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Protenas
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Protenas
Estruturas conformacionais
So resultantes das foras de ligao entre os diferentes segmentos da cadeia
polipeptdica e freqentemente envolvem grupamentos funcionais das cadeias laterais.

Estrutura secundria
As rotaes em torno das ligaes adjacentes ligao peptdica originam essencialmente
dois tipos de estrutura: as hlices e as folhas pregueadas.

Estabilizao das conformaes

Tanto as hlices como as folhas pregueadas so estabilizadas por pontes de hidrognio

que se estabelecem entre o oxignio do grupo carbonila (C=O) de determinados
aminocidos e o hidrognio do grupo amina (N-H) de outros aminocidos.
Nas hlices, estes grupos pertencem mesma cadeia polipeptdica (segmentos peptdicos
adjacentes); nas folhas pregueadas estes grupos pertencem a cadeias diferentes (ou
mesma cadeia depois da cadeia ter se dobrado).
As estruturas dos diferentes aminocidos influenciam a adoo, pela cadeia, de um
determinado tipo de estrutura secundria, isto , existe uma correlao entre seqncia
e conformao.
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O cido glutmico, a alanina e a leucina do principalmente origem hlices, enquanto

a valina e a isoleucina originam folhas pregueadas.

Prolina, glicina e asparagina causam reverses na cadeia, atravs das qual a cadeia
polipeptdica dobra 180.

Para a formao de hlices (a mais freqente, com 3,6 resduos de aminocidos) a

rotao ocorre no mesmo sentido; para a formao de folhas pregueadas, os ngulos
de toro tm sinal contrrio.

Ligaes por pontes

As folhas pregueadas so: de hidrognio entre
resduos da mesma
paralelas quando as cadeias cadeia
polipeptdicas esto
dispostas paralelamente no
mesmo sentido;
Ligaes por
antiparalelas quando esto pontes de
em sentidos opostos. hidrognio
entre cadeias
ou segmentos
polipeptdicos
diferentes

hlice Folha pregueada

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Estrutura terciria
Este nvel de estrutura corresponde conformao tridimensional das cadeias
polipeptdicas e fundamental para a atividade biolgica.

Enquanto a estrutura secundria determinada por interaes de grupos R prximos

entre si, a estrutura terciria conferida pela interao a longa distncia na seqncia
de aminocidos da cadeia.

Resduos de aminocidos muito distanciados uns dos outros, na seqncia, podem se

encontrar prximos devido aos enrolamentos e formar, desse modo, regies
indispensveis ao funcionamento da protena - por exemplo, o centro ativo das enzimas.

Foras que estabilizam a estrutura

terciria

Pontes de hidrognio entre grupos R

de resduos pertencentes a alas
adjacentes
Atrao inica entre grupos R com
cargas eltricas opostas
Interaes hidrofbicas
Ligaes dissulfeto
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Estrutura quaternria
Corresponde a associaes, quase sempre reversveis, mantidas por ligaes fracas
(no covalente) entre vrias cadeias polipeptdicas idnticas ou diferentes.
A estrutura quaternria designa o arranjo de subunidades polipeptdicas (monmeros).
A protena , portanto oligomrica sendo, por exemplo, um dmero se for constituda
por duas subunidades ou um tetrmero se for constituda por quatro subunidades.

Observao: O nmero de cadeias polipeptdicas de uma protena oligomrica pode ser avaliado
pela determinao do nmero de resduos N-terminal existente na molcula de protena.
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Estrutura da toxina diftrica

Apresenta segmentos em hlice, em folha

-pregueada e sem estrutura regular.

Desnaturao
As protenas sofrem desnaturao em decorrncia de alteraes na sua estrutura
conformacional.

Na desnaturao no ocorre o rompimento das ligaes covalentes do esqueleto da

cadeia polipeptdica, ou seja, a estrutura primria da protena mantida. Entretanto,
as alteraes no seu arranjo espacial resultam na perda da atividade biolgica.

A desnaturao pode ser provocada por:

Calor Solutos (ex: uria, etc.)
Valores extremos de pH Detergentes
Solventes orgnicos (ex: etanol, acetona, etc.) Agitao vigorosa
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Classe Exemplo
Classificao das
protenas de Enzimas Ribonucleases
Tripsina
acordo com a
funo biolgica Protenas transportadoras Hemoglobina
Lipoprotenas

Protenas nutritivas e de reserva Ovoalbumina (ovo)

Casena (leite)

Protenas contrteis ou de movimento Actina

Miosina
Tubulina

Protenas estruturais Colgeno

Elastina
Queratina
Fibrona

Protenas de defesa Fibrinognio

Trombina
Veneno de serpente
Toxinas bacterianas

Protenas reguladoras Insulina

Hormnio de crescimento
Repressores
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Classificao das protenas de acordo com a forma

Protenas globulares
Com cadeia(s) polipeptdica(s) fortemente
enrolada em forma globular ou esfrica.
Usualmente solvel em sistemas aquosos e
se difundem facilmente.

Protenas globulares so quase todas as

enzimas, as protenas de transporte, os
anticorpos e as protenas de reserva
nutritiva.

Protenas fibrosas
Com cadeia(s) polipeptdica(s) estendida ao
longo de um eixo. So insolveis em gua,
compridas e filamentosas. A maioria tem
funo estrutural.

Protenas fibrosas tpicas so: a queratina,

o colgeno e a fibrona. Incluem, tambm,
as protenas que participam de processos
contrteis como a actina e miosina.
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Aminocido Citocromo Quimotripsinognio

Composio em humano* bovino**
aminocidos de duas Ala 6 22
protenas Arg 2 4
Asn 5 15
Asp 3 8
Cys 2 10
Gln 2 10
Os nmeros representam
Glu 8 5
resduos de cada aminocido,
Gly 13 23
por molcula de protena
His 3 2
Ile 8 10
Leu 6 19
Lys 18 14
Met 3 2
Phe 3 6
Pro 4 9
Ser 2 28
Thr 7 23
Trp 1 8
Tyr 5 4
Val 3 23
Total 104 245
* protena mitocondrial transportadora de eltrons.
** precursor inativo da enzima digestiva quimotripsina.
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Protenas Conjugadas

Classe Grupo prosttico* Exemplo

Lipoprotenas Lipdeos Lipoprotena do sangue
Glicoprotenas Carboidratos -globulina do sangue
Fosfoprotenas Grupos fosfato Casena do leite
Hemoprotenas Heme (ferroporfirina) Hemoglobina
Flavoprotenas Nucleotdeos de flavina Desidrogenase succnica

Metaloprotenas Ferro Ferritina

Zinco Desidrogenase alcolica

* poro de uma protena conjugada no constituda por aminocidos.

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Caractersticas moleculares de algumas protenas

Peso N. de N. de
Molecular Resduos Cadeias
Insulina (bovina) 5.733 51 2*
Ribonuclease (pncreas bovino) 12.640 124 1
Lisozima (clara de ovo) 13.930 129 1
Mioglobina (corao eqino) 16.890 153 1
Quimotripsina (pncreas bovino) 22.600 241 3*
Hemoglobina (humana) 64.500 574 4*
Albumina do soro (humana) 68.500 550 1
Hexoquinase (levedura) 96.000 800 4*
- globulina (cavalo) 149.900 1.250 4*
Desidrogenase glutmica (fgado bovino) 1.000.000 8.300 40*

* protenas oligomricas (duas ou mais cadeias polipeptdicas).

Observao:
Peso molecular (protenas simples) 110 = Nmero de resduos de aminocidos
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Trabalhando com protenas

Para estudar uma protena necessrio em primeiro lugar separar esta protena das demais.
Uma preparao pura essencial para que as propriedades e possveis atividades possam ser
determinadas.

A fonte de uma protena geralmente um tecido ou clula microbiana. O primeiro passo

romper a clula e liberar o material intracelular, numa soluo chamada de extrato bruto.

Para o rompimento da clula so utilizadas tcnicas como a homogeneizao, sonicao (uso

de ondas sonoras), ciclos de congelamento e descongelamento, detergentes (se a protena em
questo estiver solidamente acoplada a uma membrana), entre outras.

Aps o rompimento, a centrifugao diferencial utilizada para preparar fraes sub-celulares

ou para isolar organelas especficas.

A seguir so utilizadas tcnicas preliminares de separao de protenas. Essas tcnicas em

geral no resultaro em uma amostra pura, mas tem a importante tarefa de preparar o
homogenato bruto para procedimentos mais eficientes.

Os mtodos clssicos para separao de protenas utilizam propriedades que variam de uma
protena para outra, como tamanho, carga e propriedades ligantes. Alguns mtodos modernos
incluem clonagem de DNA e seqenciamento genmico.
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Separao e Purificao de Protenas

Homogeneizao e
Centrifugao Diferencial 600 rpm
Homogenato peneirado
para remover o tecido
conjuntivo e os vasos
O homogeneizador um tubo de O tubo se sanguneos
move
ensaio de parede espessa atravs do lentamente
para cima e
qual passa um mbolo bem ajustado. para baixo pilo de
enquanto o teflon
A centrifugao diferencial utilizada pilo gira

para separar componentes celulares. Homogenato de

Centrifugar o homogenato a
600 g x 10 minutos
tecido e sacarose
A tcnica leva em considerao as (modo em
tampo de
diferentes velocidades de sacarose 0,25M)

sedimentao de vrias organelas de

Sobrenadante 1
diferentes formatos, tamanhos e Centrifugar sobrenadante
1 a 15.000 g x 5 minutos
densidade em uma soluo.
Ncleos e clulas
medida que o homogenato celular no rompidas
submetido a foras centrfugas (g)
crescentes, diferentes componentes Sobrenadante 2
celulares so precipitados. Centrifugar
sobrenadante
2 a 100.000 g
Se a protena desejada no se Mitocndrias,
lisossomos e
x 60 minutos

encontra no precipitado, ele corpsculos

descartado e o sobrenadante
centrifugado a uma velocidade maior. Sobrenadante 3: frao solvel
do citoplasma (citosol)

Se a protena em questo for

Ribossomos e microssomos,
solvel, ao final do procedimento j fragmentos do retculo
endoplasmtico, complexo
estar parcialmente purificada. de Golgi e membrana
plasmtica
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Tcnicas preliminares de separao de protenas

Salting out
As protenas, contidas nas fraes sub-celulares ou organelas, so freqentemente submetidas
a uma purificao bruta com base na solubilidade. A solubilidade de protenas geralmente
diminuda em altas concentraes de sal, um efeito denominado salting out (adio de sal). A
adio de certos sais em altas quantidades pode precipitar seletivamente algumas protenas,
enquanto outras permanecem em soluo.
As protenas apresentam solubilidades diferentes em compostos polares e inicos, e
permanecem solveis por causa da sua interao com a gua.
Quando o sulfato de amnio, (NH4)2 SO4, (reagente mais utilizado nesta etapa) adicionado a
uma soluo de protenas, uma parte da gua removida da protena para formar ligaes on-
dipolo com os sais. Com menos gua disponvel para hidratar as protenas, elas comeam a
interagir entre si por meio de ligaes hidrofbicas. A uma quantidade definida de sulfato de
amnio, um precipitado que contem protenas formado. Essas protenas so centrifugadas e,
se forem protenas contaminantes, so descartadas.
A seguir, mais sal adicionado e um conjunto diferente de protenas, que pode conter a
protena em questo, precipitar. Este precipitado coletado por centrifugao e guardado.
A quantidade de sulfato de amnio normalmente medida em comparao com uma soluo
saturada a 100%. Um procedimento comum consiste em levar a soluo a cerca de 40% de
saturao e centrifugar o precipitado que se forma. Depois mais sal adicionado ao
sobrenadante, normalmente a um nvel de 60% a 70% de saturao, e o novo precipitado
formado separado por centrifugao.
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Dilise
Uma membrana (tubo de dilise ou papel celofane) contendo a soluo de protena e
outros solutos permite que a gua e solutos pequenos, como sais (NaCl; (NH4)2SO4;
etc.) e acares (glicose; etc.), passem livremente atravs dela. No permite, porm,
a passagem de solutos grandes como as protenas.

O tubo de dilise contendo a mistura de molculas de protena (azul) e de molculas

pequenas (vermelhas) imerso em um volume grande de soluo tampo (a).
Como a membrana semipermevel permite a passagem apenas das molculas pequenas,
sua concentrao dentro e fora do tubo tende a se igualar (b).
Aps vrias trocas de tampo (c), restam apenas as molculas de protena dentro do tubo
de dilise (d).
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Mtodos cromatogrficos utilizados para purificao de protenas

Coluna Cromatogrfica - Diversos mtodos de fracionamento de protenas fazem uso de
coluna cromatogrfica, e exploram as diferenas de carga, tamanho, especificidade de
ligao e outras propriedades das protenas.

Os elementos padres de uma coluna de

cromatografia incluem um material slido e
poroso, a matriz, que preenche a coluna (fase
estacionria); e uma soluo, a fase mvel, que
flui (ou elui) atravs da matriz.
A soluo que atravessa a coluna retirada na
base, o efluente, e constantemente reposta no
topo a partir de um reservatrio.
A soluo de protena a ser separada assentada
no topo da coluna e atravessa a matriz slida por
percolao. As protenas migram atravs da
coluna e so retardadas em diferentes graus de
intensidade, de acordo com as diferentes
interaes com o material da matriz.
Diferentes tipos de protenas (A, B e C) iro
gradualmente se separando uma das outras,
formando bandas. A migrao mais rpida ou
mais devagar dependendo das propriedades
individuais das protenas.
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Cromatografia de excluso por tamanho

Separa protenas de acordo com o tamanho e tambm chamada de filtrao em gel
ou peneira molecular.

A matriz composta de partculas de gel com

ligaes cruzadas contendo poros ou cavidades
de tamanho especfico.
As partculas, normalmente em forma de esferas,
so polmeros de carboidratos, como a dextrana
(Sephadex) e a agarose (Sepharose), ou de
poliacrilamida (Bio-Gel)
A estrutura de ligao cruzada desses polmeros
produz poros no material. A extenso das
ligaes cruzadas pode ser controlada para
selecionar um tamanho de poro desejado.
Uma mistura de protenas aplicada na coluna .
As protenas com molcula pequena podem
penetrar no interior das esferas, porm as
protenas maiores no o fazem.
medida que o solvente flui pela coluna as
molculas pequenas de protena penetram nas
esferas e so retardadas.
As molculas grandes de protena emergem
primeiro da coluna.
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Cromatografia de troca inica

Explora as diferenas e magnitudes da carga eltrica lquida de protenas em um
determinado pH. A matriz constituda por um polmero sinttico (resina).

A resina de troca inica um ligante que pode

conter carga positiva ou negativa. Uma resina
carregada negativamente um trocador catinico
(+) e uma resina carregada positivamente um
trocador aninico (-).
A coluna equilibrada com tampo de pH e fora
inica adequadas, desta forma, a resina de troca
se liga a contra-ons. Uma resina de troca catinica
normalmente se liga a ons Na+ ou K+ e um
trocador aninico normalmente se liga a ons Cl-.
Uma mistura de protenas assentada na coluna
para eluir atravs dela.
As protenas com carga lquida oposta carga
lquida do trocador ficaro na coluna, trocando de
lugar com os contra-ons ligados. As protenas sem
carga lquida ou com carga lquida igual do
trocador iro eluir.
Depois que todas as protenas no ligadas so
eludas, o eluente mudar para um tampo com
um pH que remova a carga nas protenas ou para
um tampo com uma maior concentrao de sal.
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Exemplo: Resina carregada com grupos sulfnicos trocadora de ctions

A mistura de protenas (ou de aminocidos) deve estar em soluo cida. Portanto, so
ctions com carga lquida positiva, porm, com diferentes graus de ionizao.

stios aninicos

+ NH3-CHR1-COOH
SO3 Na+
+ NH3-CHR2-COOH troca de ctions
+ NH3-CHR3-COOH
+ NH3-CHR4-COOH
SO3 Na+

partcula SO3 + NH3-CHR1-COOH

de resina
+ 2 Na+
SO3 + NH3-CHR3-COOH

Aminocidos com maior carga positiva (lisina, arginina e histidina) deslocam, com mais
facilidade, o Na+ da resina e so ligados mais fortemente.
Aminocidos com menor quantidade de carga positiva (cidos glutmico e asprtico) se ligam
com a menor intensidade.
Todos os demais aminocidos tm quantidade intermediria de carga positiva.
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Cromatografia de Afinidade
Separa as protenas por suas propriedades especficas de ligao.

A caracterstica diferenciadora o polmero da

matriz se unir de forma covalente a algum
composto, chamado de ligante, que se une
especificamente, tambm, protena desejada.
As outras protenas da amostra, que no se ligam
matriz, podem ser facilmente eludas com
tampo.
A protena ligada pode ser eluda da coluna ao
serem adicionadas altas concentraes do ligante
ao eluente, que compete pela ligao da protena
com a fase estacionria. A protena se une ao
ligante na fase mvel e recuperada no efluente.
A interao protena-ligante tambm pode ser
interrompida por uma soluo contendo alta
concentrao de sal, que enfraquece a ligao da
protena ao ligante da matriz, interferindo com as
interaes inicas.

Exemplo: Se a funo biolgica de uma

protena de interesse necessita de ATP, ento,
usando-se ATP como ligante cria-se uma
afinidade com a matriz. Quando a soluo de
protenas se move atravs da coluna, as
protenas dependentes de ATP (incluindo a
protena de interesse) se ligam matriz.
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Eletroforese
A eletroforese se baseia na movimentao de partculas em um campo eltrico, em
direo a um eletrodo de carga oposta.

Eletroforese em acetato de celulose

Uma mistura de protenas (A, B e C)

aplicada sobre uma tira de papel ou acetato
de celulose, umedecida com tampo de pH
conhecido.

A tira colocada em um equipamento

apropriado e um campo eltrico aplicado
ao sistema (a).

As protenas migram de sua posio inicial

para os plos, de acordo com a carga que
apresentam no pH do tampo utilizado (b).

Depois de algum tempo, a eletroforese

interrompida e a posio das protenas
revelada (c).
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Pontos isoeltricos de algumas protenas

Protenas pI Protenas pI

Pepsina < 1,0 Hemoglobina 6,8

Ovoalbumina 4,6 Mioglobina 7,0
Soroalbumina 4,9 Quimotripsinognio 9,5
Urease 5,0 Citocromo C 10,7
-lactoglobulina 5,2 Lisozima 11,0
-globulina 6,6
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Eletroforese em gel de agarose ou de poliacrilamida

Uma molcula se desloca em uma velocidade proporcional sua densidade de

carga total, tamanho e forma.
As amostras so aplicadas em poos na parte superior do gel. Molculas carregadas
negativamente migram atravs da matriz do gel em direo ao nodo, em resposta
ao campo eltrico aplicado. A mobilidade das molculas pequenas maior do que a
das grandes com a mesma densidade de carga.

Aps a eletroforese, as molculas

separadas so visualizadas por
meio de tcnicas de colorao, de
fluorescncia ou por tcnicas
radiogrficas.
O pH no gel deve ser alto o
suficiente de forma que
praticamente todas as protenas
possuam carga lquida negativa e
se movam em direo ao nodo
quando a voltagem aplicada.
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Exemplo: Eletroforese em gel de poliacrilamida da purificao de uma protena

de Escherichia coli.
A amostra aplicada e uma corrente eltrica atravessa o meio. Aps a separao das
protenas, o gel corado para revelar as posies das protenas.

Diferentes amostras so
aplicadas em depresses (poos)
no topo do gel. As protenas se
movem no gel quando um
campo eltrico ligado.
As protenas podem ser
visualizadas, aps a eletroforese,
por tratamento do gel com um
corante (ex: Coomassie blue).
Cada banda no gel representa
uma protena diferente,
protenas menores se movem
mais rapidamente que as
protenas maiores e so
localizadas prximo a base do (a) (b)
gel.

A primeira raia mostra uma srie de padres de protenas de massa conhecida, que servem de
marcadores de peso molecular. As duas raias seguintes mostram a protena antes e aps a sua
sntese ser induzida. A quarta raia mostra a protena no extrato celular bruto. As raias
subseqentes mostram a protena aps sucessivas etapas de purificao. A protena purificada
uma cadeia polipeptdica (Mr 38.000).