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Determinao da seqncia de
aminocidos de cadeias polipeptdicas
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Determinao da seqncia de aminocidos de cadeias polipeptdicas

1 Etapa: Determinao da composio em aminocidos

Hidrlise de todas as ligaes peptdicas do polipeptdeo puro. A mistura obtida analisada
por cromatografia de troca inica, para determinao dos aminocidos presentes e das
suas propores relativas.

2 Etapa: Identificao dos resduos amino-terminal e carboxila-terminal.

Resduo Amino-terminal (utilizando 1-fluor-2,4-dinitrobenzeno ou cloreto de dansil)

1-fluor-2,4-dinitrobenzeno + peptdeo 2,4-dinitrofenil-peptdeo

HCl 2,4-dinitrofenil-aminocido (resduo N-terminal) + aminocidos livres

NO2
2

O resduo de aminocido N-terminal ligado ao 2,4-dinitrofenil

identificado por comparao cromatogrfica com padres de
NO2
2 derivados dinitrofenilados dos diferentes aminocidos.
F
1-fluor-2,4-dinitrobenzeno
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Cloreto de dansil + peptdeo dansil-peptdeo HCl

dansil-aminocido (resduo N-terminal) + aminocidos livres

H 3C CH3
N
O dansil-aminocido fortemente fluorescente. Pode ser detectado e
dosado em concentraes muito menor que os dinitrofenil-aminocidos.

O S O
Cl

Cloreto de Dansil

Resduo Carboxila-terminal

Utilizando a enzima carboxipeptidase que hidrolisa a ligao peptdica a partir da ponta

carboxila-terminal da cadeia.
Determinando qual aminocido liberado em primeiro lugar pela ao da carboxipeptidase,
identifica-se o resduo C-terminal no polipeptdeo.
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3 Etapa: Fragmentao da cadeia polipeptdica (hidrlise seletiva)

Tripsina - hidrolisa as ligaes peptdicas das quais participa a carboxila de resduos de

arginina ou lisina.
Um polipeptdeo com cinco resduos de arginina e/ou lisina dever produzir seis peptdeos
menores. Com exceo de um, todos tero arginina ou lisina na posio C-terminal.

Quimotripsina - hidrolisa as ligaes peptdicas cujo grupo carboxila pertence a resduos de

fenilalanina, triptofano e tirosina.

2 cromatografia
Mapa peptdico - Separao dos fragmentos
produzidos por cromatografia de troca inica
em coluna, por eletroforese em papel ou por origem
cromatografia em duas dimenses


1 eletroforese

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4 Etapa: Determinao da seqncia dos fragmentos peptdicos

O mtodo de degradao de Edman marca e remove apenas o resduo N-terminal de

peptdeos, deixando intacta todas as outras ligaes peptdicas.
Aps a remoo e identificao do resduo N-terminal, o novo resduo N-terminal exposto
pode ser marcado e removido pela repetio da mesma reao.
Desta maneira, resduo a resduo, a degradao de Edman pode elucidar a seqncia inteira
de aminocidos de um peptdeo.

Fenilisotiocianato + peptdeo OH feniltiocarbamoil-peptdeo HCl

feniltiohidantona (derivado do resduo N-terminal) + peptdeo original (sem o resduo N-terminal)

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O resduo de aminocido
N-terminal na
feniltiohidantona
identificado por
cromatografia.
Seqncias contendo at
20 aminocidos podem ser
facilmente identificadas.

Permanece,

Permanece, entretanto,
entretanto, oo problema
problema de
de determinar
determinar como
como esses
esses fragmentos
fragmentos so
so
arranjados
arranjados na
na cadeia
cadeia polipeptdica
polipeptdica original.
original.
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5 Etapa: Fragmentao da cadeia polipeptdica por um segundo mtodo

Brometo de Cianognio - quebra apenas as ligaes peptdicas nas quais o grupo carboxila
pertence ao resduo metionina.
Assim, se o polipeptdeo contem 8 resduos de metionina, a quebra com o brometo de cianognio
dever produzir nove fragmentos peptdicos. Os fragmentos so separados por eletroforese ou
cromatografia

Temos agora dois grupos de fragmentos peptdicos, um obtido pela ao da tripsina e outro
pela quebra qumica com o brometo de cianognio.

6 Etapa: Ordenao dos fragmentos peptdicos atravs da determinao de superposies

A superposio de pores dos peptdeos obtidos na 2 fragmentao indica a ordem

correta dos peptdeos obtidos na 1 fragmentao.

s vezes a 2 quebra falha em estabelecer superposies para dois ou mais peptdeos da 1

quebra. Neste caso, uma terceira ou mesmo quarta quebra por mtodos diferentes deve ser
utilizada.
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Arranjo dos peptdeos em sua ordem correta, pelas sobreposies

Exemplo: Resultados obtidos utilizando hidrlises seletivas com tripsina e quimotripsina.

Resduos terminais: N-terminal = Ser
C-terminal = Gli
Fragmentos da 1 quebra (c/ tripsina): Fragmentos da 2 quebra (c/quimotripsina):
Ser-Asn-Tre-Trp-Arg Ser-Asn-Tre-Trp
Tyr-Cys-Arg Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe
Phe-Asp-Gli Asp-Gli
Leu-Ile-Lys Arg-Val-Lys-Tyr
Val-Lys

1 grupo de fragmentos
Ser-Asn-Tre-Trp-Arg
Val-Lys
Tyr-Cys-Arg

2 grupo de fragmentos Leu-Ile-Lys
Ser-Asn-Tre-Trp Phe-Asp-Gli
Arg-Val-Lys-Tyr
Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe
Asp-Gli

Seqncia deduzida

Ser-Asn-Tre-Trp-Arg-Val-Lys-Tyr-Cys-Arg-Leu-Ile-Lys-Phe-Asp-Gli
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Especificidade de alguns mtodos importantes de fragmentao seletiva de

cadeias polipeptdicas

Tratamento Ponto de quebra

Tripsina Lisina, Arginina (extremidade C-terminal)

Quimotripsina Fenilalanina, Triptofano, Tirosina (extremidade C-terminal)

Pepsina Fenilalanina, Triptofano, Tirosina e outros

(extremidade N-terminal)

Termolisina Leucina, isoleucina, valina (extremidade N-terminal)

Broneto de Metionina (extremidade C-terminal)

Cianognio