Anda di halaman 1dari 14

LAPORAN PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI FARMASI

PENETAPAN KADAR DNA

Disusun oleh

Anggota Kelompok F-2 :

Alfia Septiana Mutiasari 142210101012


Sutatik 142210101037
Nadiya Rosada 142210101038
Finda Avita Sari 142210101050
Widyaning Dwi Astuti 142210101055
Hasnia Ika Syafitri 142210101061
Monica Chinuradha Aura S 142210101075

LABORATORIUM BIOLOGI FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS JEMBER

2017

DAFTAR ISI
DAFTAR ISIi

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

1.2 Rumusan Masalah

1.3 Tujuan

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Deoxyribonucleic acid (DNA) ...................................................................................3

2.2 Uji Kuantitatif DNA...................................................................................................3

2.3 Perhitungan Konsentrasi DNA...................................................................................4

2.4 Kemurnian DNA.4

BAB III METODE KERJA

3.1 Alat dan Bahan

3.2 Prosedur Kerja

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan

5.2 Saran

DAFTAR PUSTAKA

LAMPIRAN............................................................................................................................12
BAB I. PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang


Plasmid merupakan bagian yang penting dalam rekayasa genetika. Plasmid a-
dalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara autonom dan terdapat di
dalam sel hidup. Didalam satu sel dapat ditemukan lebih dri satu plasmid dengan ukuran
yang berbeda-beda. Umumnya plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar
dapat bertahan pada keadaan yang kurang menguntungkan sehingga apabila keadaan
sudah kembali norma, maka plasmid akan dibunang. Plasmid telah diproduksi secara
komersil oleh banyak perusahaan besar untuk digunakan sebagai vektor kloning. Agar
dapat digunakan sebagai vektor kloning, plasmid harus memiliki beberapa kriteria
diantaranya yaitu harus berukuran kecil, memiliki gen penanda seleksi dan gen pelapor,
serta memiliki situs pemotongan enzim retriksi untuk memudahkan penyisipan DNA
kedalam vektor plasmid. Keberadaan DNA plasmid merupakan hal terpenting dalam
teknik DNA rekombinan tergantung dari hasil mengisolasi dan memurnikan DNA
plasmid dari bakteri atau yeast.
Pemurnian DNA plasmid dilakukan untuk menghilangkan berbagai pengotor-
pengotor yang berasal dari bagian sel yaitu dinding sel dan beberapa protein. Untuk
mengukur kemurnian atau menentukan kadar DNA plasmid digunakan spektrofotometri.
Spektrofotometri sendiri merupakan suatu metode analisa yang didasarkan pada besarnya
nilai absorbansi suatu zat terhadap radiasi sinar elektromagnetik. Panjang gelombang
yang digunakan untuk mengetahui kandungan DNA/RNA menggunakan spektrofotometri
adalah 260nm, sedangkan untuk mengetahui kandungan protein menggunakan
spektrofotometri pada panjang gelombang 280nm. Absorbansi akan berbanding lurus
dengan konsentrasi yang artinya semakin tinggi konsentrasinya, maka semakin tinggi
pula absorbansi yang dihasilkan. Untuk menghitung konsentrasi DNA adalah dengan cara
panjang gelombang 260nm faktor pengenceran 50g/l. DNA yang murni memiliki
nilai antara 1,8-2,0. Apabila nilai kemurniannya kurang dari 1,8 maka mengalami
kontaminasi fenol/protein, jika nilai kemurniannya lebih dari 2,0 maka akan mengalami
kontaminan RNA.

1.2 Rumusan Masalah


1. Bagaimana cara mengetahui kemurnian DNA?
2. Mengapa DNA dapat ditentukan kadarnya menggunakan spektrofotometer?
3. Bagaimana cara menentukan kadar DNA dengan spektrofotometer?
1.3 Tujuan
Mampu memahami dan melakukan penetapan kadar DNA plasmid
BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Deoxyribonucleic acid (DNA)

Deoxyribonucleic acid (DNA) adalah suatu materi yang terdapat pada tubuh manusia
dan semua makhluk hidup yang diwarisi secara turun menurun. Semua sel pada tubuh
memiliki DNA yang sama dan sebagian besar terdapat pada nukleus. DNA juga dapat
ditemukan pada mitokondria (Campbell et al., 2004). Struktur dari DNA terdiri dari gugus
fosfat, gula deoksiribosa dan basa nitrogen. Informasi yang dibawa oleh DNA bergantung
pada urutan basa nitrogen yang terdiri dari Adenin (A), Timin (T), Guanin (G) dan Sitosin
(C). Basa pada DNA selalu berpasangan yaitu A-T dan G-C (Stansfield et al., 2002). Masing-
masing pasangan basa melekat pada molekul gula (deoksiribosa) dan fosfat membentuk unit
nukleotida. Nukleotida tersusun berpasangan pada baris panjang yang berbentuk spiral yang
sering disebut double helix.

Keberadaan DNA dalam suatu organisme dapat diketahui dengan 2 cara yaitu secara
kualitatif dengan metode Elektroforesis Gel Agarose dan secara kuantitatif dengan
metode spektrofotometri.

2.2 Uji Kuantitatif DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. Isolasi
DNA dapat dilakukan melalui tahapan tahapan yaitu preparasi ekstrak sel, pemurnian DNA
dari ekstrak sel, dan presipitasi DNA.

Uji kuantitatif DNA adalah analisis untuk menentukan kandungan atau jumlah DNA
yang terdapat suatu zat atau komponen zat yang sebelumnya telah diketahui keberadaan DNA
plasmidnya dalam larutan contoh dengan uji cara kualitatif. Analisis kuantitatif merupakan
salah satu teknik analisis yang bertujuan untuk menentukan jumlah atau seberapa banyak
suatu zat atau komponen zat (Harjadi, 1986). Analisis kuantifikasi DNA dapat dilakukan
dengan bantuan alat, yaitu spektrofotometer. Terdapat beberapa cara yaitu spektrofotometri
Vis (visible), spektrofotometri UV (ultraviolet), Spektrofotometri UV-Vis (ultravioletvisible)
dan Spektrofotometri Infra Red.

Spektrofotometer adalah alat yang dilengkapi dengan sumber cahaya (gelombang


elektromagnetik), baik cahaya UV (ultra-violet) atau pun cahaya nampak (visible).
Komponen utama dari alat ini adalah sumber cahaya, pengatur intensitas, monokromator,
kuvet, detektor, penguat arus dan indikator atau layar (Braun 1982). Sinar UV memiliki
panjang gelombang 190 380 nm karena sinar UV tidak dapat dideteksi dengan mata, maka
senyawa yang dapat menyerap sinar UV merupakan senyawa yang tidak memiliki warna,
bening, dan transparan.

DNA yang mengandung basa purin dan pirimidin dapat menyerap cahaya UV. Pita
ganda DNA dapat menyerap cahaya UV pada 260 nm, sedangkan kontaminan protein atau
phenol dapat menyerap cahaya pada 280 nm. Dengan adanya perbedaan penyerapan cahaya
UV, kemurnian DNA dapat diukur dengan menghitung nilai absorbansi 260 nm dibagi
dengan nialai absoorbansi pada 280 nm (A 260/ A280), dan nilai kemurnian DNA berkisar
antara 1,8 2,0 (Fatchiyah et al, 2011). Rasio yang kurang dari 1,8 menunjukkan bahwa
preparasi DNA telah terkontaminasi baik oleh fenol maupun protein. Sedangakan rasio yang
lebih dari 2 berarti preparasi DNA telah terkontaminasi oleh RNA.

2.3 Perhitungan Konsentrasi DNA

Untuk menghitung konsentrasi DNA digunakan rumus sebagai berikut :

[DNA] = 260 x Faktor pengenceran x 50 g/l

Keterangan :
260 = Nilai absorbansi pada panjang gelombang 260 nm
50 g/l = Larutan dengan nilai absorbansi 1,0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per
ml (dsDNA)

2.4 Kemurnian DNA

A 260
Rumus : A 280

Keterangan:

A260 : Absorbansi di panjang gelombang 260 nm

A280 : Absorbansi di panjang gelombang 280 nm


Perhitungan tingkat kemurnian sampel DNA dapat dilakukan dengan mengukur
absorbansi larutan sampel pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm, seperti yang telah
dijelaskan di atas. Larutan murni asam nukleat akan mengabsorb sinar UV pada panjang
gelombang 260 nm kurang lebih 2 kali lebih tinggi dibandingkan pada panjang gelombang
280 nm. Berdasarkan hal itu, maka rasio 260 nm/280 nm pada larutan yang mengandung
DNA murni berkisar antara 1,8 hingga 2,0. Ketika kontaminasi protein meningkat, maka rasio
akan berkurang. Nilai rasio tersebut juga bisa dipengaruhi oleh adanya pelarut organik,
seperti fenol, sehingga perhitungan konsentrasi dan kemurniannya menjadi tidak tepat.
BAB III. METODE KERJA

3.1 Alat dan bahan

Alat :
- Kuvet kwarsa 1 ml
- Mikropipet
- Tip biru
- Tip putih

Bahan :
- DNA plasmid hasil isolasi
- Buffer TE
- ddH2O

3.2 Prosedur kerja

Pengukuran konsentrasi dan kemurnian DNA dengan spektrofotometri

Blanko diukur kuvet kwarsa diisi dengan aquabidest steril sebanyak 1000 l
dan diperiksa pada panjang gelombang 260 nm sampai Absorbansinya = 0,00

Dipipet DNA sebanyak 5 l dan 995 l aquabidest steril dimasukkan ke


dalam kuvet kwarsa kemudian dicampur dengan baik (DNA diresuspensi)

diukur absorbansi sampel pada panjang gelombang 260 nm

Diulangi pengukuran panjang gelombang pada 280 nm


Ditentukan jumlah DNA dengan asumsi 1 absorbansi 260 nm = 50 g DNA

- Konsentrasi DNA = A260nm x factor pengenceran x 50 l


A 260
- Kemurnian DNA = A 280 (Kemurnian tinggi antara 1.8 - 2,0)

A 260
- Jika nilai A 280 < 1,8 kontaminan terhadap protein/fenol
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Kadar DNA Kemurnian DNA
Sampel A260 A280
(g/l) (A260/A280)
R1 0.154 0.160 1540 0.9625
R2 0.084 0.071 840 1.183
R3 0,101 0.082 1010 1.232
Rata-rata 1130 1,126

Perhitungan :
Sampel R1
Kadar DNA = A260 nm faktor pengenceran 50 g/l
= 0.154 200 50 g/l
= 1540 g/l
A 260 0.154
= =
Kemurnian DNA = A 280 0.160 0.9625

Sampel R2
Kadar DNA = A260 nm faktor pengenceran 50 g/l
= 0.084 200 50 g/l
= 840 g/l
A 260 0.084
= =
Kemurnian DNA = A 280 0.071 1.183

Sampel R3
Kadar DNA = A260 nm faktor pengenceran 50 g/l
= 0.101 200 50 g/l
= 1010 g/l
A 260 0.101
= =
Kemurnian DNA = A 280 0.082 1.232

Rata-rata
Kadar ratarata = 1130 g/l
Kemurnian = 1.126

4.2 Pembahasan
Percobaan kali ini dilakukan dengan tujuan untuk melakukan penetapan kadar
DNA dari hasil isolasi yang sebelumnya telah dipraktikumkan. Hasil isolasi yang telah
didapatkan pada praktikum sebelumnya, dianalisis dengan menggunakan
spektrofotometri UV. Analisis menggunakan spektrofotometri merupakan metode
analisis yang didasarkan pada besarnya absorbsi suatu zat terhadap radiasi sinar
elektromagnetik. DNA dapat dianalisis dengan spektrofotometri UV karena memiliki
ikatan rangkap terkonjugasi. DNA dan RNA menyerap sinar UV pada panjang
gelombang 260 nm karena adanya basa purin dan pirimidin. Kontaminan dari proses
isolasi seperti protein dan fenol akan menyerap sinar UV pada panjang gelombang 280
nm sehingga kemurnian DNA/RNA dapat ditentukan dengan menghitung nilai
absorbansi 260 nm dibagi dengan nilai absorbansi 280 nm. DNA murni memiliki nilai
antara 1,8 sampai 2,0. Nilai kemurnian <1.8 menunjukkan adanya kontaminan
fenol/protein sedangkam nilai kemurnian >2.0 menunjukkan adanya kontaminan RNA
pada DNA yang diisolasi.
Pada percobaan yang telah dilakukan, pada sampel R1 didapatkan kadar DNA
= 1540 g/l dengan kemurnian DNA = 0.9625. Pada sampel R2 didapatkan kadar
DNA = 840 g/l dengan kemurnian DNA = 1.183, sedangkan pada sampel R3
didapatkan kadar DNA = 1010 g/l dengan kemurnian DNA = 1.232. setelah dirata-
rata, didapatkan hasil kadar DNA = 1130 g/l dengan kemurnian 1.126. Berdasarkan
dari hasil tersebut dapat dikatakan bahwa DNA tidak murni karena nilai kemurnian
rata-rata dari ketiga replikasi kurang dari 1,8 yang berarti masih banyak terdapat
pengotor seperti protein dan fenol.
BAB V. PENUTUP

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan pemaparan pada bab sebelumnya dapat disimpulkan bahwa :

1. Analisis menggunakan spektrofotometri merupakan metode analisis yang


didasarkan pada besarnya absorbsi suatu zat terhadap radiasi sinar
elektromagnetik. DNA dapat dianalisis dengan spektrofotometri UV karena
memiliki ikatan rangkap terkonjugasi.
2. Hasil kadar DNA yang didapatkan yakni = 1130 g/l dengan kemurnian 1.126.
Berdasarkan dari hasil tersebut dapat dikatakan bahwa DNA tidak murni karena
nilai kemurnian rata-rata dari ketiga replikasi kurang dari 1,8 yang berarti masih
banyak terdapat pengotor seperti protein dan fenol.

5.2 Saran

Untuk mendapatkan informasi yang lebih luas dan menyeluruh seharusnya penulis
juga mencari literatur lain yang mendukung pembuatan laporan ini.
DAFTAR PUSTAKA

Artama, W.T. 1991. Rekayasa Genetika. Pusat Antar Universitas-Bioteknologi.

Yogyakarta : UGM.

Braun, R.D. 1982. Introduction to Chemical Analysis. New York: Mc Graw Hill Book

Company.

Champbell, N.A., Reece, J.B., Nitchel, L.G. 2004. Biologi: Edisi Kelima Jilid 3. Jakarta:

Erlangga.

Fatchiyah, Aruingtyas, E. L., Widyarti, S., Rahayu, S. 2011. Biologi Molekular. Prinsip

Dasar Analisis. Jakarta: Erlangga.

Harjadi, W. 1986. Ilmu Kimia Analitik Dasar. Jakarta: PT. Gramedia.

Stansfield,William D. et. al. 2002. Genetika Edisi Keempat. Jakarta: Erlangga.

Watson, James D. Tooze, John. Kurtz, David T. 1988. DNA Rekombinan. Jakarta : Erlangga.
LAMPIRAN

Memasukkan blanko 100 l Memipet sampel DNA Plasmid menambahkan 995l

aquabides steril kedalam sebanyak 5l dan memindahkannya aquabides steril, campuran

kuvet dan diukur absorbansinya dalam kuvet diresuspensi dan diukur

absorbansinya

Anda mungkin juga menyukai