Anda di halaman 1dari 20

UJI AKTIVITAS PROTEIN MAKROALGA Turbinaria decurrens Bory

TERHADAP PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN KAPANG Aspergillus


flavus SECARA IN VITRO

OLEH

WILDHAN ALVIAN HAKIM 3311141136

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS JENDERAL ACHMAD YANI
CIMAHI
2017
DAFTAR ISI

DAFTAR ISI i
DAFTAR TABEL ii
DAFTAR GAMBAR iii

BAB I: PENDAHULUAN 1
Latar Belakang 1
Rumusan Masalah 3
Tujuan Penelitian 3
Manfaat Penelitian 3

BAB II: TINJAUAN PUSTAKA 4


2.1. Taksonomi Makroalga Turbinaria decurrens 4
2.2. Aspergillus flavus 4
2.2.1. Taksonomi dan Penjelasan tentang Aspergillus flavus 4
2.2.2. Aflatoksin 9
2.3. Protein Bioaktif 11

BAB III: METODE PENELITIAN13


3.1. Alat dan Bahan13
3.1.1. Bahan 13
3.1.2. Alat 13
3.2. Prosedur Penelitian 14
3.2.1. Ekstraksi dan Isolasi Protein Bioaktif Makroalga 14
3.2.2. Penentuan Konsentrasi Protein 14
3.2.3. Fraksinasi dan Dialisis Protein 15
3.2.4. Pengujian Aktivitas Anti Jamur 15

DAFTAR PUSTAKA 16

1
DAFTAR TABEL

Tabel Karakteristik Berbagai Jenis Aflatoksin 9

2
DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Turbinaria decurrens Bory 5


Gambar 2.2. Aspergillus flavus 5
Gambar 2.3. Koloni Aspergillus flavus pada media Czapek-Dox agar 6
Gambar 2.4. Tampilan mikroskopis dari Aspergillus flavus 7
Gambar 2.5. Struktur Molekul Berbagai Jenis Aflatoksin 11

3
BAB I
PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang


Peradaban di era modernisasi dan globalisasi ini mengakibatkan terjadinya
perubahan genetis atau mutasi pada beberapa makhluk hidup tanpa terkecuali
mikroorganisme. Mutasi yang terjadi menyebabkan mikroorganisme tesebut
menjadi resisten terhadap antibiotika yang ada saat ini. Resistensi kuman
penyakit salah satu faktor penyebabnya adalah terjadinya mutasi gen.
Timbulnya mutan-mutan baru sering mengakibatkan penggunaan antibiotik
harus dengan dosis yang lebih tinggi. Namun apabila hal tersebut dilakukan
maka dapat mengakibatkan berbagai efek samping yang tidak diinginkan.
Untuk mengatasi masalah tersebut, maka usaha penemuan obat antibiotik
baru terus dilakukan. Saat ini penelitian cenderung dikembangkan ke sumber
daya laut karena sebagian besar sumber daya tersebut belum dimanfaatkan
secara maksimal dan beberapa organisme laut menghasilkan senyawa kimia
yang tidak terdapat atau jarang ditemukan pada organisme yang hidup di
darat (Nybakken, 1993).
Indonesia merupakan negara maritim dimana luas perairan terhadap
daratan Indonesia sendiri adalah 70 berbanding 30 bagian yang di dalamnya
terdapat kekayaan laut yang melimpah, antara lain berbagai jenis makroalga
dan spongs. Beberapa jenis diantaranya dilaporkan memiliki senyawa
bioaktif yang dapat digunakan dalam bidang farmasi (Ahmad et al., 1995).
Beberapa jenis spesies tertentu merupakan sumber nutrisi esensial bagi tubuh
manusia, selain itu ada juga sejumlah spesies yang memproduksi dan
menyimpan toksin, yang disebut marintoksin pada bagian tubuhnya atau
dikeluarkan ke lingkungan hidupnya (Rachmaniar, 1996). Senyawa tersebut
merupakan metabolit sekunder yang digunakan dalam mekanisme pertahanan
diri, bahkan memiliki aktivitas farmakologis sehingga senyawa tersebut
memiliki nilai ekonomis apabila diisolasi dan dimanfaatkan dalam bidang
pengobatan.

1
Beberapa biota laut seperti bunga karang, karang lunak, dan alga laut
dilaporkan mengandung senyawa bioaktif (Nybaken, 1993). Alga biasanya
hidup bersimbiosis dengan organisme lain. Dalam simbiosis ini, alga
memasok hasil fotosintesisnya kepada inang sebagai sumber energi.
Contohnya adalah simbiosis dengan jamur dan koral. Beberapa spesies
makroalga antara lain; Turbinaria decurrens Bory, Sargassum echinocarpum
dan Laurencia cartilaginea. Kandungan kimia makroalga Turbinaria
decurrens yaitu berupa senyawa natrium alginat dan iodium. Senyawa
natrium alginat dapat dimanfaatkan pada pembuatan obat antibakteri,
antitumor, penurun tekanan darah tinggi, dan mengatasi gangguan kelenjar.
Kadar iodium yang dikandung oleh makroalga yang ada di Indonesia
mencapai 2000 kali lebih tinggi dibanding yang terdapat di perairan wilayah
lain. Kandungan iodium ini lebih banyak ditemukan pada Turbinaria dan
Sargassum. Kandungan iodium tersebut berguna untuk mengatasi defisiensi
iodium pada masyarakat, yang berdampak pada menurunnya tingkat
kecerdasan. Hal inilah yang mendorong para pakar untuk melakukan uji coba
pengolahan Turbinaria menjadi produk mie dengan harapan bahwa
introduksi iodium melalui jenis makanan yang banyak digemari masyarakat
dan harganya terjangkau itu dapat mengatasi defisiensi iodium (Arifudin dkk,
2001).
Kemampuan ekstrak kasar dari beberapa spesies alga laut sebagai
antimikroba terhadap Staphylococus aureus telah diteliti oleh Val, et al
(2001). Penelitian ini secara spesifik menemukan bahwa spesies makroalga
Caulerpa taylori, Halimeda discoidea, Ulva rugida, Dictyota, sp, dan
Osmundea hybrida efektif menghambat pertumbuhan bakteri Staphylococus
aureus dengan diameter lebih kurang 14 mm. Sejauh ini belum banyak data
penelitian yang mengeksplorasi kelompok senyawa protein dari makroalga
sebagai bahan baku obat pada penyakit manusia maupun hewan. Penggunaan
protein sebagai bahan baku obat memiliki beberapa keunggulan, diantaranya
senyawa protein dapat diterima baik oleh tubuh dan menyebabkan sedikit
efek samping, serta kelompok senyawa protein dapat dikloning gennya

2
sehingga dapat diproduksi secara besar-besaran pada skala industri melalui
teknik rekayasa genetika (Arifudin dkk, 2001).
Penelitian ini dilakukan untuk mengetahui aktivitas antimikroba protein
bioaktif yang diperoleh dari makroalga Turbinaria decurrens Bory terhadap
kapang Aspergillus flavus dengan metode difusi agar. Hasil penelitian ini
diharapkan dapat ditemukan sumber daya baru di bidang farmasi khususnya
dalam hal antimikroba, dan menjadi pencetus munculnya penelitian-
penelitian baru di bidang farmasi bahari.

1.2. Rumusan Masalah


a. Bagaimanakah efektivitas makroalga Turbinaria decurrens Bory terhadap
penghambatan pertumbuhan khamir Aspergillus flavus ?

1.3. Tujuan Penelitian


a. Untuk memaksimalkan pemanfaatan sumber daya bahari di bidang
farmasi.
b. Untuk mengetahui efektivitas makroalga Turbinaria decurrens Bory
terhadap penghambatan pertumbuhan khamir Aspergillus flavus.

1.4. Manfaat Penelitian


a. Menambah informasi tentang pemanfaatan sumber daya bahari di bidang
farmasi.
b. Sebagai barometer dilakukannya penelitian di bidang farmasi bahari di
Indonesia.
c. Menambah nilai ekonomis makroalga Turbinaria decurrens Bory apabila
dimanfaatkan di bidang farmasi.
d. Dapat meningkatkan ketahanan obat nasional apabila pemanfaatan
makroalga Turbinaria decurrens Bory dilakukan di dalam negeri.

3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Taksonomi Makroalga Turbinaria decurrens


Kingdom : Chromista
Phyllum : Ochrophyta
Kelas : Phaeophyceae
Ordo : Fucales
Famili : Sargassaceae
Genus : Turbinaria
Spesies : Turbinaria decurrens Bory

Gambar 2.1. decurrens Bory

2.2. Aspergillus flavus


2.2.1. Taksonomi dan Penjelasan tentang Aspergillus flavus
Super kingdom : Eukaryota
Kingdom : Fungi
Sub kingdom : Dikarya
Phylum : Ascomycota
Subphylum : Pezizomycotina
Classis : Eurotiomycetes
Sub classis : Eurotiomycetidae
Ordo : Eurotiales

4
Famili : Trichocomaceae
Genus : Aspergillus
Spesies : Aspergillus flavus

Gambar 2.2. Aspergillus flavus

Aspergillus flavus pada sistem klasifikasi yang terdahulu merupakan


spesies kapang yang termasuk dalam divisi Tallophyta, sub-divisi
Deuteromycotina, kelas kapang Imperfecti, ordo Moniliales, famili
Moniliaceae dan genus Aspergillus. Sistem klasifikasi yang lebih baru
memasukkan genus Aspergillus dalam Ascomycetes berdasarkan
evaluasi ultrastruktural, fisiologis, dan karakter biokimia mencakup
analisis sekuen DNA. Kapang dari genus Aspergillus menyebar luas
secara geografis dan bisa bersifat menguntungkan maupun merugikan
bergantung pada spesies kapang tersebut dan substrat yang digunakan.
Aspergillus memerlukan temperatur yang lebih tinggi, tetapi mampu
beradaptasi pada aw (water activity) yang lebih rendah dan mampu
berkembang lebih cepat bila dibandingkan dengan Penicillium. Genus
ini, sekalipun memerlukan waktu yang lebih lama dan intensitas cahaya
yang lebih untuk membentuk spora, tetapi mampu memproduksi spora
yang lebih banyak sekaligus lebih tahan terhadap bahan-bahan kimia.
Hampir semua anggota dari genus Aspergillus secara alami dapat
ditemukan di tanah dimana kapang dari genus tersebut berkontribusi

5
dalam degradasi substrat anorganik. Spesies Aspergillus dalam industri
secara umum digunakan dalam produksi enzim dan asam organik,
ekspresi protein asing serta fermentasi pangan.

Gambar 2.3. Koloni Aspergillus flavus pada media Czapek-Dox agar

Aspergillus flavus merupakan kapang saprofit di tanah yang


umumnya memainkan peranan penting sebagai pendaur ulang nutrisi
yang terdapat dalam sisa- sisa tumbuhan maupun binatang. Kapang
tersebut juga ditemukan pada biji-bijian yang mengalami deteriorasi
mikrobiologis selain menyerang segala jenis substrat organik dimana
saja dan kapan saja jika kondisi untuk pertumbuhannya terpenuhi.
Kondisi ideal tersebut mencakup kelembaban udara yang tinggi dan suhu
yang tinggi. Sifat morfologis Aspergillus flavus yaitu bersepta, miselia
bercabang biasanya tidak berwarna, konidiofor muncul dari kaki sel,
sterigmata sederhana atau kompleks dan berwarna atau tidak berwarna,
konidia berbentuk rantai berwarna hijau, coklat atau hitam. Ruiqian et
al. (2009) menyatakan bahwa tampilan mikroskopis Aspergillus flavus
memiliki konidiofor yang panjang (400-800 m) dan relatif kasar,
bentuk kepala konidial bervariasi dari bentuk kolom, radial, dan bentuk
bola, hifa berseptum, dan koloni kompak (Gambar 2). Koloni dari
Aspergillus flavus umumnya tumbuh dengan cepat dan mencapai
diameter 6-7 cm dalam 10-14 hari (Ruiqian et al. 2004). Kapang ini
memiliki warna permulaan kuning yang akan berubah menjadi kuning
kehijauan atau coklat dengan warna inversi coklat keemasan atau

6
tidak berwarna, sedangkan koloni yang sudah tua memiliki warna hijau
tua. Keberagaman ceruk ekologi yang dicakup oleh Aspergillus sub-genus
Aspergillus bagian Flavi (grup Aspergillus flavus) dipadukan dengan
kemampuan beberapa spesiesnya untuk memproduksi aflatoksin
menjadikan grup Aspergillus flavus sebagai grup yang paling banyak
dipelajari hingga saat ini.

Gambar 2.4. Tampilan mikroskopis dari Aspergillus flavus

Aspergillus flavus tersebar luas di dunia. Hal ini disebabkan oleh


produksi konidia yang dapat tersebar melalui udara (airborne) dengan
mudah maupun melalui serangga. Komposisi atmosfir juga memiliki
pengaruh yang besar terhadap pertumbuhan kapang dengan kelembaban
sebagai variabel yang paling penting. Tingkat penyebaran Aspergillus
flavus yang tinggi juga disebabkan oleh kemampuannya untuk
bertahan dalam kondisi yang keras sehingga kapang tersebut dapat
dengan mudah mengalahkan organisme lain dalam mengambil substrat
dalam tanah maupun tanaman. Aspergillus flavus dan Aspergillus
parasiticus merupakan bagian grup Aspergillus yang sudah sangat
dikenal karena peranannya sebagai patogen pada tanaman dan
kemampuannya untuk menghasilkan aflatoksin pada tanaman yang
terinfeksi. Kedua spesies tersebut merupakan produsen toksin paling
penting dalam grup Aspergillus flavus yang mengkontaminasi produk

7
agrikultur. Aspergillus flavus dan Aspergillus parasiticus mampu
mengakumulasi aflatoksin pada berbagai produk pangan meskipun tipe
toksin yang dihasilkan berbeda. Aspergillus sp. umumnya mampu
tumbuh pada suhu 6-60C dengan suhu optimum berkisar 35- 38C.
Aspergillus flavus dapat tumbuh pada Rh minimum 80% (aw
minimum=0.80) dengan Rh minimum untuk pembentukan aflatoksin
sebesar 83% (aw minimum pembentukan aflatoksin=0,83). Rh minimum
untuk pertumbuhan dan germinasi spora adalah 80% dan Rh mininum
untuk sporulasi adalah 85%. Kenaikan suhu, pH, dan persyaratan
lingkungan lainnya akan menyebabkan aw minimum bertambah tinggi.
Vujanovic et al. (2001) berpendapat bahwa Aspergillus flavus dapat
tumbuh optimal pada aw 0,86 dan 0,96. Sauer (1986) menyatakan
bahwa Aspergillus flavus tidak akan tumbuh pada kelembaban udara
relatif di bawah 85% dan kadar air di bawah 16%. Aw minimum yang
dibutuhkan Aspergillus flavus untuk tumbuh adalah 0,80. Aspergillus
flavus menyebabkan penyakit dengan spektrum luas pada manusia,
mulai dari reaksi hipersensitif hingga infeksi invasif yang diasosiasikan
dengan angioinvasion. Sindrom klinis yang diasosiasikan dengan
kapang tersebut meliputi granulomatous sinusitis kronis, keratitis,
cutaneous aspergillosis, infeksi luka, dan osteomyelitis yang mengikuti
trauma dan inokulasi. Semntara itu, Aspergillus flavus cenderung lebih
mematikan dan tahan terhadap antifungi dibandingkan hampir semua
spesies Aspergillus yang lainya. Selain itu, kapang tersebut juga
mengkontaminasi berbagai produk pertanian di lapangan, tempat
penyimpanan, maupun pabrik pengolahan sehingga meningkatkan
potensi bahaya dari Aspergillus flavus.
Penyebaran Aspergillus flavus yang merata sangat dipengaruhi oleh
iklim dan faktor geografis Pertumbuhan Aspergillus flavus dipengaruhi
oleh lingkungan seperti kadar air, oksigen, unsur makro (karbon,
nitrogen, fosfor, kalium dan magnesium) dan unsur mikro (besi, seng,
tembaga, mangan dan molibdenum). Faktor lain yang juga berpengaruh
antara lain cahaya, temperatur, kelembaban dan keberadaan kapang lain.

8
Temperatur yang optimal untuk pertumbuhan Aspergillus flavus berkisar
pada 30C dengan Rh 95%. Secara umum kapang adalah organisme
aerobik sehingga gas O2 dan N2 akan menurunkan kemampuan
kapang untuk membentuk aflatoksin. Efek penghambatan oleh CO2
dipertinggi dengan menaikkan suhu atau menurunkan Rh dengan kadar
O2 minimum 1% untuk pertumbuhan.

2.2.2. Aflatoksin
Aflatoksin merupakan sekelompok toksin yang memiliki struktur
molekul yang mirip. Aflatoksin ditemukan secara tidak sengaja pada
insiden kematian seratus ribu ekor kalkun di suatu peternakan di Inggris
pada tahun 1960. Penyakit tersebut dikenal dengan nama Turkey X Disease
karena belum diketahui penyebabnya pada waktu itu. Penyebab penyakit
tersebut ditemukan berupa sejenis toksin yang terdapat dalam tepung
kacang tanah pada ransum ternak. Pengujian yang melibatkan sampel
ransum ternak mengungkapkan keberadaan sejenis. Toksin tersebut berasal
dari kontaminasi Aspergillus flavus pada campuran ransum ternak
tersebut. Nama toksin tersebut diambil dari penggalan kata
Aspergillus flavus toksin yang disingkat menjadi aflatoksin karena
Aspergillus flavus dan Aspergillus parasiticus merupakan spesies
dominan yang bertanggung jawab atas kontaminasi aflatoksin pada
tanaman sebelum dipanen maupun selama penyimpanan. Aflatoksin
memiliki karakteristik seperti dapat dilihat pada Tabel 2.1.

Tabel 2.1. Karakteristik Berbagai Jenis Aflatoksin


Aflatoksin Rumus Molekul Berat Molekul 0
Titik leleh ( C)
B1 C17H12O6 312 268-269
B2 C17H14O6 314 286-289
G1 C17H12O7 328 244-246
G2 C17H14O7 330 237-240
M1 C17H12O7 328 299
M2 C17H14O7 330 293

9
B2A C17H14O7 330 240
G2A C17H14O8 346 190

Produksi aflatoksin merupakan sebuah konsekuensi dari kombinasi


berbagai faktor antara lain karakteristik biologis dan kimiawi spesies,
substrat, dan lingkungan seperti iklim dan faktor geografis. Faktor-
faktor yang mempengaruhi meliputi temperatur, kelembaban, cahaya,
aerasi, pH, sumber karbon dan nitrogen, faktor stress, lipida, trace
metal salt, tekanan osmosis, potensi oksidasi-reduksi, dan komposisi
kimiawi dari nutrien yang diberikan. Beberapa faktor-faktor tersebut
bisa mempengaruhi ekspresi gen yang meregulasikan produksi
aflatoksin (aflR) maupun gen struktural kemungkinan dengan mengubah
ekspresi faktor-faktor transkripsi global yang merespons sinyal dari
lingkungan dan nutrisi. Aflatoksin disintesis dari malonyl CoA dalam
dua tahap. Tahap pertama ialah pembentukkan hexaonyl CoA
dilanjutkan tahap kedua berupa pembentukkan decaketide
anthraquinone.
Biosintesis aflatoksin merupakan proses yang sangat kompleks
(Gambar 2 . 5.) dan diatur oleh gen-gen yang tersusun dalam suatu
kelompok gen. Efek posisi kromosomal dan juga beberapa gen regulator
akan bergantung pada kontrol nutrisi dan lingkungan. Aflatoksin seperti
halnya patulin dan fumonisin, memiliki jalur biosintesis polipeptida
dengan metabolit primer berupa Asetil koenzim-A. Meskipun demikian,
pentingnya produksi aflatoksin secara biologis maupun dalam kaidah
evolusi bagi kapang itu sendiri masih sangat sedikit dipahami.
Aflatoksin merupakan metabolit sekunder yang umumnya diasosiasikan
dengan respon kapang terhadap lingkungan yang membatasi pertumbuhan.

10
Gambar 2.5. Struktur Molekul Berbagai Jenis Aflatoksin

2.3. Protein Bioaktif


Secara biologi, protein bioaktif adalah peptida yang diturunkan dari
makanan, dibalik nilai nutrisinya yang mengandung pengaruh hormone-like
pada manusia. Protein bioaktif dapat ditemukan pada telur, susu, daging,
ikan, dan juga pada beberapa tumbuhan seperti alga. Protein bioaktif bersifat
tidak aktif diantara sekuens protein induknya dan dapat dihasilkan baik
selama proses pencernaan di saluran pencernaan atau selama proses
pengolahan (Erdmann et al., 2008)
Protein bioaktif biasanya mengandung 2-20 residu asam amino pada
setiap molekul, tetapi pada beberapa kasus kemungkinan lebih dari 20 asam
amino. Selama proses pencernaan, protein bioaktif dapat diabsorpsi di usus
halus dan masuk ke sirkulasi darah dan memberikan pengaruh sistemik, atau

11
menghasilkan pengaruh lokal pada saluran pencernaan (Erdmann et al.,
2008).
Protein bioaktif dapat dihasilkan dengan tiga cara, yaitu melalui hidrolisis
menggunakan enzim pencernaan, hidrolisis dengan mikroorganisme
proteolitik, dan melalui aksi enzim proteolitik dari mikroba atau tanaman.
Banyak protein bioaktif diketahui dihasilkan menggunakan enzim-enzim
pencernaan, biasanya pepsin dan tripsin. Sebagai contoh inhibitor peptida
Angiotensin-converting enzyme (ACE) dan Calcium-binding phosphopeptide
(CPPs) dihasilkan dari tripsin. Selain itu dilaporkan bahwa enzim pencernaan
lainnya dan kombinasi enzim yang berbeda dengan protease termasuk
alcalase, chymotrypsin, pancreatin, pepsin, dan enzim-enzim dari bakteri dan
fungi juga telah dimanfaatkan untuk menghasilkan protein bioaktif.

12
BAB III
METODE PENELITIAN

3.1. Alat dan Bahan


3.1.1. Bahan
a. Makroalga Turbinaria decurrens Bory
b. Biakan murni kapang Aspergillus flavus
c. Ammonium sulfat
d. Aquades
e. Medium Czapek-Dox Agar
f. Buffer A dingin (Tris(hydroksimetil)- aminometana 0,1 M, pH 8,3
yang mengandung NaCl 2 M, CaCl2 0,01 M, -merkaptoetanol 1%,
Triton X-100 0,5 %)
g. Buffer B (Tris(hydroksimetil)-aminometana 0,1 M, pH 8,3 yang
mengandung NaCl 0,2 M, CaCl2 0,01 M)
h. Buffer C (Tris(hydroksimetil)-aminometana 0,01 M, pH 8,3 yang
mengandung NaCl 0,2 M, dan CaCl2 0,01 M)
i. BSA (Bovine Serum Albumin)
j. Amfoterisin
k. Kapas
l. Aluminium foil.

3.1.2. Alat
a. Cawan petri
b. Pencandang besi
c. Labu Erlenmeyer
d. Pinset
e. Bunsen
f. Sentrifuge
g. Spektrofotometer UV-Vis
h. Corong Buchner
i. Timbangan analitik
j. Pisau
k. Blender
l. Vortex
m. Lemari pendingin
n. Beaker glass 100mL
o. Gelas ukur 10 mL
p. Tangas air
q. Kantong selofan
r. Inkubator
s. Mistar geser

13
t. Reagen Folin-Ciocalteu

3.2. Prosedur Penelitian


3.2.1. Ekstraksi dan Isolasi Protein Bioaktif Makroalga
Ekstraksi dan isolasi protein bioaktif dari makroalga menggunakan
prosedur dari metode sebelumnya (Arifudin dkk, 2001, yang
dimodifikasi), sebagai berikut :
a. Disiapkan sebanyak 1000 gram berat segar makroalga Turbinaria
decurrens Bory yang telah dipotong kecil-kecil.
b. Dihomogenisasi menggunakan blender dan ditambahkan buffer A.
c. Disaring dengan corong Buchner.
d. Filtrat yang diperoleh dibeku-cairkan 2-3 kali.
e. Disentrifugasi pada kecepatan 12.000 rpm pada suhu 4 oC selama 30
menit.
f. Disimpan bagian supernatan dalam lemari es sebelum dilakukan
pengujian selanjutnya.

3.2.2. Penentuan Konsentrasi Protein


Penentuan kadar protein pada supernatan yang telah didinginkan dilakukan
dengan metode Lowry dan menggunakan BSA (Bovine Serum Albumin)
sebagai standar, sebagai berikut :
a. Diambil 1 mL supernatan atau larutan standar, ditambahkan 1 mL
NaOH 2N.
b. Dihidrolisis pada 100oC selama 10 menit pada penangas air.
c. Dinginkan pada suhu ruangan, ditambahkan 5 mL reagen pembentuk
kompleks, dibiarkan larutan selama 10 menit pada suhu kamar.
d. Ditambahkan 0.5 mL reagen Folin-Ciocalteu, dihomogenkan dengan
vortex, biarkan selama 30-60 menit.
e. Dibaca absorbansi pada spektrofotometer dengan panjang gelombang
maksimal 660 nm jika konsentrasi protein di bawah 500 g/mL, atau
550 nm jika konsentrasi protein antara 100 2000 g/mL.

3.2.3. Fraksinasi dan Dialisis Protein

14
a. Supernatan (ekstrak kasar) yang mengandung protein dan memiliki
aktivitas antimikroba difraksinasi dengan menggunakan amonium
sulfat pada tingkat kejenuhan masing-masing : 0 20 %, 30 40 %, 40
60% dan 60 80 %.
b. Endapan yang diperoleh setelah fraksinasi dari masing-masing tingkat
kejenuhan amonium sulfat disuspensikan dalam sejumlah buffer B.
c. Didialisis dalam buffer C menggunakan kantong selofan (sigma)
sampai larutan buffernya tidak berubah warna.

3.2.4. Pengujian Aktivitas Anti Jamur


Pengujian daya hambat protein bioaktif terhadap pertumbuhan jamur
(Aspergillus flavus) dilakukan dengan metode difusi agar
menggunakan pencandang silinder besi, sebagai berikut :
a. Pencandang besi diletakkan diatas seed layer pada medium
Czapek-Dox Agar kemudian sampel dimasukkan kedalam
pencandang sebanyak 250 L, ditambah serbuk Amfoterisin.
b. Diinkubasi selama 2 x 24 jam pada suhu 25o-30oC lalu diamati dan
diukur zona hambatanya dengan mistar geser.
c. Pengujian dilakukan secara duplo dan diulang sebanyak 3 kali
eksperimen untuk menghasilkan data yang representatif.
DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, T., E. Suryati, and Muliani. 1995. Screening Sponges and algae For
Bactericide to be Used In Shrimp Culture. Indon. Fish. Res. J. 1(1): 1 - 10.

Amaike, S., & Keller, N. P. (2010). Aspergillus flavus. Annual Review of


Phytopathology, (93204055), 899900. https://doi.org/10.1146/annurev-
phyto-072910-095221

Arifudin, Rauf Patong, dan Ahyar Ahmad. (2001). Penelusuran Protein Bioaktif
Dalam Makroalga sebagai Bahan Antibakteri dan Antijamur. Marina
Chimica Acta, Oktober 2001, hal.11-18.

Erdmann K., Cheung B.W.Y., Schrder H. (2008). The Possible Roles Of Food
Derived Bioactive Peptides In Reducing The Risk Of Cardiovascular
Disease. J. Nutr. Biochem., 2008, 19, 643654.

15
Hedayati, M. T., Pasqualotto, A. C., Warn, P. A., Bowyer, P., & Denning, D. W.
(2017). Aspergillus flavus: human pathogen , allergen and mycotoxin
producer, (2007), 16771692. https://doi.org/10.1099/mic.0.2007/007641-0

Nybakken, J. W. 1993. Marine Biology, Third Edition. Harper Collins College


Publisher.

Racmaniar. 1996. Produk Alam Laut sebagai Lead Compound untuk Farmasi dan
Pertanian. Dibawakan Pada Seminar Sehari Perspeltik Baru dalam Drug
Discovery. Makassar, 26 Oktober 1996.

RuiQian, L., Rui, H., YueBing, Z., YuMei, X., & JianMing, W. (2009).
Establishment of ISSR reaction system of Aspergillus and its analysis of
genetic diversity. Science Agriculture Sinica, 42(9), 31393146.

Vujanovic, V., Smoragiewicz, W. & Krzysztyniak, K. (2001). Airborne Fungal


Ecological Niche Determination As One Of The Possibilities For Indirect
Mycotoxin Risk Assessment In Indoor Air. Environ Toxicol 16, 18.

Zambrowicz, A., Timmer, M., Eckert, E., & Trziszka, T. (2013). Evaluation Of
The Ace-Inhibitory Activity Of Egg-White Proteins Degraded With Pepsin.
Polish Journal of Food and Nutrition Sciences, 63(2), 103108.
https://doi.org/10.2478/v10222-012-0069-1

16