcares reductores ..................................................................... 29
II.4.5 Metabolismo nitrogenado de la levadura GL 15 ........................................................ 30
II.5 REACTIVOS QUMICOS ...................................................................................................... 32
II.6 SENSIBILIDAD Y PRECISIN DEL MTODO......................................................................... 32
II.7 TRATAMIENTO ESTADSTICO ............................................................................................. 33
III. RESULTADOS Y DISCUSIN............................................................................................. 34
III.1 IDENTIFICACIN TAXONMICA DE LA LEVADURA GL15 ................................................. 35
III.2 CARACTERIZACIN BIOQUMICA Y FERMENTATIVA ........................................................ 37
III.2.1 Estudio de la fermentacin de azcares. .................................................................. 37
III.2.2 Requerimiento nutricional de la levadura................................................................. 39
III.2.3 Estudio comparativo frente a distintas fuentes de nitrgeno .................................. 41
III.2.4 Estudio cintico del crecimiento aerbico ................................................................ 42
III.2.5 Estudio de crecimiento anaerbico. ......................................................................... 43
III.3 CARACTERIZACIN DE LA LEVADURA MEDIANTE ANLISIS DE BIOLOGA MOLECULAR. 44
III.4 SENSIBILIDAD Y PRECISIN DEL MTODO........................................................................ 45

5
 III.5 ANLISIS QUMICO POR HPLC DEL METABOLISMO NITROGENADO ............................... 46
IV. CONCLUSIONES ............................................................................................................... 57
BIBLIOGRAFA .......................................................................................................................... 59

6
CARACTERIZACIN BIOQUMICA Y BIOTECNOLGICA DE LA LEVADURA
Saccharomyces cerevisiae GL15

RESUMEN
En este trabajo se ha realizado el estudio bioqumico de la levadura GL 15 y el anlisis de su
metabolismo nitrogenado. Esta cepa fue aislada en la etapa de fermentacin del zumo de
ciruelas de la variedad Genovesa, las cuales se emplean en la elaboracin de una tpica bebida
fermentada argentina de ciruela, denominada en aquella zona como vino de ciruela. La
identificacin taxonmica demostr que se trataba de la especie Saccharomyces cerevisiae, y
su caracterizacin biotecnolgica mostr su alta tolerancia a fuertes condiciones de estrs,
tales como pHs cidos y temperaturas de 30-35C.

Se realiz asimismo un estudio del metabolismo nitrogenado de esta cepa mediante

derivatizacin y posterior cromatografa HPLC de fase reversa y se realiz el anlisis
cuantitativo de la produccin de aminocidos por esta levadura.

ABSTRAC

In this work the biochemical study of the yeast GL15 and the analysis of its nitrogen
metabolism were performed. This strain was isolated from Genovese variety plum juice
fermentations, which produce an Argentinian typical beverage named "plum wine".
Taxonomical identification revealed that it was Saccharomyces cerevisiae species, and its
biotechnological characterization showed high tolerance to stress conditions, such as acid pH
and 30-35 C temperatures. The study of its nitrogen metabolism was also performed by
derivatization and subsequent reverse phase h.p.lc., and the quantitative analysis of GL15
strain amino acid production was carried out.

7
I. INTRODUCCIN

8
El cultivo del ciruelo en Berisso

Argentina es el primer productor de ciruela del Hemisferio Sur. Las variedades de ciruela
cultivadas se dividen en subespecies vulgarmente conocidas como japonesas y europeas. Estas
ltimas son las de mayor importancia para la industria del secado en Argentina, e.j. la variedad
Agen (DAgen o French Prune)(1).

El partido de Berisso se ubica en el noreste de la Provincia de Buenos Aires a 60 Km de la

Capital Federal, al sur del conglomerado bonaerense, formando parte del denominado Gran La
Plata, ciudad de cuyo centro dista aproximadamente 10 Km. Al norte limita con el Ro de La
Plata, al SO con el partido de La Plata y por el NO con el de Ensenada, del que se encuentra
separado por el puerto de la Plata (Fig. I.1). Su superficie alcanza los 137 km2 y su poblacin es
de aproximadamente 90.000 habitantes (Censo 2010). La superficie total agropecuaria es de
unas 2590 ha, de las cuales estn cultivadas 2091 ha. Los sistemas de produccin combinan
diferentes tipos de actividades, horticultura, fruticultura, forestacin y ganadera vacuna (2). En
la produccin frutcola predomina la uva Isabella, con la cual se elabora el vino de la Costa (3) y
en segundo nivel diferentes variedades de ciruela de la subespecie japonesa (Prunus salicina
L.) que se cosechan entre finales de noviembre y mediados de febrero (4) (Fig. I.2). Dichas
variedades son: Cristal, Remolacha, Genovesa, Abundancia (tpica de la isla Paulino), Gmez, y
en menor escala Santa Rosa. El rea de produccin total abarca de 10 a 15 ha, con una
densidad promedio de 400 a 500 plantas por ha y una produccin anual de 8.000 a 10.000 kg
ciruela fresca/ha.

Berisso

9
 B

Figura I.1: Localizacin del partido de Berisso. A) Respecto a la Capital Federal (Buenos Aires), B) Respecto
de La Plata, C) En verde las zonas de cultivos

Figura I.2:
I Ciruelos en Berisso (variedad Genovesa fines de diciembre)

10
 Caractersticas de la variedad Genovesa

La variedad Genovesa se cosecha entre el 20 y el 25 de diciembre. Tiene un contenido

medio en azcares de 11.5 grados Brix. Generalmente para vinificar la fruta se deja
sobremadurar. En la Tabla I.1 se muestran datos tpicos de esta variedad de ciruela. La pulpa
representa alrededor del 90% del peso total del fruto, con un contenido de materia seca entre
11 y 14%. Los azcares principales son glucosa y fructosa en relacin 2:1, los cuales junto a la
sacarosa representan el 70 % de la materia seca. Tambin contiene sorbitol (4%) caracterstico
de las frutas pertenecientes a la familia de las Rosceas(5). Esta variedad es una de las ms
cidas ( 18% contenido de cido en masa seca) siendo el principal cido el mlico (pKs, 3.45 y
5.09). La composicin tpica del zumo es la siguiente: azcares fermentables: 7-9 %, acidez
total 2.0-2.2% (pH 2.9-3.0), sorbitol 0.6 % y N-amino 400 mg/l. Todos estos datos fueron
aportados por el laboratorio del Doctor Claudio Voget.

Tabla I.1: Caractersticas de la ciruela (Prunus salicina L.) variedad Genovesa cultivada en
Berisso.

% peso fresco

Variedad Cosecha Peso fruto (g) Piel pulpa hueso

Genovesa 20 -25 Dic 33-49 4.0 91.5 3.5

Tabla I.2: Composicin de la ciruela Genovesa. aprincipalmente cido mlico, bazcares

reductores antes y despus de la inversin (OIV-MA-AS311-01) entre parntesis mtodo
enzimtico (Enzytec, r-Biopharm), cglucosa, fructosa, sacarosa, dexpresada como cido
galacturnico anhidro entre parntesis grado de metoxilacin.

Composicin % peso seco de la pulpa

Materia Azcares reductores b Protena

Glu/Fru/ Pectina
seca pH Acidez Fibra N-
a Sorbitol Cenizas
pulpa Sin Tras total (N x amino
Sacc (GM) d
% inversin inversin 6.25)

63.1 67.6 61/31/8 4.7 1.75

11-14 2.9 18 5.2 3.9 0.26 3.2
(60.0) (65.5) (72)

La elaboracin del vino de ciruela

Una parte de la produccin de ciruelas en Berisso se destina para venta en fresco, y el resto
se utiliza para elaborar el vino de ciruela, la mayor parte del cual es actualmente elaborado
en la Cooperativa de la Costa de Berisso con las variedades Remolacha, Genovesa, y en menor
medida Cristal. Con una produccin mxima de 10000-15000 litros al ao.

Por razones legales la bebida se vende con el nombre de fantasa Casero de ciruela. La
elaboracin del vino de ciruela emplea una tecnologa de bajos insumos, adaptada a la

11
estructura de una bodega con limitada infraestructura y equipamiento, que representa el
proceso artesanal que utilizaban y utilizan actualmente los productores individuales en sus
quintas. Es un proceso que se asemeja a la fermentacin del vino tinto, aunque con ciertas
diferencias. Un esquema de esta elaboracin se muestra en la Figura I.3. En una primera etapa
la fruta se deshace mediante un molino de rodillos, colocndola con el hueso incluido en
tanques de fibrocemento epoxilado. Durante la carga del tanque se adiciona metabisulfito de
potasio, ( 100-120 mg/l que es equivalente a 50-60 mg/l de SO2) como antioxidante y
antimicrobiano. La fruta molida se deja 2 o 3 das para que las enzimas endgenas maceren el
tejido vegetal y faciliten la extraccin posterior del jugo. Adems as se mejora la extraccin de
componentes funcionales de la fruta como pigmentos, vitaminas, polifenoles, etc. No se
adicionan levaduras comerciales ni se agregan nutrientes.

La temperatura tpica es 29-31 C y el pH 3.0-3.2. Junto con la maceracin comienza la

fermentacin espontnea que se evidencia por la produccin de CO2 y etanol. El consumo de
azcares es del 60-70 % y el nivel de alcohol alcanzado se encuentra en el orden del 2.5-3.0 %.

Tras la maceracin/fermentacin inicial se procede al descube, la mezcla se escurre y se

prensa manualmente, con cuidado de no romper el hueso, llevando el lquido resultante
mediante bombas a tanques de acero inoxidable. El rendimiento del lquido extrado es del
orden del 55-60 %. En el tanque se incorpora azcar de caa para aumentar el nivel de alcohol
a 11-12 %. En los tanques se completa la fermentacin alcohlica y la bebida se va clarificando
por sedimentacin natural. La temperatura durante la fase ms activa de la fermentacin
puede llegar a 32-35 C. La fermentacin se hace muy lenta cuando el nivel de etanol es 10-11
%.

Los sedimentos (las) se eliminan una o dos veces bombeando el vino de un tanque a otro,
operacin que se denomina trasiego. Al bajar la temperatura ambiental promedio en mayo-
julio se facilita la clarificacin. Los tanques se mantienen completamente llenos para evitar el
deterioro por parte del oxgeno y finalmente el vino se envasa corrigiendo si es necesario el
nivel de SO2.

En la mayora de los casos el vino de ciruela se endulza ya que, como se mencion

anteriormente, esta variedad es muy cida. El agregado de azcar se suele realizar antes de
embotellar, pero tambin se puede agregar despus del descube y antes del primer trasiego.
La cantidad de sacarosa aportada adicionalmente en total (para aumentar el nivel de alcohol y
endulzar) vara entre 20 y 25 %.

El procesado dura 6 meses ya que el vino de ciruela comienza a venderse en julio cuando
se realiza la Fiesta del vino de la Costa en la localidad de Berisso. Al igual que la mayora de los
vinos de fruta, el vino de ciruela no se aeja en barriles y si es posible se vende dentro del
ao de elaborado. Los niveles de alcohol varan entre 11-12% despus de los 6 meses
transcurridos desde que se comienza la vinificacin y pueden llegar hasta el 14% despus del
ao ya que al no pasteurizarse, las levaduras remanentes fermentan el azcar lentamente. En
la Tabla I.2 se dan datos de la composicin del vino de ciruela elaborado principalmente con
la variedad Genovesa por la Cooperativa de la Costa de Berisso en los ltimos tres aos.
Algunas caractersticas de estos vinos son: alta acidez, alto contenido de azcar (para

12
equilibrar sensorialmente al vino), presencia de cantidades significativas de polioles, en
particular sorbitol (que proviene de la fruta) y glicerol que es un producto de la fermentacin.

Tabla I.3: Composicin del vino de ciruela variedad Genovesa

Rango de
Observaciones
valores

pH 3.2-3.3

Acidez total (g mlico/l) 15

Acidez voltil (g actico/l) 0,5-1,1

SO2 total (mg/l) mximo 75

Si bien se adiciona sacarosa, el medio cido y la actividad

invertasa de la levadura transforman el azcar en glucosa y
Azcares reductores (g/l) Hasta 130
fructosa. Los azucares reductores antes y despus de la
inversin dan valores similares a los 6 meses de elaboracin

El valor de 14,5 se observa despus de un ao o ms de

Etanol (% vol/vol.) 9,0-14,5
elaborado el vino de ciruela dulce

Metanol (mg/l) 160-400

Sorbitol (g/l) 3,0-6,0

Glicerol (g/l) 4-8

Suma de poliles (sorbitol

7.0-14.0
+ glicerol)

Las levaduras en la fermentacin

El vino de ciruela se obtiene de la fermentacin espontnea que llevan a cabo las

levaduras naturales presentes en la piel de la fruta. El aislamiento, identificacin y
caracterizacin de estas levaduras es un trabajo clave en la comprensin del proceso de
vinificacin. En trabajos previos del grupo de investigacin del Dr. Claudio Voget del Centro de
Investigacin de Fermentaciones Industriales (CINDEFI, Universidad Nacional de La Plata -
CONICET, Argentina) sobre la microbiologa de estas fermentaciones se haban recogido
muestras de distintas quintas y en diferentes aos, tanto en bodega como en
microvinificaciones de laboratorio (en las que la ciruela no entra en contacto con los equipos
de la bodega). Las fermentaciones se realizaban de manera espontnea con la microbiota
endgena. Para aislar las levaduras se haba empleado el medio WL y en una primera seleccin
se tuvieron en cuenta las caractersticas de la colonia, color, forma, tamao, y pruebas

13
bioqumicas segn n el crecimiento en agar lisina(6). Las levaduras se aislaron de muestras
tomadas en distintas etapas del proceso: jugo (despus
( de la molienda), final de maceracin
(despus del prensado), fermentacin activa (3-6
( das despus del prensado) y del agregado de
azcar y primer trasiego (30 das
d despus del prensado). Del jugo y prensado se aislaron varias
especies de levaduras no-Saccharomyces
Saccharomyces,, pero a partir de la fermentacin activa y el trasiego
se observ prcticamente un solo tipo de colonia muy caracterstica al cabo de 48-72 h de
crecimiento en WL a 30C (colonias cncava (7) de levaduras
colonias de color verde claro, borde liso y cncavas)
que no crecen en agar lisina. Estas caractersticas junto al patrn de bandas obtenidos
mediante la tcnica RFLP 5.8S-ITS1-ITS2(8), sugeran que se trataba de una levadura
Saccharomyces cereviseae pero sin confirmacin taxonmica. Esta cepa era tolerante a las
condiciones de vinificacin,, la cual incluye niveles de alcohol de 10-11%,
11%, temperaturas de
hasta 30-35C, pH 3.1-3.2
3.2 y concentraciones de SO2 de hasta 50 mg/l.

Figura I.3
.3 Esquema de la elaboracin del vino de ciruela (Berisso. Provincia
cia de Buenos Aires).
Aires)

14
 Aminocidos y aminas bigenas.

Los aminocidos son un factor esencial de crecimiento para las levaduras y bacterias en las
fermentaciones alcohlica y malolctica. Las aminas bigenas(9) son compuestos nitrogenados
de bajo peso molecular que se forman por la descarboxilacin de los aminocidos por la accin
de las levaduras en la fermentacin alcohlica y de las bacterias lcticas durante la
fermentacin malolctica. Las aminas bigenas se pueden presentar por tanto en alimentos
que sufren alguna fermentacin en su procesado como puede ser el queso, el vino o el
fermentado alcohlico de ciruela que se prepara en la costa de Berisso.

Las aminas bigenas pueden encontrarse de manera natural en animales y plantas pero hay
algunas como la histamina que puede tener un efecto perjudicial en la salud, causando
nauseas o dolores de cabeza(10).

Por estos motivos y para poder diferenciar uvas y vinos segn su contenido en aminocidos
es interesante desarrollar un mtodo de anlisis rpido y eficaz para la determinacin de
aminocidos y aminas bigenas. Las tcnicas ms empleadas hasta ahora para la
determinacin de estos compuestos han sido el HPLC, la electroforesis capilar y la
cromatografa de gases. Las estructuras diferentes de aminocidos y aminas han generado
hasta la fecha dificultades para desarrollar un mtodo especfico para su eficaz determinacin.
No todos presentan un cromforo en su estructura, lo que hace necesaria una reaccin de
derivatizacin pre o post columna para poder analizarlos. El mtodo de Gmez-Alonso(11) que
seguimos emplea una derivatizacin pre columna que presenta como desventaja que una gran
parte de la molcula de los compuestos derivatizados es idntica (la que proviene del reactivo
de derivatizacin) lo que podra suponer una separacin ms difcil. Sin embargo, con una
columna en fase reversa la separacin es rpida y eficaz. En la tcnica empleada el agente
derivatizante es DEEMM (Dietil etoximetilenmalonato) en bibliografa se ha descrito el uso de
otros como son: ortofalaldehdo (OPA), fenilisotiocianato (PITC), 9-Fluorenilmetil cloroformato
(FMOC-Cl) y cloruros de dansilo y dabsilo.

En cromatografa se pueden emplear distintos tipos de columna para la separacin de estos

compuestos, desde una columna de fase reversa hasta una de intercambio inico.
Actualmente estn desarrollndose mtodos cromatogrficos de interaccin hidroflica (HILIC),
un nuevo enfoque para separar y determinar los aminocidos sin necesidad de derivatizacin
previa. Esta modalidad cromatogrfica puede acoplarse en lnea a un detector de
espectrometra de masas con ionizacin mediante electronebulizacin(ESI - MS)(12). La alta
polaridad de estos compuestos hace que la HILIC sea una tcnica adecuada ya que se forman
fuertes interacciones entre los compuestos polares y la fase polar hidroflica estacionaria (13),
(14)
.

15
 OBJETIVOS

Los objetivos de este trabajo han sido:

- Realizar la identificacin taxonmica de la levadura GL15 aislada de la fermentacin

espontnea del zumo de ciruela Genovesa para la fabricacin del denominado "vino de
ciruela", bebida tpica argentina.

-Realizar la caracterizacin bioqumica y biotecnolgica de esta levadura, prestando

especial atencin a su capacidad fermentativa y a los requerimientos para la obtencin de
biomasa.

- Estudiar el metabolismo nitrogenado de esta levadura, empleando para ello tcnicas de la

qumica analtica, incluyendo derivatizacin y cromatografa lquida de fase reversa, para
realizar el anlisis cuantitativo de la produccin de aminocidos por esta levadura.

16
II. MATERIALES Y MTODOS.

17
 Como ya se ha mencionado anteriormente, la levadura GL 15 fue aislada en la etapa de
fermentacin despus del macerado y prensado de ciruelas de la variedad Genovesa, y el
estudio de estas fermentaciones se inici en el laboratorio del Dr. Claudio Voget del CINDEFI
(Universidad Nacional de La Plata -CONICET, Argentina). Para analizar si la levadura encargada
de la fermentacin era una sola o variaba segn la etapa y si verdaderamente era una levadura
endgena y no estaba presente en la bodega debido a alguna elaboracin anterior, se haban
realizado microfermentaciones en laboratorio.

A partir de todas las muestras, se realizaba un aislamiento de las levaduras en placas de

medio WL y tras su purificacin en medio agar GPY (15) se almacenaban en tubos con medio de
mantenimiento. Aparentemente los aislados correspondan a un nica cepa, la que
denominaron GL 15, y que se eligi para su identificacin taxonmica y posterior
caracterizacin. Este estudio taxonmico y de caracterizacin gentica y bioqumica de la
levadura es el que se llev a cabo en este Trabajo Fin de Mster. Esta tarea se realiz durante 6
meses de estancia en los laboratorios del CINDEFI bajo la supervisin del Dr. Claudio Voget,
gracias a la ayuda de una beca de movilidad Marie Curie (PGSYS Exchange Project), as como
en los laboratorios de la Universidad de La Rioja bajo la direccin de las profesoras Dra. Mara
Teresa Tena Vzquez de la Torre y Dra. Fernanda Ruiz Larrea.

II.1 MICROORGANISMOS Y CONDICIONES DE CULTIVO

Adems de la levadura GL 15, se emple como cepa de referencia para los estudios
genmicos una levadura comercial de la especie Saccharomyces cerevisiae (Laffort Actiflore
B0213, Argentina).

II.1.1 Conservacin de la cepa GL15

Para su conservacin, la cepa GL 15 se replic a un tubo con tapa con medio de
mantenimiento MYGP en pico de flauta para su conservacin a 5C (no ms de un ao) y en
paralelo a un erlenmeyer de 250 ml con 50 ml de medio liquido GPY. Tras 24 h de cultivo, el
medio lquido se centrifug en tubos estriles (5000 g x 15 min) y el pellet, despus de un
lavado con agua destilada estril, se resuspendi con 2.5 ml de glicerol al 10%. La suspensin
se distribuy en crioviales y se congel a -80 C.

II.1.2 Medios de cultivo

Para los estudios planteados en este trabajo se tomaron como referencia los medios de
cultivo descritos por Kurtzman et al, 2011 (15) que se detallan a continuacin en las siguientes
tablas.

18
 Tabla II.1: Medio WL (Wallerstein Laboratory).

Componente Cantidad

Fosfato dihidrgeno potsico (KH2PO4) 0.55 g

Extracto de levadura 4g

Glucosa 50 g

Peptona 5g

Agar 12 g

Cloruro potsico (KCl) 0.425 g

Cloruro clcico ( CaCl2) 0.125 g

Sulfato de Magnesio (MgSO4) 0.125 g

Cloruro frrico ( FeCl3) 0.0025 g

Sulfito de Manganeso (MnSO4) 0.0025 g

Verde de Bromocresol 0.022 g

Agua Hasta 1000ml

pH 55

Nota: Hay que agregar 4 mg/l de cicloheximida al agar para preparar agar diferencial. Para inhibir el crecimiento
bacteriano se pueden poner 100 mg/l de cloranfenicol.

Tabla II.2: Medio GPY.

Componente Cantidad

Glucosa 40 g/l

Extracto de levadura 5 g/l

BactoPeptona 5 g/l

Agar 20 g/l

El medio GPY se ajust a pH 5.5. Tambin se utiliz lquido, en ese caso no se agreg agar.

19
 Tabla II.3: Medio YPD.

Componente Cantidad

Glucosa 20 g/l

Extracto de levadura 10 g/l

Peptona 20 g/l

Agar 20 g/l

Nota: Se pueden adicionar inhibidores para el crecimiento de otros microorganismos: 50 g/ml penicilina (Sigma-
Aldrich Chemie), 100 g/ml de estreptomicina (Sigma-Aldrich Chemie).

Tabla II.4: Medio MYGP (medio de mantenimiento, YM).

Componente Cantidad

Extracto de malta 3 g/l

Extracto de levadura 3 g/l

Glucosa 10 g/l

BactoPeptona 5 g/l

Agar 20 g/l

El medio se ajusta a pH 5.5

Tabla II.5: Medio sinttico.

Fuente de C y N

Glucosa 5.0 g/l

Urea 0.5 g/l

Sales mayores

KH2PO4 2.0 g/l

K2HPO4 0.15 g/l

MgSO4. 7 H2O 0.075 g/l

CaCl2. 2 H2O 0.01 g/l

20
 Otras sales

cido ctrico 50 mg/l

FeSO4.7 H2O 15 mg/l

ZnSO4.7 H2O 5 mg/l

MnSO4.H2O 3 mg/l

CuSO4.5 H2O 0.5 mg/l

CoCl2.6 H2O 0.1 mg/l

BO3H3 0.1 mg/l

KI 0.1 mg/l

Na2MoO4.H2O 0.65 mg/l

Vitaminas

Inositol 60 mg/l

Pantotenato de calcio 4 mg/l

Niacina 12 mg/l

Piridoxina 1 mg/l

Tiamina-ClH 1 mg/l

cido flico 2 mg/l

p-aminobenzoico 1 mg/l

Riboflavina 1 mg/l

Biotina 0.06 mg/l

Para la optimizacin del medio sinttico se tom como referencia el trabajo de Inchaurrondo
et al, 1998 (16).

Preparacin del medio sinttico

Vitaminas: se preparan stock concentrados 1000 X con excepcin de la riboflavina que es

poco soluble. Se esterilizan por filtracin utilizando un microfiltro de 0,22 y conservan a -20
C. La biotina es autoclavable. Se agregan en proporcin 1:1000 despus de autoclavar el resto
del medio.

Otras sales: se preparan dos stocks concentrados 1000 X. En el stock I se disuelve el cido
ctrico y luego se agregan las sales de Fe, Zn, Mn, Cu y Co. En el stock II se disuelve el cido

21
brico y las sales de K y Mo. Se autoclavan y se guardan en frascos de color topacio a
temperatura ambiente. Se agregan en proporcin 1:1000.

Urea: Se prepara un stock de 200 g/l que se esteriliza por filtracin ya que la urea se
descompone por calor. Se prefiltra por papel Whatman de 0.45 m.

La glucosa y fosfatos se esterilizan por separado del resto de medio. El pH del medio
reconstitudo debe ser 5.5.

Tabla II.6: Medio diseado para el estudio del crecimiento anaerbico.

Componente Cantidad

Glucosa 220 g/l

cido Mlico (pH=3) 12 g/l

BactoPeptona 4 - 8 g/l

KH2PO4 2.0 g/l

K2HPO4 0.15 g/l

MgSO4. 7 H2O 0.075 g/l

CaCl2. 2 H2O 0.01 g/l

Se ponen las mismas sales y vitaminas que se han detallado en la Tabla II.5 y en igual
cantidad (1:1000).

El preparado de los medios se realiza en tubos de rosca, y se van a rellenar con un volumen
de 10 ml por tubo.

Medio para fermentacin de azcares. Medio complejo (Wickerman).

Para el test de fermentacin de azcares se emplea la tcnica de la campana de Durham.

La composicin del medio base de fermentacin fue:

o 0.45% extracto de levadura

o 0.75% bactopeptona
o Azul de bromotimol hasta que el medio quede de color verde intenso

Preparacin del medio

Disolver el extracto de levadura y la bactopeptona en agua destilada y agregar el azul de

bromotimol. El pH se ajust a 5.25. Distribuir 2 ml del medio en tubos de 150 x 12 mm con
tapa, colocar una campana de Durham por tubo y autoclavar. El aire de la campana es
expulsado durante el calentamiento por lo que la campana debe quedar llena del medio de
cultivo una vez que los tubos se han autoclavado y enfriado.

22
 Los azcares de esterilizan por filtracin y se aaden en condiciones de esterilidad al medio
ya autoclavado. Una vez inoculados los tubos con 0.1 ml de cultivo, se incuban a 25-30 C
durante 3 semanas y se observa peridicamente la formacin de gas y el color del medio. Un
viraje de color al amarillo indica acidificacin mientras que al azul implica alcalinizacin.
Cuando hay fermentacin del azcar el medio acidifica. Es conveniente reconstituir los medios
y dejarlos al menos 2 das para verificar que no hay contaminacin. Adems de la observacin
visual se puede determinar el consumo de azcar y medir el crecimiento por turbidez. Como
control se emplea un tubo sin azcar. Los azcares que se emplearon para el ensayo fueron: D-
glucosa, sacarosa, maltosa, lactosa, D-galactosa, -trehalosa y rafinosa.

II.2 PRUEBAS DE IDENTIFICACIN MICROBIOLGICA.

Se realiz la suspensin de la cepa GL15 en agua destilada estril para la observacin y
caracterizacin morfolgica de la levadura mediante microscopa ptica.

Tincin de Gram

Se emple la tincin diferencial de gram, la cual en el caso de la observacin de levaduras

se utiliza para poder referirse a la morfologa celular e identificar la presencia de posibles
contaminaciones con otros microorganismos.

Para su realizacin se parte del frotis preparado y fijado de la cepa y se siguen los siguientes
pasos:

1. Cubrir con cristal violeta y mantener durante 1 minuto.

2. Lavar con agua del grifo.
3. Cubrir con lugol y mantener 30 segundos.
4. Lavar con agua.
5. Decolorar con etanol- acetona.
6. Lavar con agua.
7. Cubrir con un solucin 1% de safranina y mantener 1 minuto.
8. Lavar con agua, secar al aire y observar al microscopio con aceite de inmersin y el
objetivo 100X.

Tincin con eritrosina(17)

Para realizar un recuento de levaduras totales frente a levaduras vivas en las muestras
obtenidas tras el cultivo en el medio sinttico (Tabla II.5) se decidi realizar un recuento con
tincin de eritrosina.

Se prepara un stock de eritrosina (0.01 g/ml, Eritrosina B. Panreac Qumica, Espaa) y se

almacena a 4C para su conservacin.

Se prepara una solucin tampn de Na2HPO4 (0.2 M) y NaH2PO4 (0.2 M).

23
 Se diluye 1 ml de la disolucin stock de eritrosina en 50 ml de la disolucin tampn. Se
aade 1 ml de la solucin de trabajo obtenida a 1 ml de muestra. Se mezcla bien la suspensin
y se toman 10 l para los recuentos en la cmara de Neubauer.

Las clulas vivas se observarn transparentes mientras que las muertas quedarn teidas
de un color rosa suave.

II.3 CARACTERIZACIN DE LA LEVADURA MEDIANTE ANLISIS DE

BIOLOGA MOLECULAR.

II.3.1 Extraccin de DNA de la levadura

Para la extraccin de DNA se sigui el protocolo habitual de extraccin de DNA bacteriano
empleando la resina comercial InstaGene Matrix (BioRad). Se trata de una matriz que al agitar
vigorosamente provoca la lisis mecnica de las clulas y a su vez absorbe los productos de la
lisis celular que interfieren en la reaccin de PCR, facilitando la preparacin del DNA vlido
para la amplificacin.

En un eppendorf estril se resuspende el inculo de la levadura en 800 l de solucin salina

(NaCl 0.9%). El inculo se toma con un asa de siembra de un cultivo fresco en el medio YPD
donde habamos crecido la levadura para reactivarla despus de estar en el medio de
mantenimiento YM.

Centrifugamos a 12.000 g durante 2 min y descartamos el sobrenadante. Aadimos al pellet

de clulas 200 l de reactivo InstaGene Matrix e incubamos a 56C durante 24 min. Agitamos
en vortex a alta velocidad 10 seg y colocamos el eppendorf en agua a 100C durante 8 min.
Agitamos en vortex de nuevo 10 seg, centrifugamos a 12.000 g 2 min.

El sobrenadante que obtenemos es nuestro stock de DNA. Lo almacenamos a -20C.

II.3.2 Cuantificacin del DNA

La concentracin y pureza del DNA extrado se cuantific mediante el espectofotmetro y
el programa informtico de cuantificacin Nano-Drop (ND-1000, Nano-Drop Technologies) que
permite medir la concentracin del DNA en un volumen de 3 l de disolucin. Este programa
determina la curva de absorbancia del DNA a 260 nm que nos dar la concentracin, y la
relacin entre las absorbancias a 260 y 280 nm con la que podemos conocer la pureza del DNA
extrado.

II.3.3 Anlisis por PCR

Para el anlisis por PCR (reaccin en cadena de la polimerasa; Polymerase Chain Reaction)
se utiliz un termociclador Biometra T3000 Thermocycler (Whatman), la enzima Taq
polimerasa (Bioline), solucin buffer (bioline), MgCl2 (bioline) y dNTPs (Bioline). La reaccin de
PCR se prepar en un volumen final de 50 l para cada tubo de reaccin. Vamos a seguir el
programa de PCR universal para levaduras de Kurtzman, C.P. and Robnett, C.J (19).

Se emplearon los primers (SIGMA):

Forward NL-1: 5'- GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'

24
 Reverse NL-2: 5'- GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'

Para amplificar la zona denominada D1/D2 divergente de 18S DNAr de levaduras que
generan un amplicn de 580 pb.

Tabla II.7: Con los componentes y cantidades empleados en la PCR para optimizarla.

Componentes Concentracin Volumen por tubo Volumen por

del Stock (1:4) tubo (1:40)

Cebador forward 25 M/ 25 M 1 l 1 l

Cebador forward 25 M/ 25 M 1 l 1 l

Buffer 10 X 5 l 5 l

MgCl2 50 mM 1.5 l 3 l

dNTPs 100 mM 1 l 1 l

BioTaq DNA polimerasa 5 U/l 0.3 l 0.3 l

DNA - 10 l 20 l

Agua miliQ estril - Hasta 50 l Hasta 50 l

Nota: Partimos de un stock 100M de los primers pero realizamos dos diluciones distintas, 1:4 y 1:40.

II.3.4 Electroforesis en gel de agarosa

Para visualizar los fragmentos de DNA amplificados se utiliz la electroforesis horizontal en
gel de agarosa. Esta tcnica permite separar fragmentos de DNA de distinto tamao gracias a
la accin de un campo elctrico.

Se prepar el gel con una concentracin de agarosa D-1(Pronadisa, Conda) al 1% w/v en

tampn TBE 1X (TBE 5X: 54 g/l Tris(hidroximetil)aminometano; 27,5 g/l cido brico; 20 mL
EDTA 0,5 M pH 8). Para visualizar los fragmentos de DNA se aadieron 5 l de Midori Green
Advance DNA stain (Nippon Genetics EUROPE GmbH) durante la preparacin del gel. Toda la
mezcla se calent hasta la total disolucin de los componentes y se verti en un molde con un
peine para la formacin de los pocillos correspondientes para poder cargar las muestras.

Una vez solidificado el gel se carg cada pocillo del gel con 10 l del producto de la PCR y 2
l de tampn de carga (40% (p/V) sacarosa; 0.25% (p/V) azul de bromofenol; 0.25% (p/V)
xylene cianol). En uno de los pocillos se cargaron 2l del tampn de carga con 2 l del
marcador Hyperladder IV 200 lanes (Bioline), que genera un patrn de bandas desde 100 bp a
1013 bp, lo cual va a permitir identificar el tamao del amplicn obtenido en la PCR.

Posteriormente se sumergi el gel cargado en tampn TBE 1X en la cubeta de electroforesis

y se someti a un campo elctrico de 96 V durante 60 min. Por ltimo, se visualiz el gel con

25
luz ultravioleta y se fotografi con un captador de imgenes (Image Store 5000, UVP)
empleando para ello el programa informtico ChemiGenius (GenSnap de SynGene).

II.3.5 Secuenciacin
La secuenciacin del amplicn permiti la correcta identificacin a nivel de especie de la
levadura.

Como cebadores de secuenciacin se emplearon los mismos que en la PCR descrita

anteriormente. La secuenciacin se llev a cabo por la empresa Cogenics (United Kingdom) la
cual utiliza un sistema automtico ABI Prism 3730 Genetic Analyser (Applied Biosystem).
Posteriormente en nuestro laboratorio se analizaron tanto las secuencias nucleotdicas como
los cromatogramas obtenidos.

Anlisis de las secuencias.

Para el anlisis de las secuencias se emplearon diversas herramientas informticas a travs

de diferentes pginas web:

Attotron Biosensor Corporation: para el formateo de las secuencias.

(http://www.attotron.com/cybertory/analysis/seqMassager.htm)

Clustalw: Para comparar dos secuencias y comprobar su similitud.

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)

NCBI (National Center Biotechnology Information): Para el anlisis de las secuencias

por comparacin con la base de datos de GenBank.
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&PAGE_TYPE=BlastSearch&L
INK_LOC=blasthome)

II.4 CARACTERIZACIN BIOQUMICA DE LA LEVADURA GL15

II.4.1 Requerimientos nutricionales
Los factores nutricionales juegan un rol fundamental en el comportamiento de la levadura
durante la vinificacin y adems si la cepa es interesante para su cultivo industrial conocer sus
requerimientos nutricionales es fundamental para disear un medio de cultivo ptimo. Uno de
los nutrientes importantes son las vitaminas. Se estudi por lo tanto los requerimientos de
vitaminas de la cepa GL15 en cultivos aerbicos en un medio sinttico con glucosa como
fuente de C, urea como fuente de N, sales mayores (P, S, K, Mg, Ca) y otras sales.

Los cultivos lquidos se hicieron en frascos agitados siguiendo la estrategia de hacer al

menos dos pases por el medio a evaluar para asegurarnos el agotamiento de los nutrientes de
reserva que la levadura pudo acumular en el medio rico (GPY).

Se sembr en una placa de medio GPY agar la levadura a partir del stock conservado en el
medio de mantenimiento. Se dej crecer 24-48 horas y se inocul un erlenmeyer de 100ml
conteniendo 10 ml de medio GPY lquido con un 0.2% de glucosa. Se incub en un agitador a

26
30C durante 24-36 horas y se tomaron muestras a distintos tiempos para medir la densidad
ptica (DO) a 620 nm y observacin al microscopio ptico.

El medio empleado para el cultivo de la levadura y el estudio de los requerimientos

nutricionales es el descrito en la Tabla II.5 denominado como medio sinttico. Trabajamos con
erlenmeyers de 250 ml y con volmenes de medio de 25 ml.

En todos los ensayos se parti de un inculo de la levadura con una DO inicial de 0.1
(equivalente aproximadamente a 2.5*106 clulas/ml)(20).

Se estudiaron los requerimientos de vitaminas con 4 ensayos:

I. Control positivo, al medio se le adicionaron 25l de todos los stocks de las vitaminas,
salvo del D que al estar ms diluido se adicionaron 45l.
II. Control negativo. Medio sin vitaminas.
III. Se le adicionaron al medio 25 l de los stocks A y B.
IV. Se le adicionaron al medio 25l del stock A.

Stocks de vitaminas:

Stock A: 0.08g pantotenato, 0.02 piridoxina, 0.02g tiamina, 0.0012 g biotina

en 20ml de H2O.

Stock B: 0.6 g de inositol en 10ml d H2O.

Stock C: 0.24 g de niacina en 20 ml de H2O.

Stock D: 0.04g cido flico, 0.02 g p-aminobenzoico, 0.02 g riboflamina en

35ml de H2O.

Las soluciones de vitaminas se esterilizaban por filtracin a travs de filtros de celulosa de

0.22 m.

Se dio un primer pase a la levadura en el medio correspondiente (I, II, III o IV) y se incub
durante 72 horas a 30 C en el agitador. Este cultivo se utiliz de inculo para el siguiente pase
que se incub 48 horas y del que se tom muestra para el tercer pase que se incub tambin
durante 48 horas.

Se llev a cabo un segundo experimento que consisti en tomar inculos de los ensayos I,
III y IV del experimento anterior y dar dos nuevos pases sucesivos en cada uno de los
correspondientes medios (I, III y IV). Las incubaciones se mantuvieron durante 72 horas en el
agitador a 30 C. Se midi la absorbancia al final de cada una de las 72 horas de incubacin.

II.4.2 Estudio comparativo frente a distintas fuentes de N

Una vez que establecimos el medio sinttico mnimo con el que la levadura era capaz de
crecer en condiciones aerbicas se probaron tres fuentes de nitrgeno para ver las posibles
variaciones en el crecimiento de la levadura.

27
 En esta ocasin los ensayos fueron tres, las concentraciones del medio son las detalladas en
el medio sinttico y las vitaminas adicionadas son las optimizadas en el experimento anterior.
Entre los tres ensayos solo vara la fuente de Nitrgeno:

Ensayo A: 63 l de urea (0.5 g/l).

Ensayo B: 2000 l de peptona (stock 20 g/l)
Ensayo C: 2000 l de peptona bacteriolgica (stock 20 g/l)

II.4.3 Comportamiento fermentativo(15) y crecimiento anaerbico

Se estudi la capacidad de asimilacin y fermentacin de la levadura GL 15 frente a los
siguientes azcares: glucosa, galactosa (monosacrido), maltosa, sacarosa, trehalosa y lactosa
(disacridos) y rafinosa (trisacrido).

A partir del stock de mantenimiento se tom un inculo y se sembr en una placa de GPY
0.2% en glucosa; tras 48 horas se tomaron varias colonias y se prepar un inculo en 5 ml de
H2O destilada estril.

Los test de asimilacin/fermentacin de azcares se pueden realizar en un medio sinttico

(yeast nitrogen base) o en un medio complejo. Se emple el Medio Wickerman descrito en el
apartado 2.2.7 y se utilizaron campanas de Durham.

Los ensayos de fermentacin se realizaron por duplicado y en todos los ensayos se

incluyeron controles negativos sin inculo.

Se prepararon los stocks de los azcares al 6%, salvo el de la trehalosa que fue al 12%, y se
esterilizaron mediante filtracin (tamao de poro 0.22 m). La concentracin final de los
azcares en los ensayos fue del 2%, salvo el de trehalosa que fue del 4%.

Se inocul 0.1 ml de la suspensin de la levadura GL 15 en todos los tubos salvo en los de

control negativo en el que se aadieron 0.1 ml de agua destilada estril. Las muestras se
incubaron en forma esttica y anaerbica a 28C. Se realiz el control de la fermentacin
mediante observacin peridica durante 14 das. Las muestras se agitaban y se observaba la
acumulacin de gas en la campana y el viraje del color indicador del medio.

Segn la produccin de gas la fermentacin de cada azcar se clasifica en:

Fuerte si entre los tres primeros das se llena la campana.

Trabajo dbil si la campana est parcialmente llena.
Trabajo muy dbil si slo presenta una bubuja.
Lenta, si la fermentacin se produce pero despacio.
Ausente

Crecimiento anaerbico

Para el estudio del crecimiento anaerbico se prepar el medio descrito en la Tabla II.6 con
las vitaminas optimizadas. Se inocul 0.2 ml de la levadura obtenidos de la siguiente manera.
Se creci la cepa en el medio sinttico optimizado (Tabla II.5) hasta que se alcanz una D.O de

28
4. Se centrifug, se tir el sobrenadante y el pellet obtenido se lav un par de veces con H2O
destilada estril y se resuspendi en 5 ml de agua.

En el experimento estudiamos 4 casos distintos, dos concentraciones distintas de peptona

bacteriolgica y la presencia o no de inositol en el medio. Lo hicimos por duplicado y con un
control negativo. Como es un experimento anaerbico el cultivo se hace en tubos cerrados y se
incuba sin agitacin a 30C.

Las concentraciones de bactopeptona estudiadas fueron 4 y 8 g/l y cada una de ellas se

estudi a dos niveles, con inositol 60 mg/l y sin inositol.

II.4.4 Determinacin de azcares reductores

Anlisis enzimtico

Esta prueba se realiz para medir la cantidad de azcar consumido por la levadura durante
su crecimiento. Se emple el kit enzimtico Enzymatic determination GOD/POD Wiener lab
(Argentina), utilizado en clnica para la prueba de la glicemia. Mediante una reaccin muy
rpida se determina la presencia o ausencia de azcar en las muestras. Si hay glucosa en la
muestra se produce un viraje a color rojo, la intensidad de este color depende de la cantidad
de glucosa presente en la muestra. Las reacciones que tienen lugar con el Kit son las
siguientes:
GOD
Glucosa + O2 + H2O cido Glucnico +H2O2
POD
2 H2O2 + 4-AF + Fenol Quinona coloreada + 4H2O

Reactivos
A: Reactivo A: Solucin de 4-aminofenazona 25 mmol/l en Buffer Tris 0.92
mol/l.
B: Reactivo B: Solucin de fenol 55 mmol/l.
C: Reactivo C: Solucin de de glucosa oxidada (1000 U/ml) y peroxidasa (120
U/ml).
S: Standard: Solucin de glucosa 1 g/l.

Concentraciones finales: GOD 3000 U/l, POD 400 U/l, 4-AF 1.25mM, fenol 2.75 mM y pH
7.4 0.1

Se prepara el reactivo de la glicemia siguiendo el protocolo indicado en el kit, es necesario

conservarlo en frasco de color topacio no ms de 15 das.

El mtodo consiste en aadir en tubos de ensayo:

o 2 ml de reactivo glicemia + 50 l de agua (blanco)

o 2 ml de reactivo glicemia + 50 l de patrn de glucosa 1 g/l (viene con el kit)
o 2 ml de reactivo glicemia + 50 l de muestra

Se incuba durante 15 min en un bao a 37 C y se mide la absorbancia a 505 nm.

29
 Mtodo Somogyi-Nelson(22)

En un tubo de ensayo se ponen:

o 200l de muestra (concentracin 100 ppm)
o 200 l de reactivo Somogyi
o Se calientan 10 minutos a 100C
o Se enfran en un bao de hielo durante 10 minutos.
o Se aaden 200 l de reactivo Nelson.
o Se dejan reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
o Se aade 1.6 ml de H2O.
o Se lee la D.O. a 620 nm.

Se emple un espectrofotmetro (DU 640, Beckman (USA)).

Los reactivos Somogyi-Nelson se guardan en una estufa a 37C para su conservacin.
La muestra que se emplea como blanco lleva 200 L de H2O.
A partir de los stock de azcares 6% se crea un nuevo stock ms diluido (1:500) que se
emplea como patrn.

La reaccin que se produce con estos reactivos provoca un viraje a color verde en aquellas
muestras en las que hay azcar.

II.4.5 Metabolismo nitrogenado de la levadura GL 15

Se decidi estudiar la produccin de aminocidos y aminas bigenas durante el crecimiento

de la cepa GL 15 en un medio que contuviera nicamente urea como fuente de nitrgeno. Se
sigui la metodologa descrita por Gmez-Alonso (2007)(11) que consiste en la separacin
mediante HPLC y deteccin de las aminoenonas que se forman en la reaccin de derivatizacin
con el reactivo dietil etoximetilenomalonato (DEEMM) (Sigma Aldrich, USA) de los aminocidos
y de las aminas bigenas presentes en las muestras.

(11)
Figura II.1: Reaccin de derivatizacin.

30
 Para llevar a cabo la reaccin de derivatizacin se aaden en un tubo de ensayo de 15 ml:

o 1.75 ml de buffer borato 1M (pH=9)

o 750 l de metanol
o 1 ml de muestra
o 20 l de patrn interno, L-2-cido Aminoadpico, 1 g/l (Sigma-Aldrich, China)
o 30 l de DEEMM

Se introduce en un bao de ultrasonidos (Sonorex Digital 10P) durante 30 min para

asegurar la perfecta homogeneidad de todas las muestras.

Pasado este tiempo se calientan las muestras en un bao a 70C durante dos horas para
finalizar la reaccin de derivatizacin y conseguir la completa degradacin del exceso de
DEEMM y el resto de reactivos. Las muestras se filtran (Syringe Filters polipropileno 0.2 m, 25
mm, OlimPeak, Teknokroma) antes de ser inyectadas en el sistema de HPLC.

Los anlisis de HPLC se llevaron a cabo en el sistema modular de cromatografa lquida

SHIMAZDU Nexera, provisto de una bomba cuaternaria LC-30 AD (Japn), un desgasificador
(DGU-20A5R), un horno (CTO-20AC) con detector de fila de diodos (DAD) modelo SPD-M20A.
Se emple una columna de HPLC de fase reversa ACE 5 C18-HL de 25 cm de longitud, con
dimetro interno de 4.6 mm y partculas de 5 micras y con una precolumna del mismo material
(ACE Integral Guard Cartridge).

Las fases empleadas para el gradiente binario fueron: A tampn acetato 25 mM (pH=5.85)
con 0.02% de azida de sodio; B: fase orgnica, 80:20 acetonitrilo: metanol. El caudal de la fase
mvil fue de 0.9 ml/min.

Se realizaron por triplicado cultivos en el medio sinttico (Tabla II.5) de la levadura GL15, y
se tomaron muestras a distintos tiempos para analizar por HPLC su contenido en aminocidos
y aminas.

Se tom como control de referencia el medio sin inoculacin de la levadura (t0). Los
cultivos se mantuvieron con agitacin a 30C y 130 r.p.m. Se tomaron muestras a las 9 y 24 h,
que fueron guardadas a -20C en el congelador hasta su anlisis por HPLC.

Las muestras se descongelaron y fueron sometidas a un tratamiento previo al anlisis por

HPLC. Se pusieron en un bao a 100C durante 5 minutos y se centrifugaron a 12000 x g
durante 5 minutos, desechndose el pellet y guardando el sobrenadante para analizarlo por
HPLC. Como ya se ha comentado, se sigui el mtodo descrito por Gmez-Alonso, donde se
describe el anlisis por HPLC, se hizo reaccionar a las muestras con el DEEMM y fueron
analizadas.

La deteccin individual de los distintos compuestos presentes en las muestras y en las

disoluciones patrn se realiz a 280 nm. La integracin y tratamiento de datos se realiz con el
software de la casa SHIMAZDU, a travs del programa Labsolutions.

Previamente a estos anlisis para poder detectar y cuantificar los posibles aminocidos y
aminas que saliesen en las muestras se prepar una disolucin patrn (rango de

31
concentraciones: 659.4-126.4 mg/l) con los siguientes compuestos: alanina, arginina, cido
glutmico, glutamina, histidina, serina, glicina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, citrulina,
ornitina, fenilalanina, treonina, triptfano, valina, asparagina y cido asprtico. A partir de la
cual se hicieron diluciones y se obtuvieron las rectas patrn.

II.5 REACTIVOS QUMICOS

CaCl2, MnSO4, MgSO4. 7 H2O, KH2PO4, K2HPO4, ZnSO4.7 H2O y KI de Anedra,
Argentina.
KCl, MnSO4.H2O y BO3H3 de Mallinckrodt, Argentina.
FeCl3, CuSO4.5 H2O, FeSO4.7 H2O y Na2MoO4.H2O de Merck, Argentina.
CoCl2.6 H2O de la casa Imper, Argentina.
Acido ctrico de la casa Cicarelli, Argentina.
Bactopeptona, agar y extracto de malta de Becton Dickinson, Francia.
Extracto de levadura de OXOID LTD, Inglaterra.
Glucosa y urea de Panreac, Espaa.
Pantotenato de calcio, piridoxina, biotina, cido flico e inositol de Sigma-
Aldrich.
Tiamina y riboflavina de Calbiochem.
Nicotinamida y p-aminobenzoico de Merck Schuchardt OHG.
Acetato de sodio calidad extra puro y azida de sodio de Scharlau, Espaa.
Metano y Acetonitrilo grado HPLC (PAI-ACS) Panreac.

Los aminocidos y aminas bigenas empleados fueron los siguientes:

L-alanina, L-Arginina, L-Asparagina, L- cido Asprtico, L-Citrulina, L-Glutamina, L-Histidina,

L-Lisina monohidrato, L-Isoleucina, L-Ornitina, L-Treonina y (-)-5-Hidroxi-L-Triptfano de Merck
KGaA, Alemania.

L-Prolina, L-Fenilalanina, Glicina, L-Leucina, L-Metionina y L-Serina de Calbiochem,

Alemania.

L-Valina de Sigma-Aldrich, USA.

L-cido Glutmico de Panreac, Espaa.

II.6 SENSIBILIDAD Y PRECISIN DEL MTODO

La repetibilidad se calcul como la desviacin estndar relativa intra-da y la precisin
intermedia como la desviacin estndar inter-da.

El lmite de deteccin de cada aminocido fue establecido multiplicando por 3 el valor de la

desviacin estndar de la ordenada de la recta de calibrado y dividindolo entre la pendiente
de dicha recta. El lmite de cuantificacin se hall de la misma manera pero multiplicando por
un valor de 10 en vez de 3.

32
 El intervalo de confianza dado en la tabla de los resultados (Tabla III.7) se calcul
multiplicando la desviacin estndar obtenida de las tres rplicas por el valor de la t de
Student correspondiente a un 5% de error y dos grados de libertad (4.303) y dividindolo entre
la raz de 3 (el nmero de rplicas).

II.7 TRATAMIENTO ESTADSTICO

Los datos se analizaron utilizando el programa IBM SPSS Statistics 19 para Windows. Se
llev a cabo un anlisis de la varianza (ANOVA) para determinar la reproducibilidad y la
repetitividad del mtodo.

Para comparar los resultados obtenidos a 9 o 24 horas se llev a cabo una comparacin de
las medias. Para ello previamente se compararon las varianzas muestrales mediante un
"ensayo F". Segn el resultado de este ensayo, se utiliz un ensayo t para muestras con
varianzas homogneas o heterogneas. Estos estudios se realizaron con la herramienta
Anlisis de datos el programa Microsoft Excel 2007. Se compara el valor F experimental con el
valor F crtico cuando experimental es mayor hacemos una prueba t para dos muestras
suponiendo varianzas desiguales. Cuando el F crtico es mayor se lleva a cabo una prueba t
para dos muestras suponiendo varianzas iguales.

Si en la prueba t el p-valor es mayor de 0.05 las medias son iguales. Por el contrario si el p-
valorobtenido es menor de 0.05 hay diferencias significativas entre las medias.

33
III. RESULTADOS Y DISCUSIN

34
 III.1 IDENTIFICACIN TAXONMICA DE LA LEVADURA GL15
Crecimiento en Agar Lisina

Como ya se ha mencionado en la Introduccin, existan datos previos del crecimiento de

esta cepa en el medio Agar Lisina, el cual se emplea para diferenciar las levaduras
Saccharomyces de las no-Saccharomyces, ya que en dicho medio las levaduras Saccharomyces
no crecen al no ser capaces de utilizar la lisina como nica fuente de nitrgeno. Se realizaron
cuatro pases sucesivos de la levadura en este medio a partir del inculo original para
asegurarse de que la levadura no creca por los nutrientes que arrastaba del medio en el que
haba crecido previamente.

El resultado final fue negativo para el crecimiento de la cepa GL15 en el medio con lisina, lo
que permiti en una primera aproximacin suponer que era del gnero Saccharomyces.

Crecimiento en WL

El medio WL se emplea habitualmente para seguir la evolucin de poblaciones de levaduras

en procesos de vinificacin a partir de la forma y color de la colonia. Tras 4 das de incubacin
las colonias de Saccharomyces se muestran redondas, lisas y el color de las mismas vara
ligeramente de color crema a algunas verdes plidas.

Comparando los resultados obtenidos con la bibliografa, la cepa estudiada tambin se

ajustaba con la descripcin que se da para el crecimiento de colonias del tipo Saccharomyces
en medio WL.

Figura III.1: Cepa GL 15 crecida en medio WL.

Identificacin microbiolgica

Se llevaron a cabo varios estudios bajo el microscopio: recuento en cmara de Neubauer,

tincin de Gram, tincin con eritrosina y estudio con microscopio electrnico.

Las levaduras observadas en el microscopio tenan la siguiente morfologa:

Figura III.2: Levaduras observadas en microscopio ptico con contraste de fase (400X). Levaduras observadas con
microscopio ptico 600 X aumentos.

35
Figura III.3: Imgenes de una misma preparacin de levaduras tras una tincin de Gram (630 X aumentos). Vistas en
el microscopio ptico con campo claro (AXIOSKOP 2 plus, Hal 100, Zeiss).

Como se puede observar en las fotos, las levaduras tienen una forma ovalada, siendo en
algunos casos redondeadas. En muchas de las fotos se observ que estaban en proceso de
gemacin, lo que indica que en las muestras de las que proceden se encuentran an en su
etapa lag o en la de crecimiento exponencial.

Los recuentos en cmara de Neubauer con tincin de eritrosina de las muestras obtenidas
durante el estudio de la cintica de la levadura fueron los siguientes:

A las 9 horas 35 minutos: 2.58*107 clulas/ml

A las 26 horas 45 minutos: 5.86*107 clulas/ml

Se observaron todas las clulas sin teir en ambos recuentos, lo que demuestra que las
levaduras eran viables en ambas muestras.

36
 III.2 CARACTERIZACIN BIOQUMICA Y FERMENTATIVA

III.2.1 Estudio de la fermentacin de azcares.

Con el medio descrito en el apartado II.1.2 se llev a cabo el estudio fermentativo de la
cepa GL 15 de los azcares detallados en el apartado II.4.3, se sigui el mtodo operativo
descrito en dicho apartado.

Los respectivos medios con los azcares se inocularon con 3*105 clulas/ml y se incubaron
de forma esttica y anaerbica a 28C. Durante 14 das se observaron peridicamente y se
agitaron para determinar la posible acumulacin de gas en la campana, as como el viraje del
color indicador (un viraje a amarillo indicaba fermentacin positiva del azcar).

Tabla III.1: Resultados del seguimiento de la fermentacin de azcares por la cepa GL 15

Glucosa Galactosa Maltosa Sacarosa Trehalosa Lactosa Rafinosa

Da
1/3 de
1 1burbuja - 1burbuja negativo negativo negativo
gas
3/4 de
2 1burbuja 1burbuja 2/3 gas negativo negativo negativo
gas
4/5 de 4/5 de 4/5 de
3 4/5 de gas negativo negativo negativo
gas gas gas
final + + + + - - -

Figura III.4: Test de fermentacin de azcar para GL15. Los cuatro tubos situados a la izquierda con color del medio
ligeramente amarillento dieron positivo el test de fermentacin.

A la vista de estos resultados surgieron dos cuestiones: que algn azcar hubiera
fermentado y visualmente no lo hubiramos detectado, y que algn oligosacrido se hubiera
hidrolizado y la fermentacin correspondiera a glucosa y no al azcar estudiado. Por ello, se
decidi hacer la prueba de la glicemia para asegurarnos que en el fermentado final no haba
glucosa que pudiera dar un falso positivo en la fermentacin.

Se emple el patrn del kit de glucosa 1 g/l, otra disolucin de glucosa de referencia de 0.1
g/l y los azcares usados en la fermentacin.

37
 Figura III.5: De izquierda a derecha: glucosa 1 g/l, maltosa, galactosa, glucosa 0.1 g/l, glucosa, rafinosa, trehalosa,
lactosa y sacarosa.

Se observ que la glucosa, galactosa y maltosa dieron positivo mientras que la rafinosa,
trehalosa, lactosa y sacarosa dieron negativo o por debajo del lmite de 0.1 g /l.

Como conclusin del anlisis fermentativo determinamos que la GL15 es capaz de

fermentar glucosa y sacarosa y no fermenta lactosa, trehalosa ni rafinosa. Por la coloracin de
los tubos podemos establecer que no toda la galactosa ni toda la maltosa se encuentran
hidrolizadas, ya que su coloracin es inferior a la del tubo correspondiente al azcar empleado
en el estudio fermentativo.

Para asegurar que la fermentacin de galactosa y maltosa observada era cierta y no se

corresponda slo a la glucosa presente en dichos azcares, realizamos un anlisis de azcares
reductores. El mtodo Somogyi-Nelson permite aclarar si queda azcar residual en los medios
fermentativos estudiados. En este mtodo se produce un viraje a verde oscuro cuando hay
azcar presente en la muestra analizada. Si la levadura ha sido capaz de fermentar los azcares
las muestras correspondientes a los medios fermentativos de galactosa y maltosa no deben
producir viraje ya que en la fermentacin la levadura debera haber consumido el azcar que le
habamos puesto inicialmente.

Tabla III.2: Resultados obtenidos prueba S-N.

Muestras Color final

Blanco Amarillento
Patrn galactosa Verde oscuro
Patrn maltosa Verde oscuro
Patrn lactosa Verde oscuro
Medio ferm. Galactosa Amarillento
Medio ferm. Maltosa Amarillento
Medio ferm. Lactosa Verde oscuro

De estos resultados se concluy que en los medios correspondientes a la fermentacin de

la galactosa y la maltosa no quedaba azcar residual, ya que en la prueba dio resultado
negativo (no se observ viraje y qued un color similar al control del blanco). En resumen, la
levadura GL 15 es capaz de fermentar glucosa, galactosa, maltosa y sacarosa mientras que no
fermenta rafinosa, trehalosa ni lactosa.

38
 III.2.2 Requerimiento nutricional de la levadura
Al ser una cepa aislada de una etapa de la elaboracin del vino de ciruela, posee unas
caractersticas de resistencia a pHs bajos muy interesantes. Estudiamos las vitaminas mnimas
que necesita para crecer en condiciones de aerobiosis con agitacin.

Se parti nuevamente de un inoculo tomado del stock en el medio de mantenimiento

almacenado a 4C, se creci la levadura en medio GPY lquido con 0.2% en glucosa y a las 48
horas se tom una muestra para medir la DO (2.502) y comprobar la pureza del cultivo.

El medio utilizado para optimizar el contenido vitamnico tena como base los componentes
descritos en la Tabla II.5. Glucosa como fuente de C, urea como fuente de N, y la serie de sales
indicados en ese mismo apartado. Desde el punto de vista industrial el inositol es una vitamina
muy importante para el metabolismo de las levaduras y era de inters saber si la levadura lo
necesitaba para crecer.

Se lleva a cabo el procedimiento descrito en el apartado II.4.1. Los ensayos realizados

fueron:

I. Control positivo: al medio se le adicionaron 25 l de todos los stocks de las

vitaminas, salvo del D que al estar ms diluido se adicionaron 45 l.
II. Control negativo: medio sin vitaminas.
III. Se le adicionaron al medio 25 l de los stocks A y B.
IV. Se le adicionaron al medio 25 l del stock A.

Se observaron las muestras al microscopio entre cada pase y se confirm en todos los casos
su pureza. Los resultados fueron los siguientes.

39
Tabla III.3: Seguimiento del crecimiento de la levadura GL 15 en el estudio de sus
requerimientos vitamnicos.

Ensayo Tiempo DO pH
I 1.76 4.89
II A las 72 1.79 3.91
horas
III 1.81 4.89
IV 1.8 4.79
I 4.89 5.4
II A las 48 0.788 3.8
III horas 4.77 5.27
IV 4.387 4.93
I 1.218 3.66
II A las 48 0.062 4.39
III horas 1.003 3.77
IV 0.994 3.77
I 0.3693
III inicio 0.3459
IV 0.4164
I 4.157 6.65
A las 72
III 4.211 6.7
horas
IV 4.267 5.41
I 4.654 6.54
A las 72
III 4.532 6.61
horas
IV 4.313 5.34

4
I
DO 620 nm

3
II
2 III
1 IV

0
1 2 3
Pases

Figura III.6: Estudio de requerimiento vitamnico. Se corresponde con la Tabla III.3. Pase 1: 72 horas de incubacin.
Pase 2: 48 horas y Pase 3: 48 horas.

Los resultados del crecimiento celular y pH en los medios de ensayo se detallan en la Tabla
III.3 y en la Figura III.6. Ell primer pase tras las 72 h de cultivo no se aprecian diferencias en el
crecimiento, sin embargo en el segundo pase en el medio sin vitaminas (II) II) la levadura deja de
crecer. En los demss medios el crecimiento es similar y alcanza una DO de 4.2-4.7 4.2 que es la
mxima en este medio. Con el tercer pase se ve que la cepa GL15 necesita al menos para

40
crecer adecuadamente 4 vitaminas: pantotenato,
pantotenato, piridoxina, tiamina y biotina, ya que en el
ensayo IV donde solo estn presentes esas vitaminas crece sin problemas.
problemas En estos medios no
se observ glucosa residual confirmando
conf as el completo consumo de la fuente de C. El
aumento del pH al final del cultivo es indicativo del agotamiento de la fuente de C.

Repetimos los ensayos I, III y IV para confirmar qu vitaminas eran imprescindibles.

imprescindibles Como
se observa en la Tabla III.3 y Figura III.7,, el cultivo con todas las vitaminas (I), el cultivo con 5
vitaminas (III) y el cultivo con 4 vitaminas (IV) alcanzaron unas poblaciones de levaduras muy
semejantes.

4
DO 620 nm

3 I
III
2
IV

0
1 2 3
Pases

Figura III.7: Segundo experimento del estudio de requerimiento vitamnico.

vitamnic Correspondencia con la Tabla III.3 pase
1: DO inicial, pase 2: 72 h, pase 3: 144 h.

Realizamos la prueba de la glicemia a las ltimas muestras de los tres ensayos para saber si
la levadura haba consumido toda la glucosa. En los tres ensayos el resultado de la glicemia fue
negativo, es decir, no quedaba glucosa en el medio.

Con estos datos, DO y consumo total de la glucosa

glucosa por parte de la levadura, determinamos
que la cepa GL 15 es capaz de crecer en el medio sinttico con 4 vitaminas (pantotenato de
calcio, piridoxina, tiamina y biotina), en condiciones aerobias. Estas condiciones y composicin
del medio de cultivo se utilizaron
utilizaro para los posteriores ensayos.

III.2.3 Estudio comparativo frente a distintas fuentes de nitrgeno

Como se ha explicado en materiales y mtodos, se dise un experimento para estudiar
con qu fuente de nitrgeno creca mejor la levadura.

La fuente de nitrgeno
itrgeno es lo nico que vara de un
un ensayo a otro, en este caso las fuentes
de nitrgeno estudiadas fueron: urea (A), peptona (B) y peptona bacteriolgica (C).

El modo de trabajar fue igual que en el experimento anterior, se dieron varios pases en los
medios estudiados para asegurar que la levadura consume todos los nutrientes del medio del
que proviene y crece slo por los que tiene en el nuevo medio. Se estudi en el microscopio la
pureza de los cultivos encontrndose que no haba contaminacin en ellos

41
 Tabla III.4: Datos finales del estudio de crecimiento de GL 15 frente a distintas fuentes de
nitrgeno.

Ensayo pH Recuento DO Glicemia

A 4.97 1.16*108 3.64 negativo
B 3.19 1.11*108 4.494 negativo
C 2.77 8.1*107 4.016 negativo

Se hizo la prueba de la glicemia a los ensayos para asegurarnos que la levadura haba
consumido toda la glucosa y haba crecido bien.

Como resultado de este estudio podemos decir que la GL 15 es una cepa que puede crecer
en presencia de cualquiera de las tres fuentes de nitrgeno estudiadas. Esto, junto con el
experimento de las vitaminas, nos hace ver que la levadura en un medio sinttico de
laboratorio no requiere grandes cantidades de nutrientes o fuentes especficas de nitrgeno
para crecer de manera aerbica.

III.2.4 Estudio cintico del crecimiento aerbico

Se decidi realizar un estudio cintico del crecimiento de la levadura en condiciones
aerbicas. El medio empleado fue el descrito en la Tabla II.5. con las vitaminas resultantes del
estudio de la optimizacin. La levadura fue incubada en erlenmeyers de 250 ml con 25 ml de
medio en un agitador a 130 r.p.m. y a 30C.

Tabla III.5: Datos de DO obtenidos durante el estudio cintico de crecimiento de la cepa GL 15.

horas DO
0 0.19
2.33 0.31
4.42 0.61
5.33 0.77
7.5 1.67
8.58 2.24
10 2.55
11.17 2.95
24.25 4.61
26.33 4.72
28.17 4.62
32.58 4.62

42
 5

Absorbania
3

0
0 10 20 30
Horas

Figura III.8: Crecimiento de la GL 15 en condiciones aerbicas.

Con esta curva y su rplica se determin la velocidad de crecimiento de dicha levadura,

0.38 0.05 u.a/h.

III.2.5 Estudio de crecimiento anaerbico.

La Tabla III.6 muestra los resultados del estudio del crecimiento de la levadura GL15 en
condiciones anaerbicas y en el medio indicado en la Tabla II.6

Tabla III.6: Crecimiento de GL15 en condiciones de anaerobiosis.

Medio inositol DO DO promedia Recuento Recuento promedio

4.487 1.132*108
4 g bactopeptona/l Si 4.58 1.01*108
4.686 8.89*107
3.031 5.64*107
4 g bactopeptona/l No 3.3 6.13*107
3.488 6.61*107
2.911 4.64*107
8 g bactopeptona/l Si 3.1 4.70*107
3.245 4.75*107
4.593 6.53*107
8 gbactopeptona/l No 4.1 7.18 *107
3.590 7.82*107

Los resultados de los recuentos indican que la levadura puede crecer con o sin inositol, pero
con 4 g/l de bactopeptona crece en condiciones ptimas con inositol ya que alcanza un valor
de 8*107 levaduras/ml. En cambio, en ausencia de inositol los valores de recuento obtenidos
son inferiores, en torno a 6*107 levaduras/ml.

En cuanto a la cantidad de peptona bacteriolgica puesta en el medio no parece un factor

limitante ya que en ambas concentraciones fue capaz de alcanzar el valor del recuento de
8*107 levaduras/ml. Con una concentracin de 4 g/l la levadura puede crecer sin problemas.

43
 III.3
.3 CARACTERIZACIN DE LA LEVADURA MEDIANTE ANLISIS DE
BIOLOGA MOLECULAR.
La concentracin de ADN extrado fue medida con el Nano-Drop
Drop e indic un valor de 327
ng/l.

El gel con el resultado de la amplificacin del ADN mediante PCR universal para levaduras
se muestran en la imagen siguiente.

1 2 3 4 5

600 pb

500 pb

400 pb

Figura III.9: Gel con los productos de la PCR universal de levaduras. Calle 1: marcador de DNA; Calle 2: amplicn de
GL15; Calle 3: control positivo de DNA; Calles 4 y 5: controles negativos

La fotografa de la imagen muestra el amplicn de 580 pb obtenido en el anlisis por PCR

universal de levaduras
uras (Kurtzman and Robnett, 1998) del DNA de la levadura GL15.

El resultado del anlisis de la secuencia del amplicn obtenido fue:

CGGCGAGTGAAGCGGCAAAAGCTCAAATTTGAAATCTGGTACCTTCGGTGCCCGAGTTGTAATTTGGA
GAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCC
GAGGGCAACTTTGGGGCCGTTCCTTGTCTATGTTCCTTGGAACAGGACGTCATAGAGGGTGAGAATCC
CGTGTGGCGAGGAGTGCGGTTCTTTGTAAAGTGCCTTCGAAGAGTCGAGTTGTTTGGGAATGCAGCTC
TAAGTGGGTGGTAAATTCCATCTAAAGCTAAATATTGGCGAGAGACCGATAGCGAACAAGTACAGTGA
TGGAAAGATGAAAAGAACTTTGAAAAGAGAGTGAAAAAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGGGCA
TTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCA
TTTGATCAGACATGGTGTTTTGTGCCCTCTGCTCCTTGTGGGTAGGGGAATCTCGCATTTCACTGGGCCA
GCATCAGTTTTGGTGGCAGGATAAATCCATAGGAATGTAGCTTGCCTCGGTAAGTATTATAGCCTGTGG
GAATACTGCCAGCTGGGACTGAGGACTGCGACGTAAGTCAAGGATGCTG

Al introducirlo en la base de datos del GenBank se obtuvo una similitud del 100% con
Saccharomyces cerevisae con un 0.0 de error aleatorio.

44
 Figura III.10: Emparejamiento del amplicn con Saccharomyces cerevisae.

Con este anlisis mediante PCR, la secuenciacin y comparacin con el banco de secuencias
GenBank se confirma que la levadura GL15 es Saccharomyces cerevisae.

III.4 SENSIBILIDAD Y PRECISIN DEL MTODO

El mtodo de determinacin de aminocidos se valid en trminos de sensibilidad y
precisin.

Los resultados de la repetibilidad y la precisin intermedia de la determinacin mediante

cromatografa lquida se muestran en la Tabla III.7., y se calcularon mediante un anlisis de
varianza ANOVA de los resultados obtenidos (disoluciones patrn de todos los aminocidos y
aminas bigenas estudiadas, en el rango de concentracin 52.75- 10.11 mg/l) por triplicado en
tres das diferentes (3 rplicas por 3 das).

Estos resultados indican que el anlisis de los aminocidos y aminas bigenas no genera
diferencias significativas entre llevarlo a cabo el mismo da de la derivatizacin o realizarlo en
los dos das siguientes. Esto es as porque para todos los aminocidos salvo para la histidina se
obtuvo un p-valor superior a 0.05. En el caso de la histidina la significacin fue de 0.037. En el
estudio de los subconjuntos homogneos con el test de Tukey se vio que s haba diferencias
significativas en el anlisis de la histidina entre el primer y el tercer da.

45
 Tabla III.8: Repetibilidad, precisin intermedia y lmites de deteccin y cuantificacin de
los aminocidos encontrados en las muestras.

Aminocidos repetibilidad % % precision intermedia L.O.D L.O.Q

(mg/l) (mg/l)

. sprtico 10 2 0.4 1.4

. Glutmico 10 3 0.4 1.3

Asparagina 10 2 0.2 0.7

Serina 10 2 0.4 1.4

Glutamina 10 5 0.4 1.2

Histidina 13 31 0.3 0.9

Glicina 10 3 0.2 0.8

Treonina 13 13 1.2 4.0

Citrulina 11 4 0.3 0.9

Arginina 10 2 0.1 0.4

Alanina 10 2 0.2 0.8

Hidroxi-triptfano 10 2 0.1 0.3

Valina 10 2 0.2 0. 8

Metionina 9 2 0.2 0.5

Isoleucina 10 2 0.3 0.8

Leucina 10 2 0.4 1.3

Fenilalanina 10 3 0.3 1.1

Ornitina 10 3 0.2 0.7

Lisina 10 2 0.3 1.0

Nota: En el apartado II.6 de materiales y mtodos se describen los clculos.

III.5 ANLISIS QUMICO POR HPLC DEL METABOLISMO NITROGENADO

Como ya hemos comentado esta levadura tiene unas caractersticas muy interesantes en
cuanto a la tolerancia a valores de pH cidos y temperaturas elevadas. Adems, al tratarse de

46
una levadura aislada en una de las etapas de elaboracin de una bebida, se consider
oportuno estudiar la potencial formacin de aminas bigenas por parte de dicha levadura.

Fueron elegidos para el estudio los siguientes aminocidos: alanina, arginina, cido
glutmico, glutamina, histidina, serina, glicina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, citrulina,
ornitina, fenilalanina, treonina, triptfano, valina, asparagina y cido asprtico. Y se analiz la
posible formacin de las siguientes aminas bigenas: histamina, GABA, agmatina, espermidina
y putrescina.

Tal y como se ha mencionado en Materiales y Mtodos, con estos compuestos se prepar

una disolucin stock (rango de concentraciones: 659.4-126.4 mg/l) que fue empleada para
preparar las rectas de calibrado de cada uno de ellos para su posterior identificacin y
cuantificacin si estaban presentes en las muestras de los cultivos de la levadura GL 15. Un
ejemplo del cromatograma obtenido para una muestra de disolucin stock es el mostrado en
la Figura III.13.

Los resultados obtenidos en el anlisis realizado por triplicado se muestran en la Tabla III.6.
y estn representados en un histograma en la Figura III.17.

Los triplicados correspondientes al tiempo cero 0 (t01, t02, t03) dieron cromatogramas
planos en los que slo se observaban algunos ruidos, la seal del patrn interno y un pico en
torno a 46.5 min correspondiente al nitrgeno procedente de la urea presente en el medio en
las condiciones iniciales, como puede verse en la Figura III.14.

Las muestras tomadas a las 9 horas (t1A, t1B, t1C) presentaban numerosos picos que
fueron identificados comparando los tiempos de retencin con los obtenidos con los
estndares puros y las correspondientes rectas patrones. Un ejemplo de estos cromatogramas
se muestran en la Figura III. 15.

Las muestras correspondientes a las 24 horas de incubacin (Figura III.16) presentaban

cromatogramas con exactamente los mismos picos, pero las seales tenan una intensidad
mayor ya que al haber pasado ms tiempo, la levadura haba sido capaz de producir mayor
cantidad de los compuestos.

Los aminocidos ms abundantes en la fase de crecimiento exponencial y en la estacionaria

de la cepa GL 15 fueron: Glu, Gln y Arg, cuyas vas de interconversin constituyen el
metabolismo central de nitrgeno de levadura.

En los cromatogramas obtenidos no se encontraron seales a los tiempos de retencin(11)

correspondientes a las siguientes aminas bigenas: GABA (36.5 min), agmatina (47.4),
histamina (44.2), espermidina (66.7) y putrescina (75). Esto es interesante porque indica la
idoneidad de la cepa para la elaboracin de un producto para el consumo humano. La
aparicin de aminas bigenas en los vinos de uva se encuentra descrita ampliamente en la
bilbiografa, as el artculo de Garca-Villar(18) analiza varias muestras de vino (reserva, crianza y
joven) a travs de HPLC con un detector DAD empleando el agente derivatizante 1,2-
naptoquinona-4-sulfonato y detecta entre otras, las aminas bigenas putrescina, en un rango
de 5.28-44.35 mg/l, o la histamina, de 0.22 a 10.21 mg/l.

47
 El pico de la ornitina apareci en los cromatogramas de 9 horas pero en los de 24
disminuye quedando por debajo del lmite de cuantificacin. La citrulina, el otro aminocido
no proteinognico estaba presente a las 9 horas por debajo del lmite de cuantificacin pero a
las 24 horas si que tena un valor cuantificable aunque menor, 2.10.5 mg/l, mg/l similar al de la
ornitina, 3.40.5 mg/l.. Esto se explica porque la ornitina y la citrulina participan en el ciclo de
la urea y al igual que se generan en dicho ciclo, son reutilizadas.
reutiliz

El asprtico, presente en 8.3 1.5 mg/l

mg/ conecta el ciclo de la urea con el metabolismo de
alanina, glutamina y el suyo propio. Como vemos en la Figura III.11.

(21)
Figura III.11: Rutas centrales
ntrales del metabolismo del nitrgeno de Saccharomyces cerevis
erevisiae .

El glutmico es un aminocido central en el metabolismo nitrogenado de S. cerevisiae

(Figura III.11) por lo que es lgico que est presente en una concentracin
concentracin elevada 33.513.9
mg/l a las 24 h.

La arginina y la glutamina son aminocidos que contienen

en varios tomos de nitrgeno. Se
encuentran presentes en las muestras en una concentracin elevada, 26.29.5 y 11.1 3.1
mg/l a las 24 h respectivamente.

a) b)

Figura III.12: Estructura qumica de la a) arginina y b) glutamina.

g

48
 Su papel en las rutas centrales del metabolismo del nitrgeno, incluido el importante ciclo
de la urea, y su papel como molcula reservorio de grupos amino, explican su presencia en
elevadas concentraciones en las muestras de nuestro estudio.

Hay que destacar tambin la ausencia de glicina, treonina, serina y metionina en las
muestras correspondientes a las 24 horas.

49
Tabla III.7: Resultados del anlisis por HPLC

Aminocidos Concentracin IC (a las 9 h) Concentracin IC (a las 24 h) Test t

(mg/l) (mg/l) (p- valor)
. sprtico <LOQ(1.30.4) 8.31.5 0.000
. Glutmico 11.32.9 33.513.9 0.029
Asparagina <LOQ(0.90.3) 3.20.8 0.000
Serina 0.50.1 <LOQ(0.10.02) 0.001
Glutamina 15.70.9 11.13.1 0.006
Histidina <LOD 2.20.5 -
Glicina <LOD <LOD -
Treonina <LOQ(1.00.1) <LOD -
Citrulina <LOQ(0.70.3) 2.10.5 0.000
Arginina 7.62.6 26.29.5 0.001
Alanina 3.30.4 9.12.7 0.012
Hidroxi-triptfano <LOQ(0.40.2) 2.81.3 0.018
Valina <LOQ(0.20.2) 4.61.6 0.008
Metionina <LOQ(0.30.1) 1.10.4 0.015
Isoleucina <LOQ(0.60.5) 4.31.4 0.000
Leucina <LOQ(0.10.1) 4.41.4 0.006
Fenilalanina <LOD 1.90.8 -
Ornitina 3.40.5 <LOQ(1.20.7) 0.000
Lisina <LOQ(1.10.3) 6.52.0 0.008

50
 La tabla III.7 muestra los resultados obtenidos despus de la interpolacin en las rectas DE
calibrado de cada aminocido de los datos obtenidos en el anlisis por HPLC y tratados
estadsticamente mediante la comparacin de las varianzas muestrales con el ensayo F y su
posterior comparacin de dos medias mediante el ensayo t. El p-valor obtenido tras el estudio
estadstico para todos los aminocidos que aparecieron en las muestras fue menor que 0.05.
Esto significa que la diferencia de concentraciones entre las muestras correspondientes a 9 o
24 h fue en todos los casos significativa.

51
Figura III.13: Cromatograma correspondiente a la disolucin stock de patrones puros. Rango de concentracin de los compuestos: 10.55-2.02 mg/l.
Datafile Name:Mta E 080414.lcd
Sample Name:Mta E 080414
Sample ID:Mta E 080414
mAU %
Mta E 080414.lcd 280nm,4nm (1.00) B.Conc

Lys/63.322
amonio/46.771
240
100.0
230

220 95.0

210 90.0

200
85.0
190

Adpico/15.233 80.0
180

170 75.0

160
70.0
Asp/6.317

150
65.0

Leu/57.139
140
Glu/8.836

Val/49.799
60.0

ornitina/60.460
130

Citrulina/29.756
120 55.0
Gly/27.231

Ala/35.978
110
Ser/18.506

50.0
100
45.0

Ile/55.850
90

Phe/57.835
80 40.0
Thr/29.524

70
35.0
Asn/17.638

60
30.0
Arg/31.574

50

Met/51.172
25.0
40
Gln/20.282
His/21.265

30
Trp/42.428

20.0

20
15.0
/14.409

/49.459
/50.103
/50.881
7

10
/51.62

10.0
0

-10 5.0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 min

52
Figura III.14: Cromatograma correspondiente a una de las muestras de tiempo 0 analizadas. Los picos que se ven son ruidos del cromatograma, la seal del
patrn interno (adpico) y el nitrgeno presente en la muestra que proviene de la degradacin de la urea.
Datafile Name:t 01 tfm.lcd
Sample Name:t 01
Sample ID:t 01
mAU %
t 01 tfm.lcd 280nm,4nm (1.00) B.Conc

Adpico/15.609
C.Conc
170 100.0

95.0
160

90.0
150

85.0
140

80.0
130

75.0
120

Amonio/46.467
70.0
110
65.0

100
60.0

90
55.0

80
50.0

70
45.0

60 40.0

50 35.0

40 30.0

30 25.0

20.0
/14.690

20

15.0
10

10.0
0

5.0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 min

53
Figura III.15: Cromatograma correspondiente a una de las muestras de tiempo 1 (9 horas). Los picos se identificaron segn los tiempos de retencin.
Datafile Name:Muestras C1tfm.lcd
Sample Name:Muestras C1
Sample ID:Muestras C1
mAU %
C.Conc

amonio/45.934
Muestras C1tfm.lcd 280nm,4nm (1.00)

Adpico/14.972
Pump B Pressure
100.0
180

95.0
170

90.0
160
Glu/8.750

85.0
150

80.0
140

75.0
130

70.0
120

65.0
110

60.0
100

55.0

ornitina/60.789
90

50.0
80

Ala/35.479
45.0
Arg/30.386

70

40.0
60

35.0
50

30.0
/36.342
Gln/19.080

citrulina/29.207

Lys/63.719
40
Asp/6.258

25.0
30
/14.383

/50.120 Val/49.799
/42.896 Trp/43.211

20.0

Ile/55.974
Thr/28.455

20
Ser/17.614
Asn/16.459

/33.146

Leu/57.278
/49.515 15.0
10
/29.835

/43.620

/55.457
/35.092
/8.419

10.0
0

5.0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 min

54
Figura III.16. Cromatograma correspondiente a una de las muestras de tiempo 2 (24 horas). Los picos se identificaron segn los tiempos de retencin.
Datafile Name:Muestras A2 tfm.lcd
Sample Name:Muestras A2
Sample ID:Muestras A2
mAU %
600 Muestras A2 tfm.lcd 280nm,4nm (1.00) B.Conc

amonio/45.933
C.Conc
575 100.0

550
95.0

525
90.0
500
Glu/8.724

85.0
475

450 80.0

425
75.0

400
70.0
375

65.0
350

325 60.0

300
55.0
Arg/30.401

275
50.0
250
Ala/35.451
Adpico/14.994

45.0
225

Lys/63.691
Asp/6.257

200 40.0

175
35.0
150

Val/49.782
30.0
125

Ile/55.955

Phe/57.668 Leu/57.254
100 25.0
/29.871 citrulina/29.213

ornitina/60.790
/14.514

75
/42.907 Trp/43.200

Met/50.903
20.0
Asn/16.472

Gln/19.110
His/19.407

50
Ser/17.631

Thr/28.483

15.0
/43.610

/50.119
/51.320

25
/8.416

10.0
0

-25 5.0
0.0 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 55.0 60.0 65.0 70.0 75.0 80.0 85.0 90.0 min

55
 45

40

35

30
concentracin mg/l

25

20
9h
24 h
15

10

aminocidos

Figura III.17: Representacin de los valores promedio y su desviacin estndar de las concentraciones de aminocidos presentes en las muestras a las 9 h y a las 24 h de crecimiento.

56
IV. CONCLUSIONES

57
CONCLUSIONES
La levadura GL 15 responsable de la fermentacin del mosto de ciruela Genovesa
que se emplea para la elaboracin de una bebida alcohlica tpica de Argentina,
pertenece a la especie Saccharomyces cerevisiae.
En condiciones aerbicas la levadura necesita para su crecimeinto las siguientes
vitaminas: pantotenato de calcio, piridoxina, tiamina y biotina. En condiciones
anaerbicas con presencia de inositol tiene un crecimiento ptimo.
Esta levadura es capaz de fermentar los siguientes azcares: glucosa, galactosa,
maltosa y sacarosa; y no fermenta: rafinosa, trehalosa ni lactosa.
En su fase de crecimiento exponencial en el medio sinttico optimizado y bajo
condiciones de aerobiosis, el valor de la velocidad de crecimiento de la levadura fue
0.05 u.a/h.
Los aminocidos presentes en los sobrenadantes libres de clulas de los cultivos de
la levadura GL15, y cuantificados por HPLC fueron: cido asprtico, cido glutmico,
asparagina, glutamina, histidina, citrulina, arginina, alanina, hidroxi-triptfano,
valina, metionina, isoleucina, leucina, fenilalanina y lisina.
Los aminocidos presentes en mayor concentracin fueron: cido glutmico,
glutamina y arginina, cuyas vas de interconversin constituyen el metabolismo
central de nitrgeno de esta levadura.
No se detect la generacin de aminas bigenas en los cultivos de la levadura GL15.

58
BIBLIOGRAFA

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