PREPARASI MEDIA KULJAR

BAB 1

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Salah satu metode perbanyakan tanaman adalah melalui kultur jaringan yang
memanfaatkan dua prinsip utama yaitu bahan tanam yang bersifat
totipotensi dan budidaya yang terkendali. Penggunaan kultur jaringan
mempunyai kelebihan mampu memproduksi bibit yang seragam dalam jumlah banyak
yang seragam dan dalam waktu yang relatif singkat. Oleh karena itu kultur jaringan
sering dijadikan solusi sebagai metode penyimpanan plasma nutfah yang tidak
membutuhkan tempat yang besar.
Penggunaan bahan totipotensi saja tidak cukup mendukung
keberhasilan kegiatan dalam kultur jaringan. Ada beberapa faktor yang
mempengaruhi keberhasilan kultur jaringan antara lain eksplan, media tumbuh, zat
pengatur tumbuh dan lingkungan (George and Shcrrington, 1984). Media pertumbuhan
jaringan berisi komponen esesial dan optional yang memiliki konsentrasi sesuai sehingga
pertumbuhan tanaman menjadi optimal. Ketepatan konsentrasi ini menyangkut pada
ketersediaan nutrisi bagi eksplan tanaman. Kelebihan nutrisi dari tanaman akan
menyebabkan tanaman mengalami keracunan unsur hara. Oleh karena itu, pembuatan larutan
stock dan sterilisasi media dianggap penting untuk diketahui sebagai sarana penenunjang
kebutuhan informasi akan kultur jaringan.
Selain media kultur jaringan, salah satu pembatas dalam keberhasilan
kultur jaringan adalah kontaminasi yang dapat terjadi pada setiap saat
dalam masa kultur. Kontaminasi dapat berasal dari faktor internal
maupun eksternal. Untuk itu diperlukannya pemahaman mengenai
pentingnya sterilisasi alat dalam mencegah terjadinya kontaminasi.
Demikian telah dijabarkan, pentingnya memahami dan mampu
melaksanakan mengenai prinsip-prinsip sterilisasi alat agar setiap
mahasiswa mampu melaksanakan kultur jaringan dengan berhasil.

B. Tujuan
1. Mengetahui fungsi alat yang digunakan dalam kultur jaringan
2. Mengetahui prosedur melakukan sterilisasi alat dan media
3. Mengetahui cara pembuatan media dan larutan stok kultur jaringan tanaman
 BAB II

KAJIAN PUSTAKA
A. Kultur Jaringan
Kultur jaringan merupakan salah satu cara perbanyakan tanaman secara vegetatif.
Prinsip kerja dari kultur jaringan adalah dengan mengisolasi bagian tanaman seperti daun,
mata tunas, serta menumbuhkan bagian-bagian tersebut dalam media buatan secara aseptik
yang kaya nutrisi dan zat pengatur tumbuh dalam wadah tertutup yang tembus cahaya
sehingga bagian tanaman dapat memperbanyak diri dan bergenerasi menjadi tanaman
lengkap.
B. Sterilisasi dalam Kultur Jaringan
Berhasil tidaknya kultur jaringan sangat bergantung pada keadaan
aseptic atau sterilnya komponen-komponen kultur jaringan yang
meliputi eksplan (bagian tanaman yang akan dikultur), peralatan yang
digunakan, pekerja yang melakukan kultur maupun ruangan yang
digunakan untuk kultur jaringan (Moeso Suryowinoto, 2000) . Sterilisasi
merupakan suatu proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan
atau benda dari semua mikroorganisme (Yunus et al., 2010). Sterilisasi
penting dilakukan untuk mencegah kontaminasi yang akan membawa
kegagalan bagi keberhasilan kultur jaringan. Prosedur sterilisasi perlu
dilakukan pada lingkungan kerja, sterilisasi alat, media dan bahan
tanam.
Macam-macam sterilisasi dapat dilakukan dengan tiga cara yang
dapat dipakai sesuai kebutuhan. Pertama, sterilisasi secara mekanik
(filtrasi) dengan cara penyaringan untuk mensterilisasikan cairan yang
mudah rusak jika terkena panas atau mudah menguap, misalnya pada
larutan enzim, hormon, dan antibiotik. Sterilisasi ini menggunakan
suatu saringan berpori sangat kecil (0,2 atau 0,45 mikron) sehingga
mikroba tertahan pada saringan tersebut. Kedua sterilisasi secara fisik
melalui pemanasan dan penyinaran, dan ketiga sterilisasi secara
kimiawi dengan senyawa desinfektan contohnya alkohol dan detergen
(Yunus et al., 2010).
 Alat yang digunakan untuk mensterilkan peralatan kultur jaringan
adalah autoklaf. Cara kerjanya hampir sama dengan alat masak
pressure cooker sebab alat ini merupakan sebuah bejana yang dapat
diisi air dan ditutup rapat-rapat. Sumber pemanasan autoklaf ada yang
dari listrik, tetapi ada pula yang harus diletakkan diatas kompor gas.
Jika alat ini dipanaskan maka akan terdapat uap air yang tidak dapat
keluar karena bejana tertutup rapat sehingga tekanan normal. Kenaikan
tekanan uap ini akan menyebabkan air mendidih diatas 100 %. Apabila
tekanan uap ini tidak diatur maka akan bertambah tinggi (Nugroho dan
Sudito, 2000).
Sterilisasi peralatan yang terbuat dari gelas seperti
erlenmeyer, test tube, petridish disterilkan dengan autoclave. Sebelum
digunakan peralatan dicuci dan disikat dengan detergen kemudian
dibilas air tawar, tunggu kering, setelah itu ditutup rapat dengan
alumunium foil dan plastik Setelah itu diatur rapi dalam autoclave,
autoclave ditutup rapat dan dioperasikan pada suhu 121C dengan
tekanan 1 atm, selama 30 menit (Sari dan Abdul, 2012).

Widarto (2000) mengatakan bahwa banyak peralatan yang

digunakan dalam sistem kultur jaringan, tetapi pada dasarnya
dikelompokan menjadi dua golongan yaitu:
1. Peralatan ringan, meliputi pinset, pisau, gelas ukur, gelas piala,
erlemeyer, botol media, petridish, pipet, gunting, corong, panic,
kompor gas, dll
2. Peralatan berat, meliputi mesin penggojok, LAF (Laminar Air Flow),
timbangan listrik atau analitik, mesin distilator, oven, mikroskop, pH
meter, pendingin ruangan, autoclave dan entkas.
C. Media Kultur Jaringan
Kultur jaringan tanaman dipengaruji oleh beberapa faktor yang sangat menentukan
keberhasilannya yaitu eksplan, media tumbuh, zat pengatur tumbuh dan lingkungan.
Untuk menumbuhkan jaringan atau organ tanaman secara in vitro dibutuhkan suatu
media yang terdiri dari komponen esensial seperti garam-garam organik, sumber karbon
dan energi, vitamin dan zat pengatur tumbuh. (George and Shcrrington, 1984).
Media yang dipergunakan pada kultur in vitro tumbuhan ada bermacam-macam.
Pemilihan media tergantung pada jenis tanaman yang digunakan, selera, tujuan serta
perhitungan masing-masing peneliti. Isi dan komposisi dari media kultur dirancang
secara khusus untuk tujuan yang berbeda. Pada dasarnya tidak ada satu macam media
kultur yang dapat memberikan pertumbuhan optimal untuk semua sel, penggantian
media atau salah satu komponen media seringkali diperlukan untuk merespon setiap
tipe pertumbuhan dari satu macam eksplan.
Terdapat beberapa media yang biasa digunakan untuk proses kultur jaringan, antara
lain media MS (Murashige dan Skoog) atau LS singkatan dari Linsmaier dan Skoog
merupakan media yang sangat banyak digunakan untuk kultur kalus dan regenerasi
berbagai tanaman, media ini mengandung garam-garam mineral dengan konsentrasi
tinggi dan senyawa N dalam bentuk ammonium dan nitrat. Media B5 (Gamborg) banyak
digunakan untuk kultur suspensi sel tanaman leguminosae. Media Nitsch & Nitsch, N6
(Chu) banyak digunakan untuk serealia dan tanaman lain. Media WPM (Hendaryono,
1994) untuk kultur jaringan tanaman berkayu; Vacin dan Went (VW) dan Knudson C
banyak digunakan untuk anggrek; media Kao dan Michayluk digunakan untuk kultur
protoplas Cruciferae, Gramineae dan Leguminosae.
Untuk membuat media kultur jaringan, biasanya menimbang setiap bahan kimia
yang terdapat oada resep media dasar. Bahan kimia media seperti hara makro, sukrosa,
agar-agar dapat ditimbang biasa, sementara untuk bahan media seperti hara mikro, besi,
vitamin, hormon dan myo-inositol harus dilakukan dengan cara membuat larutan stok
karena ukurannya yang sangat kecil. Hal ini dilakuakan supaya takaran sesuai dengan
resep yang ditentukan. Untuk pembuatan larutan stok harus cermat, jangan terlalu pekat
karena dapat terjadi pengendapan apabila disimpan dalam lemari es. Bila terjadi
pengendapan harus dipanaskan dahulu sebelum digunakan dan bila terkontaminasi
organisme tidak boleh digunakan lagi.
Komponen dasar dari medium kultur dapat bermacam-macam, secara umum
medium kultur jaringan harus mengandung bahan-bahan antara lain garam anorganik, zat
organik, hormon, bahan pemadat dan bahan tambahan misalnya arang aktif.
1. Garam-garam anorganik:
a. Unsur makro : C, H, O, N, S, P, K, Ca dan Mg
Kebutuhan garam-garam mineral di dalam jaringan kurang lebih sama
dengan tanaman utuh. Garam-garam mineral merupakan gabungan antara unsur
esensial makro dan mikro. Konsentrasi optimum dari tiap-tiap komponen untuk
mencapai kecepatan pertumbuhan maksimal sangat bervariasi. Unsur makro
dibutuhkan dalam jumlah cukup besar, pada umumnya diberikan dalam bentuk
persenyawaan. Gunawan, (1987) menyebutkan beberapa persenyawaan
makronutrien yang umum digunakan pada medium kultur jaringan, antara lain:
 KNO3; NH4NO3; Ca(NO3).4H2O; NaNO3; CaCl2. 2H2O; MgSO2. 7H2O;
KCl; KH2PO4; NH4H2PO4; NaH2PO4. 2H2O; Na2SO4; (NH4)2SO4; NH4Cl;
K2SO4 (Mengel, K and E.A Kirkby, 1987).
b. Unsur Mikro : Cl, B, Mo, Zn, Cu, Fe dan Co
Unsur-unsur mikronutrien diperlukan dalam jumlah yang sangat sedikit,
maka stok mikronutrien harus dibuat dalam satu wadah sebagai stok campuran.
Pembuatan stok mikronutrien biasanya dilakukan berkali-kali dari konsentrasi
aslinya. Hal ini bertujuan supaya penimbangan komponen tidak mengalami
kesulitan sebab berat bahan kimia tersebut sangat kecil. Fungsi dari unsur hara
mikro belum diketahui secara pasti, tetapi tidak adanya zat-zat ini dapat
menyebabkan kelainan pertumbuhan. Air dan bahan kimia yang tingkat
kemurniannya rendah seringkali terkontaminasi oleh unsur hara mikro. Bentuk
persenyawaan hara mikro yang umum digunakan pada beberapa medium kultur
menurut Gunawan, 1987 (1984) adalah: MnSO4.4H2O; ZnSO4. 7H2O; H3BO3;
KI; CuSO4. 5H2O; NaMoO4. 2H2O; CoCl2. 6H2O; FeCl3. 6H2O; Fe III citrate;
FeSO4.7H2O; NaFeEDTA; Na2EDTA. 2H2O; Fe(SO4)3; Fe III tartrate.
2. Zat-zat organic
Zat-zat organik adalah persenyawaan yang mengandung karbon, ditambahkan
pada medium kultur jaringan berupa gula, myo-Inositol, vitamin, asam-asam amino
dan zat pengatur tumbuh. Zat-zat organik tersebut biasanya tidak diberikan pada
tanaman karena tanaman dapat mensintesis sendiri, tetapi pada kultur in vitro, karena
eksplan yang digunakan umumnya berukuran sangat kecil dan tidak marnpu
mensintesis sendiri semua zat-zat organik tersebut, maka zat-zat organik harus
ditambahkan pada medium. Terdapat beberapa zat organik yang digunakan dalam
kultur jaringan, antara lain:
a. Gula
Tumbuhan dialam bebas mencukupi kebutuhan gula dengan mengasimilasi
CO2 pada proses fotosintesis, dengan adanya klorofil dan sinar matahari, bahan
glukosa kemudian dijadikan pati, selulosa dan persenyawaan-persenyawaan lain.
Pada kultur in vitro, sel dan jaringan tumbuhan belum sempurna dalam
melakukan asimilasi fotoautotrof, sehingga diperlukan gula sebagai sumber
karbon dan enersi. Selain sebagai sumber enersi bagi sel dan jaringan, gula juga
berfungsi sebagai penjaga keseimbangan tekanan osmotik potensial didalam
medium. Gula pada umumnya diberikan pada medium kultur berupa sukrosa atau
 komponen-komponennya seperti monosakarida glukosa atau fruktosa. Sukrosa
pada medium kultur ditambahkan sebanyak 30 gr/l (Coleman, 2003).
Glukosa atau D-glukosa biasanya ditambahkan dengan konsentrasi 20 - 30
gr/l, tergantung dari jenis eksplan. Sukrosa ternyata lebih berpengaruh dalam
perkembangan kalus, sedangkan pengaruhnya terhadap organogenesis belum
dapat dipastikan (Gunawan, 1987, 1984). Pada kultur mikrospora beberapa
spesies tanaman digunakan maltosa, maltosa dihidrolisis lebih lambat
dibandingkan dengan sukrosa, ini memberi pengaruh yang lebih baik pada
mikrospora yaitu dapat memacu embryogenesis (Coleman, 2003).
b. Myo-Inositol
Myo-Inositol ditambahkan pada medium untuk membantu diferensiasi dan
pertumbuhan jaringan. Myo-Inositol ikut serta dalam beberapa reaksi metabolik
penting yang berhubungan dengan pembelahan sel. Myo-Inositol merupakan
perantara pada perubahan glukosa menjadi asam galakturonat juga sebagai prazat
untuk pektin dan penyusun dinding sel.
c. Vitamin
Vitamin ditambahkan pada medium untuk mempercepat pertumbuhan,
diferensiasi kalus. Vitamin berfungsi sebagai kofaktor atau bagian dari molekul
kofaktor dari reaksi-reaksi ensimatis penting, vitamin juga berfungsi protektif.
Seperti halnya zat pengatur tumbuh, vitamin juga mempengaruhi (menstimulasi)
inisiasi, pertumbuhan dan perkembangan akar.
Gunawan, 1987 (1984) memasukan beberapa macam vitamin yang umum
digunakan pada berbagai medium dasar, antara lain: Thiamin-HCl, Nicotinic acid,
Pyridoxin-HCl, Ca Dpanthothenate, Folic acid, Choline chloride, Riboflavin,
yang kesemuanya merupakan anggota dari vitamin B kompleks. Ascorbic acid
dan adenin juga sering ditambahkan pada medium.
Vitamin labil terhadap pemanasan, dianjurkan untuk selalu menggunakan
filter steril jika akan ditambahkan pada medium. Thiamin merupakan vitamin
yang esensial terdapat pada hampir semua medium kultur jaringan tumbuhan,
cenderung mempercepat pembelahan sel pada meristem akar tetapi tidak
berpengaruh terhadap pemanjangan sel. Thiamin merupakan bagian prostetik
yang terdapat didalam sel, berperan sebagai koenzim dalam reaksi yang
menghasilkan enersi dari karbohidrat dan memindahkan enersi. Thiamin
 diberikan dalam jumlah yang bervariasi dari kirakira 0,1 sampai 30 mg/l (Doods
dan Roberts, 1983).
Nicotinic acid (niacin) penting dalam reaksi-reaksi ensimatis disamping
peranannya sebagai prekursor dari beberapa alkaloid. Ascorbic acid sering
ditambahkan pada medium, terutama untuk mencegah terjadinya pencoklatan
pada permukaan irisan jaringan yang disebabkan karena terjadinya reaksi oksidasi
senyawa polyphenol menjadi quinon yang berwarna coklat, vitamin disini
berfungsi sebagai antioksidan.

d. Asam-asam amino
Asam amino merupakan sumber N organik , penyusun protein dan asam
nukleat, lebih cepat diambil oleh sel dan jaringan tanaman dari pada N anorganik
didalam medium kultur jaringan. Adapun asam amino yang umum ditambahkan
pada medium adalah: Glutamine, Glycine, L-Cyteine, L-Arginine, L-Aspartic
acid, L-Methionine.
e. Zat pengatur tumbuh
Selain nutrisi, zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen
medium bagi pertumbuhan, perkembangan dan diferensiasi. Zat pengatur tumbuh
aktif pada konsentrasi rendah dan diproduksi didalam tubuh tanaman itu sendiri
(endogen). Untuk keperluan kultur jaringan telah dibuat zat pengatur tumbuh
sintetik, tanpa zat pengatur tumbuh pertumbuhan eksplan akan terhambat bahkan
mungkin tidak tumbuh sama sekali. Zat pengatur tumbuh dikelompokan dalam
beberapa grup: Auksin, Sitokinin, Gibberellin, Abscisic acid, dan Ethylene.
3. Bahan pemadat
Gelling agent digunakan untuk memadatkan medium, bahan pemadat yang
sering digunakan pada medium adalah agar-agar (7-10 g/l), bahan pemadat lain
(Jarang digunakan) adalah gelrite, gelrite lebih bening dari agar-agar. Pemakaian
gelrite juga lebih sedikit untuk mencapai kepadatan yang sama dengan agar, yaitu 2
g/l. Agarose juga sering digunakan untuk kultur protoplas dan mikrospora.
Penggunaan bahan pemadat ini megandung banyak kelemahan:
1. Hanya sebagian eksplan yang kontak dengan medium
2. Terjadi gradient nutrisi yang tidak sama
3. Mobilitas hara menjadi kurang baik
 4. Terjadi akumulasi zat-zat toksik yang dikeluarkan oleh eksplan.
Agar merupakan campuran polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies
algae. Kandungan agar meliputi unsur Ca, Mg, K dan Na dalam jumlah yang sedikit.
Keuntungan penggunaan agar adalah agar membeku pada temperatur 45 0 C dan
mencair pada temperatur 1000 C. Sehingga dalam kisaran temperatur kultur agar akan
berada dalam keadaan beku yang stabil, tidak dicerna oleh enzim yang dihasilkan
tanaman dan tidak bereaksi dengan senyawa-senyawa penyusun media (Gunawan,
1987).

BAB III
METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat
Praktikuma cara pengenalan dan sterilisasi alat untuk kultur
jaringan dilaksanakan pada hari Selasa, 7 Maret 2017 puku
l0.20 sampai dengan 11.00 WIB. Sementara itu praktikum pembuatan
media kultur jaringan dilakukakn pada hari selasa tanggal 13 Maret
2017 puku l0.20 sampai dengan 11.00 WIB. Kedua praktikum tersebut
dilaksanakan di Laboratorium Kultur Jaringan, Jurusan Biologi, Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Negeri
Yogyakarta
B. Alat dan Bahan

Alat sterilisasi: Bahan pembuatan stok makronutrient :

1. Botol jam 7. Detergen 1. NH4NO3 8250 mg
2. Botol You C 8. Kertas 2. KNO3 9500 mg
payung 3. CaCl2.2H2O 2200 mg
3. Botol kecap 9. Plastik 4. MgSO 4. 7H 2 O 1850 mg
bening 5. KH2.PO4 850 mg
4. Pinset 10. Karet 6. Aquadest
5. Cawan petri 11. Rak Bahan pembuatan stok MS :
simpan 7. Myo-inositol 100 mg
6. Pisau scalpel 12. 8. Sukrose 30 g
9. Iron stok 5 ml
autoclave
10. Mikronutrien stok 5 ml
11. Vitamin stok 4 ml
Alat pembuatan media :
12. Stok hormon 2 ml
1. Timbangan analitik
13. Aquadest 1250 ml
2. Erlenmeyer 500 cc, 1000 cc
3. Gelas ukur 100 cc Bahan pembuatan stok agar kosong:
4. Pengaduk 1. Agar
5. Pengaduk magnetik 2. Aquadest
6. Pipet
7. Kompor gas
8. Alumunium foil
9. Kertas Label
 10. pH stick

C. Cara Kerja
Cara kerja sterilisasi:
Pertama menyiapkan alat dan bahan yang akan digunakan
untuk mensterilisasi serta alat yang akan di sterilisasi. Kemudian
cuci alat-alat yang akan disterilisasi menggunakan detergen lalu
dibilas dengan air bersih.Alat-alat kemudian diletakkan di rak
penyimpanan sambil di kering anginkan sampai kering. Kemudian
membungkus alat-alat kultur seperti petridish, pisau scalpel dan
pinset dengan kertas payungdan dikuatkan dengan melilitkan karet
gelang.Sedangkan alat-alat seperti botol jam, botol You C dan botol
kecap, mulut botol ditutup dengan plastik bening dan diikat
dengan karet gelang. Kemudian memasukkan botol-botoldan alat-
alat kultur yang telah dibungkus plastik dan kertas payung ke
dalam autoklaf untuk proses sterilisasi pada suhu 121 C, tekanan
1,5 kg/cm2 selama 20 menit.Setelah selesai, alat-alat kultur
disimpan dalam rak penyimpanan.

Cara pembuatan stok makronutrient:

Pertama menimbang bahan-bahan kimia untuk pembuatan makronutrien sesuai
yang tertera di subbab bahan. Bahan-bahan diletakkan dalam wadah alumunium foil.
Selanjutnya masukkan 250 ml aquadest pada erlenmeyer. Masukkan satu bahan
kemudian diaduk menggunakan stirer, setelah larut kemudian masukkan bahan
selanjutnya. Begitu seterusnya hingga seluruh bahan terlarut.
Cara pembuatan stok MS:
Pertama menimbang bahan-bahan kimia untuk pembuatan MS sesuai yang
tertera di subbab bahan. Bahan-bahan diletakkan dalam wadah alumunium foil.
Selanjutnya masukkan 500 ml aquadest pada erlenmeyer. Masukkan 10 ml larutan
stok makronutrien kemudian aduk merata menggunakan stirer. Kemudian masukkan
satu persatu bahan lainnya, selanjutnya diaduk menggunakan stirer, setelah larut
kemudian masukkan bahan lainnya. Begitu seterusnya hingga seluruh bahan terlarut.
Tambahkan aquadest hingga larutan mencapai 800 ml. Ukur pH larutan, Jika kurang
dari 6 tambahkan NaOH, jika lebih dari 6 tambahkan HCl. Tambahkan agar 6,5 gr
pada larutan. Selanjutnya tambahkan aquadest hingga volumr mencapai 1000 ml.
Panaskan larutan media di atas kompor sambil diaduk hingga mendidih dan agar
larut. Tuang ke botol kultur secepatnya kemudian tutup dengan plastik dan di karet
 bagian leher. selanjutnya diberi label. Sterilisasi dalam autoclav dengan temperatur
121oC selama 15 menit.
Cara pembuatan stok agar kosong :
Pertama menimbang agar sebanyak 4,5 gram dan dimasukkan ke dapam
erlenmeyer yang berisi 500 ml aquadest. Panaskan larutan media di atas kompor
sambil diaduk hingga mendidih dan agar larut. Tuang ke botol kultur secepatnya
kemudian tutup dengan plastik dan di karet bagian leher. selanjutnya diberi label.
Sterilisasi dalam autoclav dengan temperatur 121oC selama 15 menit.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pengenalan alat kultur jaringann
Tabel 1. Pengenalan alat dan fungsi pada kultur jaringan
Nama Gambar Fungsi
Autokla Mensterilisasi alat-alat dan
f media kultur.
Autoclave bekerja berdasarkan
prinsip tekanan panas uap air.
Mikroba akan mati apabila
berada pada kondisi lingkungan
panas tinggi.

Lamina Sebagai tempat

r Air
Flow penanaman eksplan
(LAF) dalam kultur jaringan.
Menurut Sriyantidan Ari
Wijayani (2012) prinsip
kerja LAF dengan
mengalirkan arus udara
yang lamina air kedalam
almari penabur melalui
saringan yang besar
dengan ukuran mesh 0,22-
0,24 mikron. Bakteri dan
jamur ditahan oleh
saringan ini, sehingga
udara yang masuk
kedalam LAF sudah steril
dan membuat ruangan
menjadi steril pula.
Sterilisasi LAF dengan
disemprot alkohol
70% dibagian dalamnya.
Lalu pintu LAF ditutup dan
lampu ultraviolet
 (UV) dinyalakan selama
sampai 1 jam.

Magnet Digunakan untuk

ic stirer
menghomogenkan larutan
media yang akan dibuat.
Botol Sebagai wadah penyimpan
you c media dan tempat penanaman
yang eksplan
telah di
sterilis
asi

Botol, Pinset sebagai alat untuk

pinset, memindahkan eksplan
pisau Pisau scalpel sebagai alat untuk
scalpel, memotong eksplan yang akan
cawan ditanam.
petri Cawan petri sebagai tempat
yang untuk memotongeksplan yang
telah akan ditanam pada media
disterili
sasi

B. Sterilisasi Alat Kultur Jaringan

Praktikum pengenalan dan sterilisasi alat dilakukan pada selasa, 7
maret 2017 di laboratorium kultur jaringan FMIPA Universitas Negeri
Yogyakarta. Tujuan praktikum ini adalah mengetahui fungsi alat yang
akan digunakan dalam kultur jaringan serta mengetahui prosedur
sterilisasi alat kultur jaringan. Alat-alat tanam yang disterilisasi
meliputi pinset, scapel, petridish, botol-botolkultur yaitu botol kecap,
botol jam dan botol you c. Alat dan bahan yang digunakan untuk
mensterilisasi adalah detergen, kertas payung, plastik, karet gelang,
rak penyimpanan dan autoklaf.
Cara kerja yang dilakukan adalah pertama menyiapkan alat dan
bahan yang akan digunakan untuk mensterilisasi serta alat yang akan
di sterilisasi. Kemudian cuci alat-alat yang akan disterilisasi
menggunakan detergen lalu dibilas dengan air bersih. Alat-alat
kemudian diletakkan di rak penyimpanan sambil di kering anginkan
sampai kering. Kemudian membungkus alat-alat kultur seperti
petridish, pisau scalpel dan pinset dengan kertas payung dan
dikuatkan dengan melilitkan karet gelang. Sedangkan alat-alat seperti
botol jam, botol You C dan botol kecap, mulut botol ditutup dengan
plastik bening dan diikat dengan karet gelang. Kemudian memasukkan
botol-botoldan alat-alat kultur yang telah dibungkus plastik dan kertas
payung ke dalam autoklaf untuk proses sterilisasi pada suhu 121 C,
tekanan 1,5 kg/cm2 selama 20 menit. Setelah selesai, alat-alat kultur
disimpan dalam rak penyimpanan
Syarat utama dalam kegiatan kultur jaringan adalah kondisi yang
aseptis atau steril untuk semua komponen dalam kultur jaringan.
Kegiatan kultur diawali dengan sterilisasi alat dan bahan. Sterilisasi
alat dan bahan adalah perlakuan untuk menjadikan suatu alat atau
bahan yang bebas dari mikroorganisme yang tidak diingikan seperti
jamur dan bakteri. Lingkungan di sekitar kita banyak terdapat spora
dari bakteri dan jamur yang berukuran sangat kecil dan ringan
sehingga mudah terbang pada aliran udara yang sangat lemah
sekalipun. Bila spora ini kontak dengan media kultur maka spora akan
tumbuh dengan cepat. Dalam beberapa hari spora akan tumbuh
menjadi koloni yang tumbuh lebih cepat dan mematikan jaringan
tanaman. Oleh karena itu perlu adanya streilisasi alat dan media agar
bebas dari mikroba.
Sterilisasi pada alat tanam dilakukan dengan sterilisasi kimiawi
dengan mencuci alat-alat menggunakan sabun yang mengandung
bahan kimiawi. Sterilisasi fisik melalui pemanasan menggunakan
autoklaf maupun sterilisasi mekanik dan kimiawi.
Kegagalan sterilisasi bisa diakibatkan adanya salah satu atau
beberapa kunci pada autoklaf yang tidak menutup dengan sempurna
sehingga tekanan yang timbul dari autoklaf bocor ke luar.Kegagalan
sterilisasi akibat sebelum tekanan dalam autoklaf menurun dan semua
air yang ada di autoklaf belum habis namun autoklaf sudah terbuka
 sehingga dapat menimbulkan ledakan atau kerusakan klep pengatur
tekanan pada autoklaf. Kegagalan sterilisasi dapat dihindari dengan
jalan mengikuti semua ketentuan dan prosedur pelaksanaan sterilisasi
meliputi penggunaan alat dan pelaksanaan prosedur sterilisasi.
C. Media Kultur jaringan
Pada praktikum kultur jaringan, praktikan hanya membuat media MS sebanyak 1 L
dan media agar kosong sebanyak 500 ml. Pembuatan media menggunakan resep tertentu
yang memiliki ukuran tersendiri. Oleh karena itu setiap kali pembuatan harus
menimbang bahan-bahan sesuai dengan kebutuhan. Hal ini tentu saja tidak efektif,
misalnya pada suatu waktu hanya dibutuhkan media dalam jumlah yang sedikit. Maka
otomatis bahan yang ditimbang juga lebih sedikit. Sehingga akan mengurangi ketepatan
bahan-bahan yang digunakan. Sebagai jalan keluarnya dibuatlah larutan stok yang dapat
digunakan untuk 40, 50 bahkan 100 liter medium.
Larutan stok dibuat menjadi beberapa kelompok : stok besi (iron), stok
mikronutrien, stok vitamin dan stok hormon. Yang perlu diperhatikan dalam pembuatan
larutan stok adalah kepekatannya. Larutan stok yang dibuat terlalu pekat akan mengalami
pengendapan sejalan dengan lama waktu penyimpanan, jika hal ini terjadi stok harus
dilarutkan dengan pemanasan terlebih dahulu sebelum digunakan. Larutan stok harus
disimpan dalam lemari es (kulkas). Larutan stok kadang-kadang terkontaminasi,
ditumbuhi mikroorganisme, stok yang terkontarninasi tidak dapat dipergunakan lagi. Jadi
aseptik teknik harus selalu diperhatikan dalam pembuatan media dan tidak dianjurkan
untuk membuat media terlalu banyak.
Pembuatan larutan stok MS diawali dengan membuat stok makronutrien. Pertama
praktikan menimbang bahan sesuai resep yang telah ditetapkan. Bahan-bahan kemudian
dimasukkan dalam 150 ml aquadest. Bahan dimasukkan satu persatu dan diaduk sebelum
dimasukkan bahan selanjutnya. Pengadukan dilakukan menggunakan stirer supaya lebih
cepat dan menghemat tenaga. Setelah selesai dengan semua bahan pastikan untuk
menutup tabung penyimpanan dengan alumunium foil dan diberi label.
Setelah pembuatan larutan stok makronutrien selanjutnya praktikan membuat
media MS yang terdiri dari Myo-inositol, Sukrosa, Iron, Mikronutrienr, Vitamin san
hormon. Myo-Inositol ditambahkan pada medium untuk membantu diferensiasi
danpertumbuhan jaringan. Myo-Inositol ikut serta dalam beberapa reaksi metabolik
penting yang berhubungan dengan pembelahan sel. Myo-Inositol merupakan perantara
pada perubahan glukosa menjadi asam galakturonat juga sebagai prazat untuk pektin dan
penyusun dinding sel.
Sukrosa yang digunakan dalam pembuatan media MS adalah gula bermerk Gulaku.
Pada kultur in vitro, sel dan jaringan tumbuhan belum sempurna dalam melakukan
asimilasi fotoautotrof, sehingga diperlukan gula sebagai sumber karbon dan energi.
Selain sebagai sumber enersi bagi sel dan jaringan, gula juga berfungsi sebagai penjaga
keseimbangan tekanan osmotik potensial didalam medium.
Vitamin ditambahkan pada medium untuk mempercepat pertumbuhan, diferensiasi
kalus. Vitamin berfungsi sebagai kofaktor atau bagian dari molekul kofaktor dari reaksi-
reaksi ensimatis penting, vitamin juga berfungsi protektif. Seperti halnya zat pengatur
tumbuh, vitamin juga mempengaruhi (menstimulasi) inisiasi, pertumbuhan dan
perkembangan akar.
Selain nutrisi, zat pengatur tumbuh sangat diperlukan sebagai komponen medium
bagi pertumbuhan, perkembangan dan diferensiasi. Zat pengatur tumbuh aktif pada
konsentrasi rendah dan diproduksi didalam tubuh tanaman itu sendiri (endogen). Untuk
keperluan kultur jaringan telah dibuat zat pengatur tumbuh sintetik, tanpa zat pengatur
tumbuh pertumbuhan eksplan akan terhambat bahkan mungkin tidak tumbuh sama
sekali.
Bahan-bahan tersebut selanjutnya dimasukkan ke dalam aquadest. Air merupakan
zat terbanyak pada tubuh tumbuhan, oleh karena itu air juga merupakan bagian terbesar
didalam medium kultur. Air selain sebagai bahan untuk membentuk material tubuh, juga
sebagai medium untuk reaksireaksi kimia dan fisika. Air juga berguna untuk transport
dan distribusi zat-zat yang terlarut didalamnya. Pada medium kultur jaringan digunakan
aquadest yang sudah mengalami demineralisasi, deionisasi dan didestilasi.
Larutan aquadest dan bahan kimia kemudian diukur pHnya. Apabila pH kurang
dari 6 ditambahkan NaOH hingga menjadi 6. Apabila pH lebih dari 6 ditambahkan HCl
hingga menjadi 6. Media kultur jaringan dibuat ber-pH 6 agar menyesuaikan dengan
kondisi tanaman pada kondisi aslinya. Media yang sesuai memungkinkan tanaman
tumbuh dengan optimal.
Larutan MS kemudian diberi pemadat berupa agar. Agar merupakan campuran
polisakarida yang diperoleh dari beberapa spesies algae. Kandungan agar meliputi unsur Ca,
Mg, K dan Na dalam jumlah yang sedikit. Keuntungan penggunaan agar adalah agar
membeku pada temperatur 450 C dan mencair pada temperatur 100 0 C. Sehingga dalam
kisaran temperatur kultur agar akan berada dalam keadaan beku yang stabil, tidak dicerna
oleh enzim yang dihasilkan tanaman dan tidak bereaksi dengan senyawa-senyawa penyusun
media (Gunawan, 1987).
 MS kemudian diletakkan dalam botol jam panjang dan ditutup menggunakan
alumunium foil atau plastik yang diikat kuat menggunakan karet. Penutupan ini berfungsi
untuk menghindari kontaminasi agar dari mikroorganisme yang ada di udara. MS yang sudah
jadi kemudian di sterilisasi menggunakan autoklaf bersuhu 121 oC selama 15 menit. Hal ini
juga berfungsi untuk membuang kontaminasi dari bakteri dan jamur.
Selain pembuatan media MS, praktikan juga membuat agar kosong. Media agar
kososng dibuat deengan menimbang agar 4,5 gram dalam aquadest 500 ml. agar dipanaskan
hingga mendidih. Selanjutnya larutan agar kosong dimasukkan ke dalam 50 botol jam tinggi
dan di sterilisasi menggunakan autooklaf pada suhu 121 oC selama 15 menit.

BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN
Kesimpulan:
1. Alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan dan fungsinya antara
lain:
a. Autoklaf sebagai alat untuk melakukan sterilisasi secara fisik
b. Laminar Air Flow sebagai tempat ketika penanaman eksplan
c. Botol kultur sebagai tempat ditanamnya eksplan
d. Pinset sebagai alat memindahkan eksplan
e. Pisau scalpel sebagai alat pemotong eksplan
f. Cawan petri sebagai wadah untuk pemotongan eksplan
2. Alat-alat yang digunakan dalam kultur jaringan harus dalam keadaan
steril agar media tanam dapat bebas dari mikroba yang dapat
mengganggu pertumbuhan eksplan. Sterilisasi merupakan suatu
proses atau kegiatan membebaskan suatu bahan atau benda dari
semua mikroorganisme. Sterilisasi yang digunakan pada praktikum ini
dengan menggunakan senyawa kimia dan pemanasan autoklaf.
Sterilisasi alat menggunakan autoklaf selama 20 menit pada suhu 120
C. Alat-alat yang disterilisasi yaitu botol kulturdan dissecting kit
(pinset, pisau scalpel dan petridish).
3. Pada praktikum kultur jaringan, praktikan hanya membuat media MS sebanyak 1 L dan
media agar kosong sebanyak 500 ml. Pembuatan media menggunakan resep tertentu
yang memiliki ukuran tersendiri. Oleh karena itu setiap kali pembuatan harus
menimbang bahan-bahan sesuai dengan kebutuhan. Hal ini tentu saja tidak efektif,
misalnya pada suatu waktu hanya dibutuhkan media dalam jumlah yang sedikit. Maka
 otomatis bahan yang ditimbang juga lebih sedikit. Sehingga akan mengurangi ketepatan
bahan-bahan yang digunakan.
Saran
Praktikan hendaknya fokus dalam praktikum sehingga tidak ada bahan
yang terlewatkan ataupun salah dalam pembagian agar

DAFTAR PUSTAKA

Coleman, J. O. D., Evans, D.E., and Kearns, A. 2003. Plant Cell Culture. New York: BIOS
Scientific Publishers
Gunawan L W. 1987. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Laboratorium Kultur Jaringan tanaman
Pusat Bioteknologi
Hendaryono, D P S dan Ari Wijayani. 1994. Teknik Kultur jaringan. Pengenalan
dan petunjuk perbanyakan tanaman secara vegetatif. Jakarta: Penerbit
kanisius
Mengel, K and E.A Kirkby. 1987. Principles of plant nutrition. Switzerland:
International Potash Institute.
Nugroho, A danSudito.2000. TeknikKulturJaringan. Jakarta:
PenebarSwadaya.
Sari, I. P., dan Abdul Manan. 2012. Pola Pertumbuhan Nannochloropsis
Oculatapada Kultur Skala Laboratorium, Intermediet, dan
Massal. Jurnal Ilmiah Perikanan dan Kelautan Vol. 4(2):123-127.
Suryowinoto, Moeso. 2000. Pemuliaan Tanaman Secara In-Vitro. Kanisius,
Yogyakarta
Yunus, Ahmad, Samanhudi, Amalia T Sakya, MujiRahayu.
2010. Teknologi KulturJaringan. Surakarta: UNS Press.