ssa Monti
Avrete visto nelle prime lezioni di immunologia che esistono due tipi di
immunit: l'immunit naturale o innata e l'immunit specifica.
L'immunit innata o natura una risposta del nostro organismo verso dei
patogeni che cercano di entrare e questa risposta gi pronta, predisposta
nell'organismo e affronta il patogeno in pochissimo tempo. Si tratta di una
risposta quindi molto precoce e si basa su meccanismi ripetitivi e aspecifici. La
risposta innata sempre uguale, si attivano gli stessi meccanismi, non si
modifica durante contatti con lo stesso patogeno, si dice che stereotipata
quindi se noi entriamo di nuovo in contatto con lo stesso patogeno si attivano
le stesse cellule e si producono componenti che svolgono la loro funzione nella
stessa maniera.
risposta rapida nei confronti del patogeno. Abbiamo visto poche ore.
Avrete fatto con il prof annunziato le barriere chimico fisiche dell'immunit
naturale, queste sono gi pronte e nel giro di pochi minuti sono in grado
di combattere i patogeni. Successivamente nel giro di poche ore vengono
attivate le cellule dell'immunit innata che sono: macrofagi, cellule
dendritiche, cellule natural killer che sono cellule dotate di recettori
particolari in grado di riconoscere dei pattern molecolari che si trovano su
numerosi patogeni.
Risposta lenta. Prima che compaiano i primi segni di una risposta specifica
devono passare diversi giorni dal contatto con il patogeno.
Forte risposta di memoria. Ogni volta che questa risposta viene attivata
rimangono nel nostro organismo delle cellule di memoria pronte a
risvegliarsi per rispondere di nuovo allo stesso patogeno.
I linfociti B a cosa servono? Servono a riconoscere con il loro recettore BCR dei
patogeni extracellulari quindi che vivono e si moltiplicano fuori dalle cellule.
Quando i patogeni entrano nell'organismo i linfociti B attraverso BCR possono
legarli e questo legame comporta l'attivazione dei linfociti B, la loro
moltiplicazione e differenziazione in plasmacellule e la produzione di anticorpi.
Come meccanismo effettore deputato all'eliminazione del patogeno vengono
rilasciati gli anticorpi che non sono altro che il recettore rilasciato ed quindi
specifico per il patogeno. Gli anticorpi si legano alla superficie del patogeno, lo
opsonizzano e lo rendono suscettibile all'attivazione di meccanismi deputati
all'eliminazione. Quando un patogeno rivestito da anticorpi pu essere
fagocitato dai macrofagi, pu attivare la cascata del complemento dalla via
classica e quindi il patogeno viene distrutto con la formazione del poro che
porta alla lisi osmotica. Noi sappiamo per che i microbi possono anche
infettare le cellule del nostro organismo, prendiamo per esempio i virus: questi
entrano nelle cellule, si accrescono, si sviluppano, si riproducono e fuoriescono
e infettano altre cellule. indispensabile quindi che esistano delle forme di
immunit in grado di eliminare tutte le cellule che ad esempio vengono
infettate da virus e qui entra in gioco l'altra popolazione dei linfociti: i linfociti T
citotossici. Questi sono in grado di legare le cellule infettate e rilasciare delle
sostanze che mandano la cellula in apoptosi, ma come avviene il
riconoscimento? I linfociti T, sia citotossici che helper che i T, hanno bisogno
per essere attivati di riconoscere peptidi antigenici sulla superficie delle cellule
in associazione a molecole che appartengono all'organismo: molecole del
complesso maggiore di istocompatibilit. Vedete quindi come i linfociti T hanno
bisogno sempre di una cellula che presenti il peptide antigenico. I nostri
linfociti T citotossici devono riconoscere dei peptidi virali inseriti in molecole
del nostro organismo e solo con questo legame il linfocita si pu attivare e
trasformarsi in cellula effettrice e svolgere la sua funzione di protezione. Poi
abbiamo un'altra sotto popolazione di linfociti T che sono gli HELPER. Come
dice il nome questi linfociti aiutano, sono indispensabili nelle risposte
adattative perch coordinano le risposte specifiche e scelgono, attraverso il
tipo di citochina che producono, qual' la risposta pi adatta per eliminare quel
patogeno. Un ruolo importantissimo. Come funzionano? Come i linfociti T
citotossici anche loro hanno bisogno, per potersi attivare, di riconoscere peptidi
antigenici associati al complesso maggiore di istocompatibilit. Hanno bisogno
quindi di particolari cellule che fagocito i patogeni: macrofagi e cellule
dendritiche, che poi li digeriscono, li tagliano in peptidi e inseriscono questi
peptidi nella tasca del complesso maggiore di istocompatibilit e lo portano in
superficie per mostrarlo. Il recettore di questi linfociti T helper deve riconoscere
le molecole dentro il complesso, una volta avvenuto questo contatto i linfociti si
attivano e svolgono la loro funzione di dirigenti di orchestra producendo le
CITOCHINE. Le citochine sono dei mediatori solubili che servono per coordinare
le varie risposte. A seconda del tipo di citochina che questi linfociti T helper
producono avremo risposte diverse. Vengono prodotte citochine pro
infiammatorie quando si vuole appunto attivare l'infiammazione come
meccanismo effettore della risposta cellulo mediata, si stimolano i macrofagi,
nell'infiammazione cronica i linfociti T helper si attivano producendo grandi
quantit di interferono gamma che una citochina che va ad attivare i
macrofagi rendendoli pi citotossici e quindi pi in grado di eliminare il
patogeno. Oppure il linfocita T helper pu produrre citochine che possono
stimolare la risposta umorale: se capiscono che per eliminare quel patogeno
serve una risposta umorale stimolano i linfociti B a produrre una determinata
classe di anticorpi: quella pi adatta ad eliminare quel patogeno.
Ogni volta che c' un contatto con l'antigene si attiva una risposta specifica
che chiamata risposta primaria. Si dice risposta primaria quando un linfocita
naive, vergine, che non ha mai incontrato il suo antigene viene attivato. Questa
risposta raggiunge il massimo di produzione di anticorpi dopo un paio di
settimane. La risposta primaria caratterizzata anche dal produrre una
determinata classe di anticorpi: le IgM. Le IgM sono anticorpi pentamerici,
costituite da 5 unit base, che sono bravissimi ad attivare il complemento.
Come attivazione del complemento si ha un aumento della risposta innata.
Quando finalmente il patogeno viene debellato si ha la riduzione dei cloni, la
loro morte e si formano delle cellule della memoria. Se abbiamo un secondo
contatto con l'antigene le cellule della memoria, che sono in numero maggiore
rispetto alle cellule naive della risposta primaria, vengono attivate
immediatamente. Vedete che nel giro di pochissimi giorni si ha un aumento di
produzione di anticorpi e questa la risposta secondaria. La risposta
secondaria differisce da quella primaria sia quantitativamente che
qualitativamente, cosa vuol dire? Vedete che vengono prodotti pi anticorpi in
minor tempo e questi anticorpi sono diversi, sono pi affini, quindi nella
risposta secondaria aumenta l'affinit: si legano con maggior capacit al
patogeno, e in pi cambia la classe di anticorpi che viene prodotta: non
produciamo pi le IgM, ma produciamo la classe di anticorpi pi adatta ad
eliminare quel patogeno come possono essere le IVA, IgG, IgE. Naturalmente a
coordinare sempre queste modificazioni delle risposte umorali specifiche
giocano un ruolo importante i linfociti T helper.
Dal punto di vista didattico si trattano questi due tipi di immunit, adattativa e
naturale, separatamente ma in realt c' una stretta collaborazione tant' che
molti meccanismi effettori dell'immunit specifica non sono altro che
meccanismi dell'immunit innata ed ogni volta che abbiamo una risposta
innata abbiamo anche l'induzione di un processo dell'immunit adattativa. Ogni
volta che un patogeno entra nel nostro organismo e supera le barriere fisiche
dell'immunit naturale si attiva l'immunit innata con una risposta non
specifica dopo di che abbiamo l'induzione della risposta dell'immunit
specifica. Vedete che c' stretta collaborazione.
PATOLOGIA Lezione 18 20.10.2014 Prof.ssa Monti
Oggi parleremo degli anticorpi, della struttura e della loro funzione sia come
recettore dei linfociti B sia come molecole che vengono secrete per la fase
finale di attivazione del sistema immunitario. Abbiamo detto che le cellule
responsabili dell'immunit specifica sono:
i linfociti B
i linfociti T, i quali si suddividono a loro volta in
-linfociti T citotossici, cellule che attaccano direttamente le cellule
che sono state infettate da patogeni che vivono all'interno della
cellula, come i virus;
-linfociti T helper o CD4+, cellule responsabili di tutte le risposte
immunitarie perch a seconda di quale citochina producono
coordinano e organizzano le risposte specifiche sia producendo
mediatori che possono attivare le risposte umorali, sia producendo
dei mediatori che possono stimolare la risposta cellulo-mediata,
come l'attivazione dei macrofagi o l'attivazione dei linfociti T CD8+
Riconoscimento dell'antigene:
Su queste cellule esistono dei recettori specifici che sono indispensabili per la
loro attivazione nel riconoscere in maniera finemente specifica il patogeno o il
microorganismo o l'antigene.
I diversi linfociti riconoscono l'antigene in due modi differenti:
i linfociti B sono dotati di un recettore, anticorpi o BCR, in grado di
riconoscere gli antigeni in forma nativa e pu riconoscere antigeni di
diversa natura, pu cio riconoscere proteine, il DNA, zuccheri,
glicoproteine, lipidi... Hanno perci un maggior campo di riconoscimento.
i linfociti T sono dotati di un recettore chiamato TCR caratterizzato
dall'impossibilit di riconoscere direttamente gli antigeni ma
indispensabile che peptidi antigenici, cio sequenze amminoacidiche di
proteine, gli vengano mostrati da una cellula dell'organismo che funziona
da cellula presentante l'antigene o APC.
Questa la grande differenza tra queste due popolazioni linfocitarie; i B
riconoscono antigeni extracellulari in tutte le loro forme e strutture, i T invece
hanno bisogno di qualche cellula dell'organismo che gli prepari l'antigene che
deve essere riconosciuto e glielo mostri in associazione a molecole che fanno
parte dell'organismo che si chiamano molecole del complesso maggiore di
istocompatibilit.
Fase di riconoscimento:
Le molecole responsabili del riconoscimento degli antigeni sono:
anticorpi per l'immunit umorale
MHC (molecole del complesso maggiore di istocompatibilit)
TCR (T cell receptor) espresso direttamente dai linfociti T
Questi sono i tre tipi di recettori responsabili della fase di
riconoscimento.
GLI ANTICORPI
Gli anticorpi funzionano come recettori sui linfociti B e, una volta che
quest'ultimo viene attivato e ha quindi riconosciuto il suo antigene, va incontro
ad un'espansione clonale, la cellula cio si divide tante volte generando un
clone di tante cellule tutte uguali con lo stesso recettore e questo clone poi
differenzia in plasmacellule, cio cellule che producono l'anticorpo che avevano
sulla loro superficie come recettore; esiste quindi una forma secreta degli
anticorpi con la stessa specificit del recettore che si trovava sulla cellula che
ha riconosciuto l'antigene.
Gli anticorpi sono importanti sia nella prima fase di riconoscimento sia nelle
fasi finali cio nella fase effettrice quando gli anticorpi vengono secreti e vanno
a svolgere i loro compiti.
Nella fase di riconoscimento abbiamo l'anticorpo di membrana che riconosce
l'antigene, invece nella fase effettrice l'anticorpo libero, viene rilasciato nel
sangue o negli spazi interstiziali e pu andare a legarsi al patogeno che ha
evocato la risposta immunitaria.
I meccanismi che l'anticorpo secreto pu attivare, una volta che si lega
all'antigene, sono diversi; l'anticorpo pu:
neutralizzare microbi o prodotti microbici tossici. Se un microbo produce
delle tossine possiamo avere degli anticorpi che legano e bloccano la
funzione della tossina e non la rendono pi deleteria.
attivare il sistema del complemento (il complemento si attiva con 3
modalit ma le pi frequenti sono la modalit classica e alternativa. Se il
complemento si attiva con la presenza di anticorpi che hanno
opsonizzato il patogeno viene attivata la via classica.)
opsonizzare gli antigeni cio gli anticorpi si legano alla superficie del
patogeno con le parti specifiche, lasciando libero il frammento
cristallizzabile che verr riconosciuto da fagociti che sono ad esempio
granulociti neutrofili o macrofagi che sono dotati di un recettore specifico
in grado di riconoscere questa parte anticorpale. Il legame cono i fagociti
comporta l'induzione della fagocitosi e cos patogeni, microbi e antigeni
rivestiti di anticorpi opsonizzati, cio preparati al pasto, possono essere
mangiati dalle cellule che svolgono questa funzione.
indurre la citotossicit anticorpo dipendente. In questo caso abbiamo
sempre la produzione di anticorpi specifici che si legano al patogeno e
favoriscono il riconoscimento del patogeno, attraverso il riconoscimento
dell'anticorpo, e vengono rilasciate cellule che svolgono una attivit
citotossica. Cellule citotossiche dell'immunit naturale sono ad esempio
le cellule natural Killer che sono dotate di un particolare recettore in
grado di riconoscere gli anticorpi che hanno opsonizzato i patogeni; le NK
arrivano, riconoscono l'anticorpo sul patogeno e rilasciano in vicinanza di
questo patogeno sostanze tossiche che postano alla distruzione della
cellula infettata o del patogeno stesso.
Esperimento di Porter:
Come si capito quali fossero le funzioni delle diverse componenti degli
anticorpi? Per la prima volta furono messe in evidenzia le funzioni degli
anticorpi con l'esperimento di Porter nel 1962. la digestione delle IgG con
papaina e pepsina ha permesso di costruire un modello di struttura delle Ig.
Porter infatti prese delle IgG di conigli che era stato immunizzato con una
determinata proteina e tratt questi anticorpi quali la papaina e la pepsina che
si conosceva il livello al quale tagliavano questi anticorpi. Nel primo
esperimento prese gli anticorpi e li tratt con la papaina che va a tagliare le
IgG sopra la zona cerniera. Da questa digestione si formano tre parti:
due frammenti Fab
un frammento cristallizzabile (Fc)
Porter dimostr che i due frammenti fab che contenevano i domini variabili
erano in grado di riconoscere l'antigene, quindi la parte specifica dell'anticorpo
per la prima volta si dimostr essere quella amminoterminale che conteneva i
domini variabili sia della catena pesante sia della della catena leggera. Il
frammento Fc invece, cio la parte costante della catena pesante degli
anticorpi, era la responsabile di tutte le attivit effettrici. Tutto ci che
determina poi la fase effettrice cio l'attivazione del complemento,
l'opsonizzazione, l'attivazione della citotossicit... dipende tutto dal frammento
cristallizzabile costituito dagli ultimi 2 domini costanti della catena pesante.
Porter poi fece una controprova e pens di trattare delle IgG di ratto con un
altro enzima che la pepsina che taglia invece sotto la zona cerniera. Dalla
digestione con la pepsina si generano un unico frammento Fab2, costituito da
entrambe le braccia che contengono la parte variabile delle immunoglobuline,
mentre il frammento cristallizzabile viene completamente tutto degradato.
Mettendo a contatto il tutto con l'antigene osserv che il frammento Fab2
aveva una funzione specifica di riconoscimento dell'antigene, quindi
effettivamente il Fab che riconosce l'antigene e in questa situazione, in cui Fc
completamente degradato, non era possibile avere gli effetti della risposta
effettrice. In questo modo stato dimostrato che Fc che determina
l'attivazione dei meccanismi della fase effettrice.
Gli anticorpi esistono sia come recettori sia come molecole solubili.
Gli anticorpi che devono funzionare da recettori per l'antigene e quindi devono
rimanere ancorati alla superficie dei linfociti B, durante la loro sintesi, vengono
arricchiti di un peptide che viene legato all'estremit carbossilica dell'anticorpo,
il peptide M, un peptide idrofobico che non consente, al momento della
secrezione, quando la vescicola del Golgi viene trasportata verso la superficie
cellulare, la secrezione dell'anticorpo ma lo blocca sulla superficie della cellula.
Questo peptide M costituito da una zona idrofobica che si incastra nel doppio
strato lipidico e blocca l'anticorpo. In pi il peptide M dotato di una coda
citoplasmatica che resta all'interno del citoplasma del linfocita B e questa coda
citoplasmatica relativamente importante nella trasduzione del segnale di
attivazione, quando questo recettore si lega al patogeno.
Nel caso in cui la nostra cellula sia differenziata in plasmacellula non viene
prodotto il peptide M ma verr prodotto invece il peptide S che una
sequenza di amminoacidi idrofilica che favorir, quando la vescicola dal Golgi si
porta verso le membrane, la secrezione degli anticorpi; non ci sar nessun
segmento che bloccher l'anticorpo sulla membrana.
Il passaggio da Ig di membrana a Ig di secrezione dipende da meccanismi di
splicing alternativo.
Sui linfociti naive troviamo due classi di recettori: le IgM e le IgG. Questi
recettori non sono in grado di trasdurre il segnale quando si legano allantigene
con le due braccia specifiche perch non presente nella molecola degli
anticorpi una coda citoplasmatica con la presenza degli enzimi in grado di
fosforilare e attivare tutta la cascata di trasduzione del segnale dellavvenuto
legame. Quindi sulla superficie dei linfociti B noi troviamo sempre affiancate al
recettore due molecole che appartengono anche queste alla superfamiglia
delle immunoglobuline che sono Ig-beta e Ig-alfa. Queste due molecole si
attivano quando gli anticorpi legano lantigene e hanno una coda
citoplasmatica che contiene particolari motivi, chiamati ITAM. Questi motivi
contengono tirosine che vengono fosforilate al momento del legame.
Lattivazione di queste due catene porta allavvio della cascata di trasduzione e
quindi di attivazione del linfocita B. Questo segnale non sufficiente ma
indispensabile per lattivazione dei linfociti B un secondo segnale. Questo per
quanto riguarda gli anticorpi che funzionano da recettore.
Poi una volta che il linfocita B stato attivato, si quindi moltiplicato, ha dato
origine a un clone di cellule, va incontro a una differenziazione, ovvero i linfociti
B diventano plasmacellule che secernono gli anticorpi specifici che avevano
sulla loro superficie e quindi abbiamo la produzione di grandi quantit di
anticorpi.
Vengono prodotte diverse classi di anticorpi (5 classi). Nelle risposte primarie,
cio nelle risposte umorali da primo contatto con lantigene, vengono prodotte
soprattutto delle IgM. Nei contatti successivi, nelle risposte secondarie, le IgM
invece vengono sostituite dalle altre classi di anticorpi: viene scelta, diciamo, la
classe migliore, pi capace di eliminare pi velocemente quellantigene.
Le IgA sono costituite dalla catena pesante alfa e ne esistono due sottotipi
(IgA1 e IgA2). Alfa-1 e alfa-2 differiscono soprattutto nella zona-cerniera, parte
importantissima soprattutto per il movimento nello spazio delle braccia
dellanticorpo. La zona-cerniera molto probabilmente si modificata perch le
IgA vengono prodotte soprattutto a livello delle mucose, soprattutto a livello
dellintestino, e quindi si formata una zona-cerniera resistente agli enzimi che
molti batteri possono produrre e che taglierebbero gli anticorpi che si trovano
nelle mucose. Nellevoluzione abbiamo quindi avuto un cambiamento nella
zona-cerniera della catena alfa per resistere a questo danno che potrebbe
essere esercitato dai batteri della flora intestinale.
Le IgA si trovano nel siero in piccola quantit; hanno emivita molto breve e si
ritrovano soprattutto nelle secrezioni corporee: a livello di mucose, lacrime,
saliva etc. Vengono secrete in forma dimerica o trimerica.
Le IgD vengono definite un relitto evoluzionario, di fatto non vengono
secrete: funzionano, quindi, principalmente solo da recettore sui linfociti B
naive. A livello del siero troviamo solo tracce di IgD, la secrezione di questa
classe non viene effettuata e non si sa bene eventualmente quale sarebbe
stata la sua funzione.
Le IgE sono anticorpi che si trovano in piccolissime quantit a livello del siero e
hanno emivita molto breve. Da un punto di vista dellimmunit, le IgE vengono
prodotte quando c uninfezione da parassiti, come ad esempio gli elminti (i
vermi) perch possono essere riconosciute, una volta opsonizzato il patogeno,
soltanto dai granulociti eosinofili, che hanno il recettore per il Fc delle IgE e
sono lunico tipo di cellule, con la secrezione dei granuli che contengono, di
ledere e di danneggiare la parete dei parassiti.
Questa la funzione fisiologica di questi anticorpi, poi esistono anche degli
aspetti patologici: le IgE sono anche coinvolte nelle allergie. Vengono prodotte
in organismi predisposti a produrre IgE per antigeni che, normalmente, nella
popolazione non danno risposte immunitarie. Il recettore per questi anticorpi si
trova anche su cellule responsabili dellinfiammazione, i mastociti. Il soggetto
allergico si sensibilizza; produce grandi quantit di IgE, che si legano alla
superficie del mastocita, dove restano legate fino al secondo contatto con lo
stesso antigene. Il legame dellantigene con il mastocita porta a
degranulazione del mastocita stesso; i granuli dei mastociti contengono
istamina (importantissimo mediatore solubile dellinfiammazione che agisce
su vasodilatazione e permeabilit); successivamente i mastociti, per sintesi de
novo producono anche i mediatori che derivano dalla. arachidonico che hanno
azione sul microcircolo, andando a indurre il processo infiammatorio.
Nelle IgA, oltre alla catena J, viene anche prodotto un ulteriore peptide, la
componente secretoria che serve a favorire la secrezione di questi anticorpi.
Le IgA vengono prodotte dai linfociti B che si trovano a livello delle zone linfoidi
dellapparato respiratorio, digerente, nella sottomucosa (es. placche del Peyer).
Le IgA sono le uniche capaci di legare il recettore poli-Ig che si trova sulla
parete baso-laterale delle cellule epiteliali. Tutte le volte che queste molecole si
legano al recettore vengono internalizzate in vescicole che attraversano tutta
la cellula per poi passare al polo opposto per liberare le IgA con la componente
secretoria nel lume. A questo punto le IgA svolgeranno la loro funzione:
saranno, ad esempio, in grado di bloccare il patogeno allesterno e ne
impediscono linternalizzazione.
Adesso andiamo a vedere il numero dei vari segmenti genici che troviamo nelle
catene (leggere o pesanti) i quali vanno a formare la regione di 110
amminoacidi che varia da anticorpo ad anticorpo.
Nella catena leggera K esistono almeno 40 segmenti genici che codificano per
la parte variabile V, non ci sono i segmenti di diversit D (poich caratterizzano
solo le catene pesanti) e ci sono 5 segmenti di giunzione J. Avremo quindi la
ricombinazione tra 40 e 5.
Per la catena Lambda abbiamo 30 segmenti variabili V e solo 4 segmenti di
giunzione J.
La catena pesante pi complessa perch abbiamo i segmenti di diversit: ci
sono quindi circa 40 segmenti V, 25 segmenti D e 6 segmenti di giunzione J.
Quali le modali p
determin la diversi
t d
er
repertori
are t el
o?
Il meccanismo principale che crea la
maggiore variabilit la "diversit combinatoria"
e quindi il processo dato dalla ricombinazione
somatica di diversi segmenti genici
(VJ o VDJ).
In secondo luogo abbiamo una diversit giunzionale: nei punti dove avviene
una ricombinazione possono essere aggiunti amminoacidi che creano diversit.
Infine una terza diversit per creare variabilit la diversit nell'associazione
tra la catena pesante e la catena leggera le quali si ricombinano tra loro, ma
ogni cellula produce una sua catena pesante e una sua catena leggera.
Tutti questi processi avvengono, nella prima fase della maturazione, all'interno
degli organi linfoidi centrali: midollo osseo per quanto riguarda i linfociti B e
timo per i linfociti T.
Esiste un ulteriore processo che crea variabilit nel repertorio anticorpale,
ovvero, lipermutazione somatica caratterizzata da mutazioni puntiformi a
livello della regione variabile degli anticorpi, specialmente nelle zone di
ipervariabilit. L'ipermutazione somatica viene indotta al livello degli organi
linfatici periferici nelle risposte secondarie quando vi il contatto con un
antigene estraneo o quando vi cooperazione con i linfociti T helper che
producono citochine le quali vanno a favorire la maturazione dell'affinit
tramite questo processo.
Questo processo molto ben ordinato e regolato perch dobbiamo evitare che
sulla stessa cellula si formino anticorpi con diversa specificit.
Come possibile questo?
Ci sono delle regole ben precise: quando il linfocita B nella fase pro-B inizia a
riarrangiare la catena pesante Mu, gli riarrangiamenti avverranno solo su un
allele e l'altro verr bloccato. Se questo riarrangiamento VDJ funzionante e
non ha problemi, il linfocita B esprimer sulla sua superficie un recettore e
passer nella fase pre-B. Una volta che viene attivato e espone sulla superficie
la catena, andr a inibire il riarrangiamento dell'altro allele facendo s che
questo non possa produrre VDJ. Per questo motivo ogni linfocita B ha un'unica
specificit.
Se, invece, sul primo allele il riarrangiamento VDJ non ha funzionato allora
viene stimolato il riarrangiamento sul secondo allele. In questa maniera si d
un'opportunit in pi per non perdere la cellula. Se funziona questa seconda
possibilit viene espresso il recettore con il frammento della catena leggera
surrogato sul linfocita Pro-B. Se, invece, non funziona anche il secondo VDJ
allora la cellula va in apoptosi e non possibile rimaneggiare.
Questo meccanismo di controllo del riarrangiamento e quindi l'inibizione
dell'allele non utilizzato si chiama "esclusione allelica" ed importante per
impedire la produzione di anticopri con la stessa specificit.
Esistono due enzimi, RAG1 e RAG2, che sono espressi soltanto nei linfociti in
fase di maturazione e fanno parte del complesso enzimatico responsabile della
ricombinazione VDJ. Questi enzimi riconoscono gli eptameri e i nonameri
separati da 12 e 23 e quindi riavvicinano due segmenti genici nella catena
leggera VJ, formano un loop con tutto il DNA frapposto e tagliano liberando
questo DNA circolare all'interno del citoplasma della cellula.
Una volta che RAG1 e RAG2 hanno tagliato il DNA, all'estremit delle sequenze
geniche V e J si formano dei legami fosfodiesterere e quindi una struttura a
forcina chiusa cos che non si lasci il DNA a singola catena libero. Intervengono
quindi degli enzimi di riparazione del DNA, come q70 e q80 che riconoscono la
rottura, si legano all'estremit del DNA tagliato dove sono presenti le forcine e
richiamano una proteina chinasi DNA dipendente (DNAPK). Questa proteina
attiva un altro enzima: Artemis che una endonucleasi che si occupa di
tagliare le forcine formando sequenze di DNA a singolo filamento. A questo
punto devono essere chiuse le rotture presenti sul filamento. In questi siti
interviene un enzima attivo solo nei linfociti B, la terminal deossinucleotidil
transferasi (TdT), che aggiunge nucleotidi in maniera casuale all'estremit dei
filamenti che sono stati tagliati quindi nei punti di giunzione tra i segmenti
genici; in questo caso parliamo "diversit giunzionale".
I frammenti di DNA formati vengono legati tra di loro grazie all'intervento di
una DNA ligasi, si riforma una doppia elica di DNA e quindi un gene che potr
essere tradotto in mRNA. I punti di taglio dove sono stati aggiunti casualmente
i nucleotidi le chiameremo zone di ipervariabilit (CDR3, CDR1)
La diversit giunzionale pu avvenire anche in maniera diversa in processi di
escissione di nucleotidi.
Variabilit per escissione: poich sulle estremit V e J possono intervenire
anche delle endonucleasi che vanno a tagliare una tripletta, al momento della
traduzione, abbiamo una sostituzione con un altro amminoacido. In tutti questi
processi possiamo avere delle modificazioni di lettura per cui si possono creare
triplette che non possono poi essere tradotte in amminoacido.
Sono stati fatti dei conti a seconda del riarrangiamento dei segmenti genici
delle diverse catene e si visto che esistono circa 6000 combinazioni per H,
200 per K e 120 per Lamda. L'associazione tra H e L ha 6000x320=1.9 x 10^6
possibilit diverse di produrre anticorpi diversi, poi abbiamo la variabilit
giunzionale che circa altre 3x10^6 quindi ipoteticamente possiamo avere una
diversit totale durante questi primi meccanismi di 5x10^13 molecole diverse.
Negli organi linfoidi periferici nel momento del contatto con l'antigene questi
anticorpi possono andare incontro a ipermutazione somatica dipendente dalla
attivazione dei linfociti B e dalla cooperazione dei linfociti T helper che
producono determinate citochine. Queste citochine possono favorire
l'attivazione della cellula e soprattutto l'attivazione dell'enzima AID che la
citidina deaminasi indotta dall'attivazione. Le persone alle quali manca questo
enzima non avranno il cambio di classe quindi produrranno solo IgM e anticopri
con la stessa affinit. Quindi, la deaminasi AID durante la proliferazione delle
cellule, soprattutto nella ipermutazione somatica, va a sostituire al livello della
parte variabile del DNA le citidine in uridine e questo comporta una modifica
della sequenza del DNA. Poich interverranno meccanismi di riparazione che
sostituiranno le uridine con altri nucleotidi si creer un punto di diversit.
Quando naturalmente c' una rottura invece della tolleranza, ci sono delle
anomalie, ci sono delle risposte anomale, delle risposte patogenetiche, allora il
sistema immunitario si attiva e possiamo avere in questo caso una malattia
autoimmune come potrebbe essere il diabete insulinodipendente.
Questa la via principale con cui vengono processati gli antigeni citosolici.
Poi c' una II via di processazione che tipica solo delle cellule
dendritiche. Si osservato che le cellule dendritiche possono presentare dei
peptidi antigenici ai linfociti T citotossici anche se la cellula non infettata, o
meglio quando questi antigeni arrivano attraverso fagocitosi o
internalizzazione. Nella II via la cellula dendritica fagocita, internalizza, quindi
si tratta di patogeni extracellulari, si tratta di cellule apoptotiche infettate, o di
cellule necrotiche infettate che vengono fagocitate, internalizzate e quindi qui
ci aspetteremo che parte di questi peptidi antigenici vengano presentati
attraverso l'MCH di classe I, invece per le APC succede questo ma pu
succedere anche che proprio l'internalizzazione dentro gli endosomi, non si sa
ancora, non ben conosciuto, ancora oggetto di studi, parte di queste
proteine che sono state internalizzate sfuggono a queste vescicole e quindi
passano nel compartimento citoplasmatico, quindi seguono, entrano nella via
dell' MHC di classe 1, quindi queste proteine verranno ordinate e quindi
riconosciute dal proteasoma o dall'immunoproteasoma e quindi presentati
questi peptidi sulla superficie dell'APC come con l'MHC I per attivare i
citotossici. Questo tipo di comportamento si chiama cross- presentazione ed
caratteristico proprio delle cellule dendritiche. Le cellule dendritiche anche
se non sono infettate possono per favorire, attivare i linfociti T citotossici
attraverso questo meccanismo di cross- presentazione, ed molto utile ad
esempio per eliminare le cellule tumorali. Queste APC possono fagocitare
anche le cellule neoplastiche, magari necrotiche morenti o presentarle e
creare quindi dei cloni, dei linfociti T citotossici, che attaccano le cellule che
esprimono determinati antigeni.
Slide Qui rappresentata la cross-presentazione: abbiamo la cellula infettata
dai virus o una cellula tumorale che viene captata, catturata da queste cellule
APC dendritiche, poi attraverso questo processo di cross presentazione,
abbiamo la possibilit di attivare linfociti T virus specifici, i quali verranno poi
stimolati, daranno origine a un clone virus specifico che andr in periferia a
cercare e a uccidere le cellule che sono infettate da quei virus ed
esprimeranno le cellule di quel determinato peptide antigenico caratteristico
del virus. Queste cellule., le APC abbiamo visto durante il loro percorso per
presentare il peptide antigenico ai linfociti T durante la maturazione
aumentano notevolmente l'espressione delle molecole del complesso
maggiore di istocompatibilit di classe 1 sotto l'effetto di citochine
proprio per favorire al meglio la presentazione e stimolare questa via di
presentazione. Le cellule dendritiche sono particolarmente efficienti oltre che
per presentare gli antigeni esogeni anche presentare antigeni attraverso
questa via di cross- presentazione. Solo le cellule dendritiche sono in grado
di presentare questi antigeni endocitati dall'esterno anche attraverso la via
citosolica (..?) peptide MHC classe I.
Quindi la cross-presentazione porta alla generazione di risposte T
citotossiche contro virus che non infettano le cellule dendritiche ma servono
solo a stimolare lo sviluppo del clone virus specifico che diventer il clone
effettore che andr in periferia.
Naturalmente tutti questi sistemi si sono evoluti proprio per combattere virus
e patogeni. Dall'altra parte anche i virus ed i patogeni avranno cercato dei
metodi per cercare di non attivare il sistema immunitario e poter quindi
moltiplicarsi nelle nostre cellule. Ci sono infatti alcuni virus che evadono il
sistema proprio inibendo o bloccando la presentazione degli antigeni ad
esempio via MHC1.
Slide In queste diapositive sono rappresentati alcuni tipi di peptidi, di molecole
che sono prodotte da alcuni virus per inibire o bloccare la via di presentazione.
Ad esempio abbiamo alcuni virus che producono delle sostanze che vengono
chiamate evasive US6 e ICP47 che praticamente all'interno del reticolo
endoplasmatico vanno a bloccare la presentazione dell'antigene, prevenendo il
movimento dei peptidi, cio bloccano l'ingresso dei peptidi citoplasmatici
all'interno del reticolo endoplasmatico, cio fanno una sorta di tappo, quindi i
peptidi antigenici di origine virale non riescono ad entrare nel reticolo e quindi
non vengono associati alle molecole MHC di classe 1 quindi non si former
nessun trimero e quindi l'MHC verr degradato. Oppure abbiamo la proteina
E19 dell'adenovirus che compete con la Tapasina, che si associa sempre a
TAP e quindi anche in questo caso abbiamo una inibizione del caricamento del
peptide sull' MHC nascente che si sta formando e quindi chiaro che in questo
caso il virus sopravviver e potr anche attaccare altre cellule, perch non si
sviluppa mai un clone di linfociti T citotossico specifico per quel virus. Il
citomegalovirus poi ricchissimo di queste strategie che eludono l'attivazione
dei linfociti T citotossici.
Slide: per esempio vediamo la proteina OS11 che si associa a un'altra proteina
che si chiama verdina(?) che causa la dislocazione dell'MHC nascente e
favorisce, quindi impedisce di fatto la formazione dell 'MHC,che quindi non
forma il trimero e va incontro a degradazione. Questi sono alcuni esempi, ma
vedete ce ne sono moltissimi altri: i virus hanno adottato moltissime strategie
che intervengono proprio in questi processi. Ci sono anche molte molecole che
controllano anche la funzionalit del proteasoma, dell'immunoproteasoma,
ne bloccano l'attivit e quindi non vengono fatti i peptidi.
Slide: qui sono molecole che bloccano soprattutto le Tap e la formazione del
polimero.
L'ultima cosa, abbiamo parlato che c'era una III via di presentazione degli
antigeni ai linfociti, era la via attraverso il CD1, che era una sorta di molecola
del complesso maggiore di istocompatibilit che non era una classica forma, i
geni del CD1 non codificano nel locus dell'MHC e sono in grado queste
molecole di presentare i lipidi ai linfociti. Come avviene questo processo?
Intanto le molecole CD1 sono delle proteine, quindi vengono sintetizzate a
livello del reticolo endoplasmatico, e qui la catena si associa alla
2microglobulina, si forma anche in questa situazione una molecola costituita
da due componenti. Sempre all'interno del reticolo endoplasmatico sembra,
sono studi nuovi, che la molecola CD1 venga associata a dei lipidi endogeni.
Quindi all'interno di questa tasca particolare che idrofobica, quindi pu legare
i lipidi, vengono inseriti dei lipidi endogeni, si forma questo trimero, quindi la
conformazione stabilizzata e dal reticolo endoplasmatico passa al Golgi e poi
alle vescicole di esocitosi, il CD1 cos composto viene espresso sulla superficie
e resta sulla superficie per un determinato tempo. Successivamente la struttura
del CD1 viene di nuovo internalizzata ed entra nel compartimento vescicolare
dell'endosoma. Che cosa avviene all'interno di queste vescicole? Il CD1 viene
liberato del lipide endogeno e viene sostituito con un lipide che invece ha
unorigine non interna della cellula che pu derivare dalla processazione di un
patogeno oppure di patogeni che vivono all'interno della cellula e quindi questi
lipidi derivati dal patogeno vengono inseriti nella tasca del CD1 che di nuovo
viene riportato sulla superficie della nostra cellula. Lei pu quindi presentare
questo lipide extracellulare di origine quindi patogeno ai linfociti. Seguono
questa via di presentazione alcuni tipi di micobatteri, come il micobatterio della
tubercolosi e anche alcuni tipi particolari patogeni come la leishmania. Per
questo CD1 presenta questi lipidi attraverso questo complesso non ai linfociti T
e classici ma a una particolare sottopopolazione che si chiamano NKT che
sono dei linfocitiT con caratteristiche simili all'NK oppure ai linfociti T che
sono sempre un'altra sottopopolazione che hanno un recettore molto
particolare che presenta meno variabilit di riconoscimento rispetto agli altri
linfociti T. Negli ultimi anni si evidenziata questa III modalit di
presentazione.
Slide: questo come avviene il contatto e l'attivazione del linfocita T.
Naturalmente non partecipano a questo legame tra APC e linfociti T diverse
molecole. Il primo riconoscimento fondamentale il TCR: deve riconoscere il
peptide e l'MHC rispettivo, se CD4 MHC di classe 2 se CD8 MHC di
classe 1. Sempre legato al TCR presente sempre un corecettore che pu
essere CD4 o CD8 e questi due recettori rafforzano il legame del TCR perch
abbiamo detto si legano alla componente della molecola del complesso
maggiore di istocompatibilit, quella che non cambia: l' 3 o 2. Poi
naturalmente oltre a questo primo segnale di attivazione per i linfociti T devono
intervenire altre molecole stimolatorie che danno il 2 segnale di attivazione.
Anche i linfociti T possono entrare in ciclo e moltiplicarsi solo se hanno un
doppio segnale di attivazione. Per quanto riguarda il doppio segnale di
attivazione per i linfociti T il legame tra il CD28 che presente sui linfociti T
che una molecola con un recettore importantissimo che si lega sull'APC ai
cosiddetti B7. Questo il II riconoscimento, legame che deve avvenire, a
questo punto parte la cascata di trasduzione del segnale di attivazione dei
linfociti T, quindi queste sono le interazioni. Questi naturalmente sono i segnali
pi importanti, poi abbiamo tutta una serie di altre molecole di adesione che
comunque sono utili per mantenere queste cellule vincolate finch si attivi la
cascata di trasduzione del segnale. Questa slide era solo per mostrare quante
molecole particolari siano coinvolte in questo riconoscimento, che servono
proprio a favorire la trasduzione del segnale. Vediamo ci sono molte moltissime
molecole di adesione e altre molecole che saranno spiegate nelle prossime
lezioni. Questa unione tra le cellule chiamata sinapsi immunologica,
proprio per questa complessit presente. Al centro della parte pi centrale,
quella fondamentale, abbiamo il riconoscimento specifico del TCR con le
molecole costimolatorie e poi attorno, pi perifericamente, abbiamo tutte
queste altre molecole di adesione che servono a mantenere il legame e
costituiscono questa sorta di sinapsi immunologica.
Ultima cosa: esistono delle molecole che vengono prodotte da virus, che
vengono chiamate superantigeni. Sono molecole capaci di legarsi all'MHC e
a TCR in maniera anomala all'esterno e favoriscono l'attivazione dei linfociti T e
creano quindi un'espansione. Quindi il riconoscimento, l'attivazione non
avviene attraverso il riconoscimento specifico del TCR con l'MHC e il peptide,
ma abbiamo questo superantigene, questa proteina che si lega esternamente
alla catena del TCR e attiva comunque il linfocita T e da origine
all'espansione clonale. Superantigeni esogeni batterici sono ad es ... dello
stafilococco che d .......... dentale oppure la tossina 1 che d la sindrome da
shock tossico proprio perch hanno la capacit di attivare in maniera massiva i
linfociti T perch si legano direttamente all'MHC e al TCR.d8d
PATOLOGIA Lezione 37 10.11.2014 Prof. Daniela Monti
I linfociti sono prodotti negli organi primari (T nel Timo, B nel Midollo Osseo) e
poi vengono immessi nel torrente circolatorio. Dal sangue queste cellule
possono poi passare passano nei linfonodi, attraverso le venule post-capillari
ad endotelio alto. Questultimo passaggio regolato da una serie di molecole
apposite. [A tal proposito sono stati studiati sia linfociti B che linfociti T, ma
questi meccanismi sono meglio conosciuti per quanto riguarda i linfociti T;
pertanto parleremo soprattutto dellhoming dei linfociti T] Quindi i linfociti T
(1) passano attraverso le venule post-capillari ad alto endotelio, (2) vanno
nella zona paracorticale a loro adibita e (3) qui perlustrano alla ricerca di un
APC che gli presenti un antigene specifico. Se questo non avviene (4) il
linfocita T fuoriesce dal linfonodo attraverso il linfatico efferente e continua la
propria circolazione negli altri linfonodi fino ad arrivare attraverso la linfa nel
dotto toracico per poi ritornare al circolo sanguigno.
Durante questo percorso pu succedere che, in qualche organo linfoide
secondario, ci sia (5) lincontro con una APC che mostri lantigene. A questo
punto il linfocita T si blocca allinterno del linfonodo e l riceve dei messaggi di
attivazione. Come sapete, (6) dopo il riconoscimento abbiamo una fase di
espansione clonale: ovverosia la cellula attivata va incontro ad una serie di
divisioni cellulari e si formano tantissime copie della cellula originale. (7)
Questi cloni antigene-specifici si trasformano poi in cellule effettrici che
abbandonano lorgano linfoide secondario.
(8) Arrivano poi, attraverso i linfatici, alla periferia per raggiungere il sito in
cui avvenuta linfezione. Qui svolgeranno la loro funzione.
I linfociti naive che non riconoscono lantigene allinterno del linfonodo e che
quindi non si attivano devono tornare in circolo. Lo fanno attraverso i linfatici
efferenti, per arrivare quindi al dotto toracico e da qui alla vena cava
superiore. Tutto questo seguendo il gradiente di concentrazione di Sfingosina-
1-P: una molecola lipidica chemoattraente che presente in grandissima
quantit nella linfa e nel sangue, mentre nei tessuti presente un enzima
che la degrada perci vi si trova in basse concentrazioni. I linfociti T naive che
non hanno incontrato lantigene esprimono, dopo un po di tempo, sulla loro
superficie il recettore per la Sfingosina-1-P ed iniziano quindi a seguirne il
gradiente. Per cui dalla paracorticale si spostano attraverso il vaso efferente,
passano nella linfa e riprendono la loro circolazione.
Una volta raggiunto il sangue il recettore lega la Sfingosina. Avvenuto il
legame e saziato il bisogno d sfingosina, per qualche tempo il linfocita non
ha pi il bisogno di seguire il gradiente, e finch non riespone nuovi recettori
libero di rientrare nel linfonodo. Il lasso di tempo per la riesposizione di
qualche ora per i linfociti T naive e di qualche giorno per i linfociti T effettori.
[E stata studiata una molecola detta Fingolimod, in grado di bloccare
lespressione del recettore per la sfingosina-1-p. Questa molecola stata
usata per alcune malattie autoimmuni del sistema nervoso, dimostrando una
azione immunosoppressiva dato che privi del recettore i linfociti vengono
segregati allinterno del linfonodo senza poter raggiungere la periferia e
svolgere la loro funzione.