EVALUACIN DE PELCULAS DE QUITOSANO SUPLEMENTADAS CON

ACEITES ESENCIALES DE ORGANO (Origanum vulgare L.) Y ROMERO

(Rosmarinus officinalis) COMO POSIBLES AGENTES ANTIMICROBIANOS Y

ANTIOXIDANTES

Trabajo de grado presentado para optar por el ttulo de Ingeniero de Materiales

Leidy Vanessa Monsalve Moreno

Directores

Mayra Eliana Valencia Zapata

Master en Ingeniera de Materiales

Carlos David Grande Tovar

Doctor en Ciencias Qumicas

Universidad de San Buenaventura

Facultad de Ingeniera

Ingeniera de Materiales

Santiago de Cali Valle del Cauca

2014
 TABLA DE CONTENIDO

Introduccin ............................................................................................................................ 1

Justificacin ............................................................................................................................ 2

Objetivos ................................................................................................................................. 3

Objetivo general .......................................................................................................................... 3

Objetivos especficos................................................................................................................... 3

Estado del arte ......................................................................................................................... 4

La quitina 4

El quitosano 4

Aplicaciones de la quitina y el quitosano .................................................................................... 7

Aceites esenciales........................................................................................................................ 8

Organo ................................................................................................................................... 9

Romero .................................................................................................................................... 9

Proceso de hidrodestilacin ....................................................................................................... 10

Pelculas biodegradables ........................................................................................................... 11

7Patgenos 12

Bacteria Escherichia coli (E. coli)......................................................................................... 12

Bacteria Bacillus subtilis (B. subtilis).................................................................................... 13

Fabricacin de pelculas de quitosano para recubrimiento de alimentos a partir de quitosano 13

Pelculas de quitosano con sorbato de potasio....................................................................... 13

Pelculas de quitosano con aceites esenciales de comino y clavo ......................................... 14

Pelculas de quitosano con aceite esencial de canela ............................................................ 14

Pelculas de quitosano con aceite esencial de romero ........................................................... 14

Pelculas de quitosano con aceite esencial de limn ............................................................. 15

 Pelculas de quitosano con aceite esencial de tomillo ........................................................... 15

Pelculas de quitosano con aceite esencial Boiss y extracto de semilla de uva ..................... 15

Pelculas de quitosano contra diferentes bacterias ................................................................ 16

Metodologa experimental .................................................................................................... 17

Materiales 17

Diseo experimental .................................................................................................................. 17

Descripcin de la unidad experimental ................................................................................. 17

Factores, niveles y tratamientos............................................................................................. 19

Extraccin y obtencin de quitosano ........................................................................................ 20

Limpieza ................................................................................................................................ 20

Secado.................................................................................................................................... 21

Trituracin ............................................................................................................................. 21

Despigmentacin ................................................................................................................... 21

Desmineralizacin ................................................................................................................. 22

Desproteinizacin .................................................................................................................. 22

Desacetilacin........................................................................................................................ 23

Caracterizacin del quitosano ................................................................................................... 23

Titulacin potenciomtrica .................................................................................................... 23

Determinacin del peso molecular ........................................................................................ 24

Espectroscopia infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR) ........................................... 25

Caracterizacin de las plantas ................................................................................................... 25

Clasificacin taxonmica ...................................................................................................... 25

Determinacin del Contenido de humedad ........................................................................... 26

Extraccin del aceite esencial ................................................................................................ 26

Anlisis por cromatografa de gases ...................................................................................... 27

 Preparacin de las pelculas de quitosano ................................................................................. 28

Caracterizacin pelculas de quitosano ..................................................................................... 28

Propiedades fsicas de las pelculas ....................................................................................... 28

Microscopia electrnica de barrido (SEM) ........................................................................... 31

Microscopia de fuerza atmica (AFM) ................................................................................. 31

Contenido total de fenoles (TPC) .......................................................................................... 32

Actividad antioxidante ........................................................................................................... 33

Propiedades mecnicas .......................................................................................................... 33

Actividad antimicrobiana ...................................................................................................... 34

Discusin y anlisis de resultados......................................................................................... 36

Extraccin y obtencin de quitosano ........................................................................................ 36

Caracterizacin del quitosano ................................................................................................... 37

Titulacin potenciomtrica .................................................................................................... 37

Determinacin del peso molecular ........................................................................................ 39

Espectroscopia infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR) ........................................... 41

Caracterizacin de las plantas ................................................................................................... 44

Clasificacin taxonmica ...................................................................................................... 44

Contenido de humedad de las plantas.................................................................................... 45

Extraccin del aceite esencial ................................................................................................ 46

Anlisis por cromatografa de gases ...................................................................................... 49

Preparacin de la pelcula de quitosano .................................................................................... 52

Caracterizacin pelculas de quitosano ..................................................................................... 53

Propiedades fsicas de las pelculas ....................................................................................... 53

Microscopia electrnica de barrido ....................................................................................... 59

Microscopia de fuerza atmica .............................................................................................. 61

 Contenido total de fenoles ..................................................................................................... 64

Actividad antioxidante (DPPH) ............................................................................................. 65

Propiedades mecnicas .......................................................................................................... 66

Actividad antimicrobiana ...................................................................................................... 67

Conclusiones ......................................................................................................................... 71

Bibliografa ........................................................................................................................... 72
 LISTA DE TABLAS

Tabla 1. Capacidad antioxidante y contenido total de fenoles del organo y el romero. 9

Tabla 2. Factores, niveles y tratamientos del primer experimento. 20

Tabla 3. Factores, niveles y tratamientos del segundo experimento. 20

Tabla 4. Parmetros viscosimtricos. 24

Tabla 5. Estandarizacin de color segn la diferencia total de color (E) 31

Tabla 6. Parmetros para la extraccin de quitosano a partir de exoesqueleto de camarn. 36

Tabla 7. Datos de la titulacin potenciomtrica del quitosano experimental y el quitosano

comercial. 38

Tabla 8. Medidas viscosimtricas de quitosano comercial al 1% v/v de cido actico a 25C. 39

Tabla 9. Medidas viscosimtricas de quitosano experimental al 1% v/v de cido actico a 25C.

39

Tabla 10. Clasificacin taxonmica planta 1 (Origanum vulgare L. L.) 44

Tabla 11. Clasificacin por parmetros fsicos planta 1 (Origanum vulgare L. L.) 44

Tabla 12. Clasificacin taxonmica planta 2 (Rosmarinus officinalis.) 45

Tabla 13. Clasificacin por parmetros fsicos planta 2 (Rosmarinus officinalis.) 45

Tabla 14. ANOVA de dos factores: rendimiento (ml/g) vs. Tipo de planta*tiempo de secado. 47

Tabla 15. Mtodo de Tukey con una confianza de 95,00%. 48

Tabla 16. Composicin qumica de AEO (Origanum vulgare L.). 50

Tabla 17. Composicin qumica de AER (Rosmarinus officinalis). 51

Tabla 18. Datos del anlisis termo gravimtrico de las pelculas de quitosano comercial

suplementadas con aceites esenciales. 57

Tabla 19. ngulos de contacto de las pelculas de quitosano. 58

Tabla 20. Colorimetra y opacidad de las pelculas de quitosano. 59

Tabla 21 Rugosidad de las pelculas de quitosano comercial suplementadas con aceites

esenciales 62

Tabla 22. Propiedades mecnicas de las pelculas de quitosano 66

Tabla 23. Porcentaje de inhibicin de pelculas de quitosano suplementadas con aceites

esenciales. 68
 LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estructura de la quitina. 4

Figura 2. Estructura qumica de la quitina y el quitosano. 5

Figura 3. Estructura y carcter catinico del quitosano en disolucin cida. 6

Figura 4. Esquema secuencial de la actividad antimicrobiana del quitosano. 7

Figura 5. Esquema del proceso de hidrodestilacin. 11

Figura 6. Unidad experimental. 18

Figura 7. Diagrama de bloques que describe el diseo experimental del primer experimento. 18

Figura 8. Diagrama de bloques que describe el diseo experimental del segundo experimento. 19

Figura 9. Montaje del proceso de hidrodestilacin (A), hidrodestilacin de organo (B),

hidrodestilacin de romero (C) y obtencin de aceite esencial (D). 27

Figura 10. Titulacin potenciomtrica del quitosano experimental y el quitosano comercial. 38

Figura 11. Curva de viscosidad reducida vs concentracin de quitosano comercial en soluciones

al 1% de cido actico. 40

Figura 12. Curva de viscosidad reducida vs concentracin de quitosano experimental en

soluciones al 1% de cido actico. 40

Figura 13. FTIR de quitina experimental. 42

Figura 14. FTIR de quitosano experimental. 43

Figura 15. FTIR de quitosano comercial. 43

Figura 16. Extraccin de aceite esencial de romero y organo a diferentes tiempos de secado (5,

10 y 15 horas). 46

Figura 17. Interaccin del tipo de planta segn el rendimiento (ml/g). 49

Figura 18. Pelcula de quitosano experimental PQE (A), pelcula de quitosano comercial PQC

(B), PQC con 0,4% organo (C), PQC con 1,5% organo (D), PQC con 0,4% romero (E) y PQC

con 1,5% romero (F). 52

Figura 19. Espesor de las pelculas. 53

Figura 20. Porcentaje de humedad de las pelculas. 54

Figura 21. Anlisis termogravimtrico de las pelculas de quitosano comercial suplementadas

con aceites esenciales. 56

Figura 22. DTGA de las pelculas de quitosano comercial suplementadas con aceites esenciales.

56

Figura 23. Imgenes de microscopa electrnica de barrido de la pelcula (A) control de

quitosano, (B) con 0,4% de aceite esencial de organo y (C) con 1,5% de aceite esencial de

organo. 60

Figura 24. Imgenes de microscopa electrnica de barrido de la seccin transversal de la

pelcula (A) control de quitosano, (B) con 0,4% de aceite esencial de organo y (C) con 1,5% de

aceite esencial de organo. 60

Figura 25. Imgenes de microscopa electrnica de barrido de la superficie de las pelculas (A)

con 0,4% de aceite esencial de romero y (B) con 1,5% de aceite esencial de romero. 61

Figura 26. Imgenes de microscopa electrnica de barrido de la seccin transversal de las

pelculas (A) con 0,4% de aceite esencial de romero y (B) con 1,5% de aceite esencial de

romero. 61

Figura 27. AFM pelcula de quitosano con aceite esencial de organo al 0,4% (a) y AFM pelcula

de quitosano con aceite esencial de organo al 1,5% (b). 63

Figura 28. AFM pelcula de quitosano con aceite esencial de romero al 0,4% (a) y AFM pelcula

de quitosano con aceite esencial de romero al 1,5% (b) 63

Figura 29. Curva de calibracin del cido glico equivalente. 64

Figura 30. Contenido total de fenoles para las pelculas de quitosano suplementadas con aceites

esenciales de organo y romero. 64

Figura 31. Captacin de radical libre de las pelculas. 66

Figura 32. Porcentaje de inhibicin de las pelculas de quitosano frente a E. coli y B. Subtillis. 68

Figura 33. Porcentaje Inactivacin de E. coli de las pelculas de quitosano suplementadas con

aceites esenciales. 69

Figura 34. Porcentaje Inactivacin de B. subtilis de las pelculas de quitosano suplementadas con

aceites esenciales. 69
 RESUMEN

En este trabajo se presentan los resultados obtenidos implementando pelculas de

quitosano suplementadas con aceites esenciales de organo y romero, a concentraciones del 0,4%

y 1,5% (v/v), en donde se evalu su comportamiento como agentes antioxidantes y

antimicrobianos frente a las bacterias patgenas E. coli y B. subtilis. La incorporacin de aceites

esenciales permiti mejorar las propiedades fsicas, antioxidantes y antimicrobianas de las

pelculas, siendo la pelcula con aceite de romero en una concentracin del 1,5 % (v/v), el

resultado ms promisorio de la investigacin. La pelcula con aceite de romero al 1,5% obtuvo

los siguientes resultados: en la colorimetra se obtuvo una diferencia total de color de de 11,83

1,56, acorde con la norma ISO 12647-2 un contenido total de fenoles del 0,0523 mg de cido

glico equivalente (AGE)/g de pelcula, captacin de radical libre del 16,47% y porcentaje de

inhibicin del 11,96% y 36,29% frente a E. coli y B. subtilis, respectivamente.

Palabras claves: Pelculas de quitosano, aceites esenciales, capacidad antioxidante,

actividad antimicrobiana, propiedades mecnicas.

 ABSTRACT

The results obtained by implementing chitosan films supplemented with essential oils of

rosemary and oregano, at concentrations of 0.4% and 1.5% (v / v), where their performance was

evaluated as antioxidants and antimicrobials are presented in this work against pathogenic E. coli

and B. subtilis. Incorporating essential oils allowed improve physical, antioxidants and

antimicrobial properties of the films, the film being rosemary oil at a concentration of 1.5% (v /

v), the most promising research result. The film with rosemary oil 1.5% obtained the following

results: a total difference colorimetry color quality is obtained according to the ISO 12647-2

standard with a value of 11.83 1.56, total content 0.0523 mg gallic acid equivalent (GAE) / g

of film, free radical capture 16.47% and percent inhibition of 11.96% and 36.29% against E. coli

and B. subtilis, respectively.

Keywords: Chitosan films, Essential oils, Antioxidant capacity, Antimicrobial activity,

Mechanical properties.
 INTRODUCCIN

El sector alimentario est en constante riesgo de contaminacin, debido a todos los

agentes externos a los cuales los alimentos estn expuestos, por lo tanto actualmente se estudian

diferentes mtodos de conservacin de alimentos, libres de preservativos qumicos; resaltando la

utilizacin del quitosano, un biopolmero derivado de los residuos del sector martimo,

especficamente, de los camarones.

Colombia es uno de los treinta principales pases en la actividad de captura de camarn y

langostino, con ms de 7.246 toneladas al ao (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural

Observatorio Agrocadenas Colombia, 2005), lo cual lo convierte en una excelente fuente de

quitosano, permitiendo no solo el desarrollo investigativo, sino tambin el buen manejo y

aprovechamiento de los residuos generados en la industria martima, como lo es el caparazn de

los camarones. Estos caparazones se componen principalmente de un polisacrido conocido

como quitina, de la cual se extrae el biopolmero quitosano. El quitosano es un excelente

aspirante para recubrimientos protectores de alimentos, no solo por sus caractersticas no txicas

y no alergnicas, sino tambin porque proviene de una fuente renovable, es biodegradable y

posee buenas propiedades antimicrobianas (Mrmol, y otros, 2011).

La presente investigacin pretende evaluar las propiedades antioxidantes y

antimicrobianas de las pelculas de quitosano frente a algunos agentes externos que deterioran

los alimentos, por medio de la incorporacin de aceites esenciales de organo y romero, para

mejorar la vida til de los alimentos.

1
 JUSTIFICACIN

En los ltimos aos se ha reportado un incremento en las intoxicaciones alimentarias,

provocadas principalmente por alimentos de origen animal, a causa del aumento del comercio

internacional, los cambios en la produccin y en el consumo de alimentos, y la aparicin de

nuevos patgenos. Lo anterior propicia la investigacin y desarrollo de nuevos de materiales que

promuevan la conservacin de los alimentos, como lo es el quitosano.

Actualmente, se ha trabajado con pelculas de quitosano como preservantes en la

industria de alimentos de origen animal, debido al incremento de la contaminacin por

microorganismos patgenos los cuales provocan enormes prdidas en la industria alimentaria y

la economa (FAO/WHO (Food and Agriculture Organization World Health Organization),

2003). Adicionalmente, las pelculas de quitosano con aceites esenciales son biocompatibles,

biodegradables y seguras para el consumo humano, adems se ha investigado su aplicacin en la

conservacin de alimentos.

El presente trabajo busca evaluar las propiedades de las pelculas de quitosano frente a la

inhibicin de agentes externos que deterioren los alimentos, adicionalmente se pretende

incorporar aceites esenciales en las pelculas para mejorar sus propiedades antioxidantes y

antimicrobianas, debido a que estos aceites se componen de compuestos fenlicos que facilitan la

preservacin de los alimentos frente a la oxidacin lipdica.

2
 OBJETIVOS

1. Objetivo general

Evaluar las propiedades antimicrobianas y antioxidantes de pelculas de quitosano

suplementadas con aceites esenciales.

2. Objetivos especficos

Extraer quitosano a partir de las conchas de camarn.

Caracterizar fisicoqumicamente el quitosano obtenido.

Preparar pelculas de quitosano y suplementarlas con aceites esenciales de

organo y romero obtenidos por hidrodestilacin.

Evaluar las propiedades fsicas (espesor, aspecto, absorcin) y mecnicas

(tensin) de las pelculas.

Evaluar la capacidad de inhibicin de las pelculas de quitosano

suplementadas con aceites esenciales hacia las bacterias patgenas E. coli y B.

subtilis.

3
 ESTADO DEL ARTE

1. La quitina

La quitina es el principal componente de la estructura del exoesqueleto de los animales

invertebrados: crustceos, insectos y arcnidos; encontrndose presente en algas y en la mayora

de hongos. (Fornaguera & Gmez, 2004). La quitina es un polisacrido natural de alto peso

molecular, formado por unidades repetidas de n-acetil-d-glucosamina; cabe destacar que es el

polisacrido ms abundante en la naturaleza despus de la celulosa, y su principal derivado es el

quitosano, el cual es quitina desacetilada.

Adicionalmente la quitina es un biopolmero altamente insoluble en agua, lo cual limita

sus aplicaciones (Investigacin y Desarrollo, 2000). Sin embargo, posee una estructura porosa la

cual favorece a una elevada absorcin de agua (Ramrez, Rodrguez, Alfonso, & Peniche, 2010).

Figura 1. Estructura de la quitina.

Fuente: (Mrmol, y otros, 2011)

2. El quitosano

Es un polisacrido de alto peso molecular, obtenido por desacetilacin parcial de la

quitina en donde tiene lugar la sustitucin de los grupos acetamido de la misma, por grupos

amino, al tratar la quitina con lcalis fuertes (Mrmol, y otros, 2011).

4
 El quitosano posee propiedades particulares muy importantes por ser el nico poli

electrlito catinico disponible en la naturaleza. Con respecto a su solubilidad, es soluble en

cidos orgnicos diluidos, gelificando y coagulando en medio dbilmente acido o neutro.

Adicionalmente tiene la capacidad de formar filmes semipermeables al O2 y CO2 y tiene

propiedades anti fngicas, posibilitando su aplicacin en la preservacin de alimentos

(Valderrama, 2000).

Figura 2. Estructura qumica de la quitina y el quitosano.

Fuente: (Flores Vasquez, Ly, Tapia Huanambal, & Maldonado Garcia, 2001)

La composicin qumica de las cadenas de quitosano depende de la fuente y el mtodo de

obtencin del mismo (Rhazi, Desbrieres, Tolaimate, Alagui, & Vottero, 2000). Con respecto a la

fuente se pueden distinguir dos tipos de quitosano (Q): el primero -Q presenta cadenas anti

paralelas y se encuentra presente en la cutcula de crustceos como cangrejos, camarones,

langostinos, etc. y en menor proporcin en la cutcula de hongos, levaduras e insectos; y el

segundo -Q presenta cadenas paralelas y se obtiene desde la pluma cartilaginosa interna del

endoesqueleto de calamares. En relacin al mtodo de obtencin del quitosano, se ha reportado

que el ms utilizado es la metodologa de evaporacin del solvente y moldeado (Tolaimate, y

otros, 2000).
5
 Cabe sealar que la variabilidad de la actividad antimicrobiana del quitosano y su

capacidad inhibitoria es influenciada por el tipo de quitosano ( -quitosano), el grado de

desacetilacin, el peso molecular, el organismo blanco y las condiciones del medio en que se

deposita (pH).

Adicionalmente, los mecanismos de accin antimicrobiana del quitosano estn vinculados

a su estructura qumica y difieren del microorganismo (Hernandez-Lauzardo, y otros, 2008), a

continuacin se nombran los tipos de mecanismos que se presentan:

Carcter catinico: Se basa en las cargas positivas que posee el quitosano (NH3+), las

cuales juegan un papel importante en la actividad antibacteriana de las membranas

celulares de los microorganismos (Rabea, Badawy, Stevens, Smagghe, & Steurbaut,

2003), debido a que el quitosano forma canales de transporte de molculas mediante

bicapas lipdicas artificiales, lo cual presume que el quitosano puede desorganizar la

membrana celular (Zakrzewska, y otros, 2007).

Figura 3. Estructura y carcter catinico del quitosano en disolucin cida.

Fuente: (Valenzuela V. & Arias, 2012)

6
 Agente quelante: El quitosano tiene la capacidad de actuar como agente quelante, por

medio de la formacin de complejos con metales trazas (como Ni 2+, Cu2+ y otros) y en

condiciones acidas, permitiendo la inhibicin del desarrollo microbiano de los

microorganismos (Rabea, Badawy, Stevens, Smagghe, & Steurbaut, 2003).

Penetracin al interior de la clula: En este caso son los oligmeros de quitosano de bajo

peso molecular los que penetran en las clulas de los microrganismos, impidiendo el

crecimiento de estas (Tharanathan & Kittur, 2003).

Adsorcin del
Difusin a travs
quitosano y/o Interrupcin de la
de la pared celular
oligmeros de membrana
e interrupcin de
quitosano sobre la citoplasmtica
su funcin
clula bacteriana

Generacin de
fugas de los
Muerte de la clula
constituyentes
citoplsmaticos

Figura 4. Esquema secuencial de la actividad antimicrobiana del quitosano.

Fuente: (Ikeda, Tazuk, & Suzuki, 1984)

3. Aplicaciones de la quitina y el quitosano

Las aplicaciones de la quitina y sus derivados son extensas, su utilizacin se encuentra en

la industria de alimentos y bebidas, y en la agricultura. En el primer caso se emplean pelculas de

quitosano como recubrimientos comestibles, las cuales son resistentes, duraderas y flexibles, con

propiedades mecnicas similares a algunos polmeros comerciales de fuerzas medias. Se ha

7
comprobado que concentraciones mayores al 0,02% de quitosano, protegen los alimentos frente

al patgeno Escherichia coli (Peral & Gartzia, 2001).

En relacin con la agricultura, la adicin de quitina y sus derivados al suelo, beneficia al

crecimiento y a la actividad de muchos organismos qutinolticos, debido a un efecto sinrgico.

La quitina y sus derivados son potenciales sustitutos de los actuales plaguicidas qumicos y/o

reguladores del crecimiento de las plantas (Ramrez, Rodrguez, Alfonso, & Peniche, 2010).

Cabe destacar que las propiedades del quitosano son verdaderamente tiles en la

agricultura, debido a su actividad bactericida, actividad fungicida, actividad antiviral,

estimulacin del crecimiento e induccin de resistencia; las cuales permiten la preservacin de

alimentos y promueven el desarrollo de la agricultura (Lrez Velsquez, 2008).

4. Aceites esenciales

Los aceites esenciales son mezclas de varias sustancias qumicas biosintetizadas por las

plantas, que dan el aroma caracterstico a algunas flores, arboles, frutas, hierbas, especias,

semillas y a ciertos extractos de origen animal. Estos presentan propiedades antimicrobianas, las

cuales inhiben el crecimiento de patgenos en los alimentos (Burt, 2004).

En el caso de Colombia, algunas plantas ampliamente reconocidas son: el romero y el

organo (Secretaria de Agricultura y Pesca), las cuales evidencian propiedades antimicrobianas

como se puede constatar en la Tabla 1.

8
 Tabla 1. Capacidad antioxidante y contenido total de fenoles del organo y el

romero.

Planta Nombre en latn Familia DPPH (mg AAE/g) Fenoles (mg GAE/G)

Organo Origanum vulgare L. Lamiaceae 209,1 91,4

Romero Rosmarinus officinalis L. Lamiaceae 44,7 -

Organo

El aceite de organo es el primer antisptico natural y posee propiedades de agente

antimicrobiano. Es un agente anti fngico herbal, no toxico, antibacterial y antioxidante. Con

respecto a la extraccin del aceite de organo, se hace a partir de las hojas principalmente, y se

ha reportado que tanto las hojas como los extractos obtenidos de estas, han inhibido la oxidacin

lipdica en sistemas alimentarios, debido a la presencia de varios componentes fenlicos

(Yanishlieva, Marinova, & Pokorny, 2006).

Romero

El aceite de romero posee propiedades antioxidantes, que obedecen al efecto conjugado

del eucaliptol, el pineno y el cido rosmarnico; en donde los dos primeros pertenecen a

compuestos monoterpenoides que se caracterizan por su interaccin con radicales libres, lo que

impide que las reacciones en cadena se lleven a cabo, mientras el cido rosmarnico es un

compuesto fenlico con cuatro grupos hidroxilo en su estructura, los cuales benefician la

reaccin entre el antioxidante y el radical libre para impedir la propagacin de ms radicales.

(Wang, y otros, 2011)

9
 En segundo lugar, el problema de mayor relevancia en el rea de alimentos es la

oxidacin lipdica, la cual ocasiona efectos adversos en la calidad de los productos y en la salud

humana. Ahora bien una de las formas de contrarrestar este efecto es la adicin de antioxidantes

sintticos, sin embargo actualmente se ha relacionado su ingesta con el desarrollo de

enfermedades cancergenas lo cual promueve la investigacin de fuentes naturales con capacidad

antioxidante, como lo son los aceites esenciales de origen vegetal (Yanishlieva, Marinova, &

Pokorny, 2006).

La capacidad antioxidante est directamente relacionada con la propiedad de inhibicin,

la cual es anloga a los compuestos fenlicos que componen las plantas. Estos compuestos son

metabolitos secundarios que se localizan en todas las partes de las plantas y participan en

numerosas funciones, tales como: la asimilacin de nutrientes, la fotosntesis y ms importante

an las propiedades antioxidantes de los alimentos de origen vegetal. Cabe resaltar que la

caracterstica antioxidante de los fenoles se debe a la reactividad del grupo fenol (Robbins, 2003)

(Khknen, Marja, Anu, & Heinonen, 2001).

5. Proceso de hidrodestilacin

Para la obtencin de aceites esenciales se emplea el mtodo de hidrodestilacin, el cual

consiste en la destilacin de las flores u otras partes de la planta empleando vapor de agua. El

proceso consiste en que el vapor de agua transporta el aceite esencial que contienen las flores,

teniendo en cuenta que el punto de ebullicin de la mezcla de aceite esencial ms agua es menor

al punto de ebullicin del agua, lo cual permite que sea destilada (Snchez, 2006).

10
 Figura 5. Esquema del proceso de hidrodestilacin.
Fuente: (Cerpa Chvez, 2007)

6. Pelculas biodegradables

Las pelculas comestibles o plsticos biodegradables son aquellos materiales que cuando

son expuestos a condiciones determinadas de humedad, flora microbiana y oxigeno durante un

periodo de varios meses, se transforman en sustancias sencillas (como el agua y dixido de

carbono (CO2)) y en biomasa mediante la accin enzimtica de los microorganismos (bacterias,

hongos et al.) presentes en el medio ambiente. Las pelculas comestibles se emplean en

diferentes reas (medicina, agricultura, alimentacin, envases y embalaje, entre otros) teniendo

en cuenta las caractersticas funcionales que debe presentar el material segn la aplicacin

especfica a la que se destine (Parzanese, 2003).

Las pelculas de quitosano son empleadas como recubrimiento de alimentos gracias a

que son bioadherentes, altamente biocompatibles, transparentes e incoloras. Una de las

caractersticas ms representativas para considerarlas pelculas comestibles es que presentan baja

11
toxicidad, con un DL50 = 16 ml/kg, valor similar al del azcar y es menos toxico que la sal

(Romanazzi, Nigro, Ippolito, Diverene, & Salerno, 2002).

Adicionalmente la quitina y el quitosano se biodegradan in vivo, haciendo posible que sus

productos de degradacin (oligosacridos o monosacridos) sean absorbidos o excretados

(Dinesh & Alok, 2000). Lo anterior se fundamenta en que, tanto la quitina como el quitosano son

susceptibles a la hidrlisis enzimtica de los enlaces (14) mediana por la enzima lisozima, la

cual se encuentra presente en el organismo humano (Castaeda Ramrez, M. de la Fuente

Salcido, Pacheco Cano, Ortiz-Rodrguez, & Barboza Corona, 2011).

7. Patgenos

Las propiedades antimicrobianas de soluciones y pelculas de quitosano frente a

patgenos como Bacillus subtilis y Escherichia coli, han sido reportadas por diversos autores.

Por ejemplo, se han reportado estudios de las pelculas de quitosano con capacidad de inhibir B.

subtilis y E. coli presentes en la carne de vacuno (Darmadji & Izumimoto, 1994), la carne de

cerdo (Park, Youn, Kim, & Ahm, 1999) y la salchicha (Rao, Chander, & Sharma, 2005);

adicionalmente E. coli se presenta en el tocino (Lee, Park, & Ahn, 2003), y el filete de bacalao

(Rao, Chander, & Sharma, 2005).

Bacteria Escherichia coli (E. coli)

Es una bacteria anaerobia facultativa con un tipo de metabolismo que es a la vez

fermentativo y respiratorio. Es o no mvil mediante flagelos peritricos. Las cepas de E. coli son

un importante habitante facultativo del intestino grueso, ampliamente distribuido en el intestino

de los seres humanos y animales de sangre caliente y es el anaerobio facultativo predominante en

el intestino y parte de la microbiota esencial que mantiene la fisiologa del husped sano. Por

12
otra parte E. coli es usada como indicador en la contaminacin del agua y las heces; sin embargo

es considerada un riesgo de contaminacin no solo en el agua, sino tambin en productos

alimenticios debido al incremento en su contaminacin (Torres, 2010).

Bacteria Bacillus subtilis (B. subtilis)

Es una bacteria Gram positiva, catalasa-positiva, aerobio comnmente encontrada en el

suelo. Miembro del Gnero Bacillus, B. subtilis tiene la habilidad para formar una resistente

endospora protectora, permitiendo al organismo tolerar condiciones ambientalmente extremas. B.

subtilis no es considerado patgeno humano; sin embargo puede contaminar los alimentos, pero

raramente causa intoxicacin alimenticia. Sus esporas pueden sobrevivir la calefaccin extrema

que a menudo es usada para cocinar el alimento, y es responsable de causar la fibrosidad en el

pan estropeado (Madigan & Martinko, 2005).

8. Fabricacin de pelculas de quitosano para recubrimiento de alimentos a

partir de quitosano

Se han estudiado diversos tipos de pelculas de quitosano, como lo son:

Pelculas de quitosano con sorbato de potasio

La matriz de quitosano fue unida fsica y covalentemente con sorbato de potasio, el cual

es un efectivo antifngico de uso alimentario; para recubrimiento de langostino y frutillas,

generando buenos resultados de inhibicin microbiolgica en las muestras unidas

covalentemente. La unin covalente del sorbato de potasio al quitosano se realiz mediante a

formacin de una unin amida con el grupo amino del quitosano y el carboxilato el sorbato de

potasio. El mejor comportamiento fue obtenido por los quitosano de peso molecular medio.

(Avila, y otros, 2010).

13
 Pelculas de quitosano con aceites esenciales de comino y clavo

Se evalu el efecto de quitosano a diferentes pesos moleculares, para la elaboracin de

pelculas antimicrobianas, adicionando aceites esenciales y extractos funcionales de comido

(Cuminum cymminum L.) y clavo (Eugenia caryophyllata), como agentes antimicrobianos. La

mayor actividad antimicrobiana fue la de las pelculas de quitosano de bajo peso molecular con

una concentracin de aceite esencial de clavo del 2% y el extracto de clavo E 7 (Hernndez-

Ochoa, Gonzales-Gonzales, Gutirrez-Mendez, Muoz-Castellanos, & Quintero-Ramos, 2011).

Pelculas de quitosano con aceite esencial de canela

Se elaboraron pelculas de quitosano, con adicin de aceite esencial de canela a una

concentracin de 0,4 %, 0,8 %, 1,5% y 2 % (v/v), a las cuales se evaluaron sus propiedades

antimicrobianas, fsicas y mecnicas. El resultado de la investigacin fue que la incorporacin de

aceite de canela aument la actividad antimicrobiana de las pelculas. Las pelculas que

contienen aceite de canela son tiles para el recubrimiento de alimentos altamente perecederos

como el pescado y aves de corral (Ojagh S. , Rezaei, Razavi, & Hosseini, 2010).

Pelculas de quitosano con aceite esencial de romero

Se adicionaron nano partculas de arcilla montmorillonita y aceite esencial de romero

para mejorar las propiedades fsicas y mecnicas de las pelculas de quitosano, y a su vez

mejorar su comportamiento antioxidante y antimicrobiano. Las partculas fueron adicionadas de

1 a 5% en peso, y el aceite esencial en concentraciones de 0,5 %, 1 % y 1,5 % v/v. La

compatibilidad del aceite esencial de romero con el nanocomposite de quitosano con arcilla fue

comprobada en orden para producir una actividad bionanocompuesta para empaques de

alimentos (Abdollahi, Rezaei, & Farzi, 2012).

14
 Pelculas de quitosano con aceite esencial de limn

Se evalu el efecto de la adicin de aceite esencial de limn a concentraciones de 0,5%,

1% y 2% v/v y de diferentes surfactantes (Tween 80 y Span 80) a una concentracin de 0,1%

v/v, sobre las propiedades fsicas, pticas y estructurales de las pelculas de quitosano. La

incorporacin del aceite esencial de limn disminuyo el contenido de humedad, la permeabilidad

a vapor de agua y las propiedades mecnicas. Con respecto a los tipos de surfactante, Tween 80

mejoro la estabilidad del aceite en la pelcula, mientras que Span 80 provoco burbujas de aceite

en la superficie de la pelcula (Peng, Yin, & Li, 2013).

Pelculas de quitosano con aceite esencial de tomillo

Se evalu el efecto de la adicin de aceites esenciales de tomillo: Thymus moroderi (TM)

y Thymus piperella (TP), de las pelculas de quitosano sobre la actividad antibacteriana,

contenido total de fenoles y actividad antioxidante. En relacin a la actividad antibacteriana las

pelculas con aceite TP fueron ms efectivas contra Serratia marcenscens y Listeria innocua en

comparacin con las que contenan aceite TM. Y con respecto a la actividad antioxidante, esta

fue mayor en las pelculas con aceite TM (Ruiz Navajas, Viuda Martos, Sendra, Perez Alvarez,

& Fernandez Lopez, 2013).

Pelculas de quitosano con aceite esencial Boiss y extracto de semilla de uva

Se elaboraron pelculas de quitosano suplementadas con aceite esencial Boiss Zataria

multiflora (BZM) en concentraciones de 5 y 10 g/L y extracto de semilla de uva (ESU) a una

concentracin de 10 g/L; a las cuales se evaluaron sus propiedades fsicas, mecnicas y

antioxidantes. La adicin de BZM y ESU incremento la mojabilidad de la superficie, el

contenido total de fenoles y la actividad antioxidante (Moradi, y otros, 2012).

15
 Pelculas de quitosano contra diferentes bacterias

Se evalu la incorporacin de cido glico a diferentes concentraciones en las pelculas

de quitosano, sobre las propiedades antimicrobianas, fsicas, mecnicas y estructurales. Las

pelculas de quitosano a una concentracin de 1,5g/100 g de cido glico, presentaron la mayor

la actividad antimicrobiana frente a las bacterias Escherichia coli, Salmonella typhimurium,

Listeria innocua y Bacillus subtilis. El esfuerzo a la tensin se benefici con la concentracin de

0, 5g/100 g de cido glico; sin embargo la permeabilidad a vapor de agua y permeabilidad al

oxigeno disminuy a esta concentracin (Sun, Wang, Kadouh, & Zhou, 2014).

16
 METODOLOGA EXPERIMENTAL

1. Materiales

Para la realizacin de la metodologa experimental se utilizaron dos tipos de quitosano:

Quitosano extrado: el cual se obtuvo de los caparazones de camarn titi

de la especie Xiphopenaeus riveti, del Puerto de Buenaventura, Valle del Cauca.

Quitosano comercial: de mediano peso molecular y grado de

desacetilacin de 64,17% (Sigma-Aldrich).

Los aceites esenciales de organo y de romero fueron obtenidos por medio del proceso de

hidrodestilacin. Adicionalmente, se emple el reactivo cido actico marca Sigma Aldrich,

cido ascrbico marca Honeywell; y los reactivos de cido glico, metanol, acetona, glicerina y

Folin Cicaltou, todos de marca Merck.

2. Diseo experimental

La metodologa experimental utilizada para el desarrollo de este proyecto se presenta en

las Figura 7 y 8. Como primer experimento se determin el efecto que ejerce el tiempo de secado

sobre el rendimiento de las plantas de organo y romero; seguido se plante un segundo

experimento con el fin de determinar el efecto que ejerce la adicin de aceite esencial de organo

y romero, a diferentes concentraciones, sobre las propiedades: fsicas, mecnicas, antioxidantes

y antimicrobianas de las pelculas de quitosano comercial.

Descripcin de la unidad experimental

Pelcula de quitosano de mediano peso molecular y un grado de desacetilacin de

64,17%, la adicin de los aceites esenciales se realiz paralelamente a la preparacin de la

17
pelcula por medio de una solucin acuosa (1 % v/v) de cido actico glacial para una

concentracin de 2 % (p/v), con adicin del aceite esencial en concentraciones del 0, 0,4 y 1,5 %

(v/v). Todas las pelculas provienen del mismo lote de quitosano con el fin de garantizar que su

composicin qumica es homognea. En la Figura 6 se puede observar la unidad experimental.

Figura 6. Unidad experimental.

Figura 7. Diagrama de bloques que describe el diseo experimental del primer

experimento.

18
 Figura 8. Diagrama de bloques que describe el diseo experimental del segundo
experimento.

Factores, niveles y tratamientos

En la Tabla 2 se muestran los factores, niveles y tratamientos utilizados en el diseo

experimental del primer experimento. Variables como temperatura, peso de las plantas y tiempo

de hidrodestilacin permanecieron constantes.

19
 Tabla 2. Factores, niveles y tratamientos del primer experimento.

Factores Niveles Tratamientos

Tipo de planta 1. Organo 1-1
2. Romero 1-2
Tiempo de secado (horas) 1. T1: 5 horas 1-3
2. T2: 10 horas 2-1
3. T3: 15 horas 2-2
2-3

En la Tabla 3 se muestran los factores, niveles y tratamientos utilizados en el diseo

experimental del segundo experimento. Variables como temperatura, adicin de plastificante,

adicin de surfactante, velocidad de agitacin y tiempo de secado permanecieron constantes.

Tabla 3. Factores, niveles y tratamientos del segundo experimento.

Factores Niveles Tratamientos

Tipo de aceite 1. Organo 1-1
2. Romero 1-2
Concentracin de aceite (%) 1. C1: 0,0 1-3
2. C2: 0,4 2-1
3. C3: 1,5 2-2
2-3

3. Extraccin y obtencin de quitosano

La extraccin obtencin de quitosano a partir de caparazones de camarn se bas en la

metodologa reportada por Mrmol et al. (2004) y Teli & Sheikh (2012), la cual se describe a

continuacin:

Limpieza

Se tomaron 500 gramos de caparazn de camarn y pasaron por un proceso de lavado con

agua destilada, adicionalmente se agreg en una solucin no jabonosa con base en O 2 y sin cloro

20
(Vanish); previamente se extrajeron manualmente las extremidades del caparazn del camarn

tales como son las patas, antenas, cola y dems residuos de carne existentes.

Secado

Se realiz un proceso de secado a la muestra de 400 gramos de caparazn de camarn, a

una temperatura de 110C durante 4 horas aproximadamente o hasta obtener un peso constante

de la muestra; para extraer el exceso de agua y facilitar el proceso de trituracin.

Trituracin

Para el proceso de trituracin de caparazn de camarn se emple un molino IKA M20;

el proceso consisti en ciclos de 10 segundos de triturado y 5 segundos entre ciclos. La cantidad

de muestra por ciclo fue de 50 gramos, realizando 8 ciclos en total. Posteriormente la muestra

triturada se pas por un tamiz N60 (250 micras de abertura), para garantizar un tamao de grano

fino.

Despigmentacin

Consisti en retirar los pigmentos o la coloracin rosada caracterstica del caparazn

(exoesqueleto) de camarn titi. Para el proceso se emple acetona, y una relacin de 1:6

peso/volumen (p/v), es decir, por cada gramo de materia prima se agregaron 6ml de solucin; se

trabaj a temperatura ambiente durante 2 horas, y seguidamente se filtr el material ms la

solucin con agua caliente por medio de un equipo de filtracin basado en una bomba de vaco.

Finalmente, se sec el material filtrado a una temperatura de 110C durante 4 horas

aproximadamente, o hasta obtener un peso constante del polvo.

21
 Desmineralizacin

A continuacin se realiza el proceso de desmineralizacin, el cual consiste en retirar los

carbonatos de calcio presentes en la muestra a partir de una solucin de HCl 2N. Los parmetros

del proceso fueron: una relacin de 1:5 p/v, es decir, por cada gramo de materia prima se

agregaron 5ml de solucin; se trabaj a temperatura ambiente durante 2 horas, y seguidamente,

se filtr el material ms la solucin con agua caliente por medio de un equipo de filtracin

basado en una bomba de vaco. Finalmente, se sec el material filtrado a una temperatura de

110C durante 4 horas aproximadamente, o hasta obtener un peso constante del polvo.

Para la ejecucin de este proceso se debe tener en cuenta la determinacin de cenizas de

la muestra sin desmineralizar (a) y desmineralizada (b), el ensayo de determinacin de cenizas se

realiz por medio de un secado de las muestras a y b a una temperatura de 800C durante 6

horas; el ensayo de determinacin de cenizas tiene como propsito verificacin del proceso de

desmineralizacin.

Desproteinizacin

Despus se realiz el proceso de desproteinizacin, el cual tiene como objetivo eliminar

las protenas presentes en la muestra a partir de una solucin alcalina de NaOH 2N. Los

parmetros del proceso fueron: una relacin de 1:10 p/v, es decir, por cada gramo de materia

prima se agregaron 10ml de solucin, se trabaj a una temperatura de 90C durante 2 horas, y

seguidamente se filtr el material ms la solucin con agua caliente por medio de un equipo de

filtracin basado en una bomba de vaco. Finalmente, se sec el material filtrado a una

temperatura de 110C durante 4 horas aproximadamente, o hasta obtener un peso constante del

22
polvo. Cabe resaltar que despus del proceso de desproteinizacin se ha obtenido el polisacrido

denominado quitina.

Desacetilacin

En ltimo lugar para la eliminacin de unidades de acetilo presentes en la quitina, se

realiz un proceso de desacetilacin a partir de una solucin de NaOH 50% por medio de un

sistema de reflujo para la disminucin de generacin de gases de reaccin. Los parmetros del

proceso fueron: una relacin de 1:15 p/v, es decir, por cada gramo de materia prima se agregaron

15ml de solucin, se trabaj a una temperatura de 90C durante 3 horas, y seguidamente se

filtr el material ms la solucin con agua caliente por medio de un equipo de filtracin basado

en una bomba de vaco. Posteriormente se sec el material filtrado a una temperatura de 110C

durante 4 horas aproximadamente, o hasta obtener un peso constante del polvo que corresponda

al quitosano.

4. Caracterizacin del quitosano

Titulacin potenciomtrica

Se realiz una titulacin potenciomtrica con el quitosano para determinar su grado de

desacetilacin por medio de un pH-metro Thomson PHS-3BW. El procedimiento consisti en

disolver 0,25 gramos de quitosano en 30 ml de HCl 0,3M durante 2 horas, y posteriormente

adicionar NaOH hasta obtener un pH constante. El grado de desacetilacin fue calculado

mediante la Ecuacin 1.

16,1 (V2 -V1 )

NH2 = f (1)
W

23
 En donde:

NH2 = % grupo amino (grado de desacetilacin).

V2= primer punto de inflexin de la curva (volumen).

1= segundo punto de inflexin de la curva (volumen).

W= peso del quitosano.

f= normalidad de NaOH

Determinacin del peso molecular

El peso molecular promedio fue determinado por viscosimetra capilar utilizando un

viscosmetro tipo Ubbelohde tamao 300, a 25 C. Las disoluciones utilizadas fueron preparadas

con el quitosano comercial al 1% v/v de cido actico considerando una concentracin inicial de

quitosano de 1.0x10-2g/mL a partir de la cual se prepararon disoluciones de 2.0x10-3, 4.0x10-3,

6.0x10-3, y 8.0x10-3g/mL (Cardona & Padilla, 2012). Despus de establecer las condiciones de

trabajo, se procedi a medir el tiempo de cada de cada una de las disoluciones polimricas, con

tres rplicas, para determinar los parmetros viscosimtricos, los cuales fueron calculados

mediante las ecuaciones expresadas en la Tabla 4.

Tabla 4. Parmetros viscosimtricos.

Nombre comn Smbolo y ecuacin que lo define

Viscosidad relativa r = / 0 = t / t0

Viscosidad especfica sp = r 1 = (- 0 )/ 0 (t - t0 )/ t0

Viscosidad reducida red = sp / C

Viscosidad inherente inh = (ln r) / C

Viscosidad intrnseca [] = (sp / C)C=0 = [(ln red) /C]C=0

24
 Basados en la viscosidad intrnseca, se procede a calcular el peso molecular promedio

viscosimtrico, por medio de la Ecuacin 2.

[]=KMav (2)

En donde:

[] = viscosidad intrnseca

K y a = parmetros de MHS

M = peso molecular

Espectroscopia infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR)

Se realiz un ensayo de FTIR para caracterizar el quitosano experimental y el quitosano

comercial, por medio de un espectrofotmetro Nicolet 6700, utilizando pastillas de KBr-

quitosano en el intervalo de nmeros de onda entre 400 y 4000 cm -1. Los datos fueron tratados

mediante el software Omnic.

5. Caracterizacin de las plantas

Clasificacin taxonmica

La clasificacin vegetal se realiz en el laboratorio de biologa de la Universidad de San

Buenaventura, con acompaamiento y asesora del herbario de la Universidad del Valle.

Para poder realizar la clasificacin vegetal se tuvieron en cuenta los siguientes

parmetros:

Tipo, forma y tamao de la hoja. Caracterstica de la nervadura.

Tipo y forma del fruto.

25
 Forma de inflorescencia. Caractersticas.

Presencia o ausencia de peciolo.

Tipo y forma de la flor.

Raz caracterstica.

Una vez identificadas las caractersticas anteriores se buscaron en un libro de claves

taxonmicas las caractersticas de las plantas, logrando identificar que correspondan a

Origanum vulgare L. y Rosmarinus officinalis. Para mayor seguridad especmenes de ambas

plantas se llevaron al herbario de la Universidad del Valle para la confirmacin de los datos.

Determinacin del Contenido de humedad

Se determin el porcentaje de humedad para la planta de organo y romero mediante una

balanza de humedad marca House. Los condiciones del ensayo fueron una temperatura de

100C, una muestra de mnimo 500 gramos y se realizaron tres replicas por planta.

Extraccin del aceite esencial

Se realiz mediante un secado a 45C durante 5, 10 y 15 horas, hasta un porcentaje de

humedad del 5%, para la planta de organo y romero, respectivamente; posteriormente se efecto

un proceso de hidrodestilacin a las hojas de la planta a 100C durante 1 hora y media. El

rendimiento de la planta se determin por medio de la Ecuacin 3.

Volumen aceite (ml)

Rendimiento= Peso hojas secas (gr) *100 (3)

26
 A B C D

Figura 9. Montaje del proceso de hidrodestilacin (A), hidrodestilacin de organo

(B), hidrodestilacin de romero (C) y obtencin de aceite esencial (D).

Anlisis por cromatografa de gases

Los aceites esenciales de Origanum vulgare L. L.y Rosmarinus officinalis fueron

obtenidos por el mtodo de la destilacin con vapor. El anlisis por GC / MS se llev a cabo en

un espectrmetro de cromatografa de gases AT 6890 Serie A plus (Agilent Technologies, Palo

Alto, California, EE.UU.), con un detector selectivo de masas (Agilent Technologies, MSD 5975

inerte XL) (Anlisis completo) utilizando impacto electrnico (EI, 70 eV). El anlisis se llev a

cabo utilizando una columna de slice fundida capilar DB- 5MS (60 m, 0,25 mm; 0.25 m, J &

W Scientific Inc., Folsom, CA, EE.UU.). El programa de temperatura fue de 10 min a 60 C,

luego a 250 C a 5 C / min, se mantuvo durante 10 min. Otras condiciones de funcionamiento

fueron las siguientes: gas portador, helio (99,999 %), con una velocidad de flujo de 1,1 ml / min;

volumen de inyeccin de 2 l y relacin de divisin, 01:30. La identificacin de los principales

componentes del aceite esencial se llev a cabo utilizando impacto la base de datos de Adams

(Wiley, 138 y NIST05).

27
 6. Preparacin de las pelculas de quitosano

La preparacin de pelculas de quitosano se bas en la metodologa planteada por Ojagh

et al. (2010), en la cual inicialmente se disolvi el quitosano (60 90 % desacetilizado) en una

solucin acuosa (1 % v/v) de cido actico glacial para una concentracin de 2 % (p/v) agitando

constantemente a 40C durante 6 horas. Seguido a esto se adiciono glicerol como plastificante en

una relacin de 0,75 mL/g por gramo de quitosano, durante 30 minutos; despus se adiciono el

surfactante en una concentracin del 0,2 % (p/v) respecto al aceite esencial, en concentraciones

del 0, 0,4 y 1,5 % (v/v). A continuacin, la solucin se centrifugo a una velocidad de 9000 rpm

durante 10 minutos. En seguida se prepararon las pelculas en cajas de Petri y se dejaron secando

a temperatura ambiente durante 30 horas. Para finalizar se realiz un segundo secado a 40C

durante 24 horas y las pelculas se almacenaron en un desecador a 25C, con una humedad

relativa de 51%.

7. Caracterizacin pelculas de quitosano

Propiedades fsicas de las pelculas

Espesor

El espesor de las pelculas se determin usando un medidor de espesor de recubrimiento

digital (ELCOMETER A300 FNP 23, ELCOMETER INSTRUMENT LTD., Manchester,

Inglaterra) con una precisin de 0,001 mm. Los valores reportados son un promedio de al menos

cinco lugares al azar de las pelculas de quitosano. Se calcularon y usaron las medias en la

determinacin de las propiedades fsicas.

28
 Contenido de humedad

Se determin el contenido de humedad para cada pelcula de quitosano mediante una

balanza de humedad marca House. Los condiciones del ensayo fueron una temperatura de

100C, una muestra de mnimo 500 gramos y se realizaron tres replicas por espcimen.

Anlisis trmico

Las propiedades trmicas de las pelculas de quitosano suplementadas con aceites

esenciales se midieron por medio de un anlisis termogravimtrico (TGA) utilizando un aparato

de 2920 de TA INSTRUMENTS TGA. Las muestras se calentaron hasta 600 C a una velocidad

de calentamiento de 10 C/min, bajo una atmsfera de nitrgeno seco (tasa de flujo de 80 ml /

min) en un analizador termogravimtrico de TA INSTRUMENTS 2950. Los resultados de TGA

se analizaron utilizando el software de anlisis universal TA INSTRUMENTS.

Propiedades de superficie

El ngulo de contacto esttico de goniometra con agua se llev a cabo utilizando un

instrumento 200 KSV CAM (KSV LTD.) Utilizando el mtodo de la gota de burbujas con agua.

El ngulo de contacto se define como el ngulo entre la superficie de la pelcula y la lnea

tangente en el punto de contacto de la gota de agua con la superficie (SEDICI Repositorio

Institucional de la UNLP, 2014). Para cada tipo de pelcula, se realizaron al menos cinco

mediciones y el promedio fue tomado.

Colorimetra y opacidad

Se realizaron pruebas de colorimetra y opacidad a las pelculas de quitosano con 0%,

0,4% y 1,5% de aceite de romero y organo por medio de un espectrofotmetro KONICA

29
MINOLTA CM 600 d. Las mediciones fueron realizadas depositando las pelculas sobre el

estndar y efectuando 4 repeticiones. Se us la escala de Laboratorio CIE, donde L* fue 0 para

negro y 100 para blanco, los valores de a* indicaron rojo (+) a verde (-), y valores de b*

indicaron amarillo (+) a azul (-). La diferencia total de color () y blancura () fueron

calculadas mediante la Ecuacin 4 y la Ecuacin 5, respectivamente.

2 2 2 0.5
E=[(L*)] + (a* ) +(b* ) ] (4)

2 0.5
WI=100-[(100-L* ) +a*2 +b*2] (5)

La opacidad de la pelcula fue calculada midiendo la absorbancia a 600nm con un

espectrofotmetro por medio de la Ecuacin 6 (Park & Zhao, Incorporation of a high

concentration of mineral or vitamin chitosan films, 2004):

Abs600
O= L (6)

En donde:

O = opacidad de la pelcula

Abs600 = absorbancia a 600nm

L = espesor de la pelcula

Adicionalmente se utiliz la norma ISO 12647-2 de estandarizacin del color para el

anlisis de resultados con respecto a la diferencia total de color (E) la cual se aprecia en la

Tabla 5.

30
 Tabla 5. Estandarizacin de color segn la diferencia total de color (E)

Valores de E Calidad

0y1 Excelente
1y2 Buena
2y3 Normal
3y4 Suficiente
Superiores a 5 Mala

Microscopia electrnica de barrido (SEM)

El anlisis SEM de las pelculas de quitosano se realiz con la ayuda de la microscopa

electrnica de barrido de emisin de campo (FE-SEM) usando un instrumento JEOL JSM 6330f

operando a 5 y 3 kV. Las muestras fueron fotografiadas en ngulos de inclinacin de 60-90 con

respecto al haz de electrones para las vistas en la seccin transversal.

Microscopia de fuerza atmica (AFM)

El ensayo de AFM se llev a cabo en condiciones ambientales por medio de un

PICOSPM II (PICOPLUS, MOLECULAR IMAGING - AGILENT TECHNOLOGIES) con una

velocidad de barrido de 1,0 a 1,5 lneas / s. Los tipos de modo de punteo disponibles en el

mercado (TAP300, SILICON AFM SONDAS, TED PELLA, INC.) fueron utilizados en los

voladizos con una frecuencia de resonancia en el rango de 290 a 410 kHz. Todas las imgenes

topogrficas de AFM (tipo de punteo AAC) fueron procesadas utilizando el software

GWYDDION 2.19.

31
 Contenido total de fenoles (TPC)

Se determin el contenido total de fenoles usando el reactivo Folin-Ciocalteu (Singleton

& Rossi, 1965). El procedimiento consisti en la disolucin de 100 mg de cada pelcula en 3ml

de metanol durante 5 minutos, seguido a esto se tom 0,3 ml de la disolucin y se introdujo en

tubos de ensayo. Luego se adicionaron 2,5 ml del reactivo Folin-Ciocalteu (disuelto 10 veces en

agua) y 2 ml de carbonato de sodio (7,5% p/v). Los tubos fueron mezclados por medio de vrtex

e incubados a 50 C por 5 minutos en una incubadora HERATHERM Incubator. Por ltimo se

midi la absorbancia a 760 nm por medio de un espectrofotmetro (se realizaron tres replicas) y

se compar con una curva de calibracin de cido glico, de un rango de 1ppm a 5ppm.

El contenido fenlico total se calcul como equivalente de cido glico (GAE) por medio

de la Ecuacin 7.

C*V
T= (7)
M

En donde:

T = contenido fenlico total en mg/g de las pelculas como GAE.

C = concentracin de cido glico establecida a partir de la curva de

calibracin en mg/ml.

V = volumen de la solucin de pelcula en ml.

M = peso de la pelcula en g.

32
 Actividad antioxidante

La actividad antioxidante se evalu mediante el mtodo de ensayo de DPPH. La eficacia

de las pelculas para secuestrar los radicales 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) se determin

utilizando el mtodo de espectrofotometra con base en el blanqueo del color rojo azulado o

prpura de la solucin de DPPH como reactivo (Siripatrawan & Harte, 2010). El procedimiento

consisti en disolver 100 mg de cada pelcula en 3 ml de metanol durante 5 minutos,

posteriormente 1,0 ml de esta solucin se agreg en tubos de ensayo. Luego se aadi 1,0 ml del

reactivo de DPPH (disuelto en 20 ml de metanol, al cual se midi la absorbancia a 517 nm y se

ajust a 1 absorbancia). Los tubos se mezclaron mediante vrtex durante 1 minuto y se

almacenaron en un lugar oscuro durante 2 horas. Finalmente se midi la absorbancia a 517 nm

utilizando un espectrofotmetro (se hicieron tres repeticiones) y se compar con una curva de

calibracin de cido ascrbico, de un rango de 20 l a 100 l.

El porcentaje de DPPH actividad secuestrante de radicales libres se calcul por medio de

la Ecuacin 8.

Absblanco -Absmuestra
Captacin de radical libre (%)= *100 (8)
Absblanco

En donde:

Absblanco = absorbancia del blanco.

Absmuestra = absorbancia de la muestra.

Propiedades mecnicas

Se realizaron ensayos a tensin a las pelculas de quitosano experimental, comercial y

suplementadas con aceites esenciales, segn la norma ASTM D882 12 Standard Test Method
33
for Tensile Properties of Thin Plastic Sheeting. Para la determinacin de la resistencia a la

tensin se emple una mquina INSTRON 3366 y una celda con capacidad mxima 10 kN. Las

dimensiones de las muestras fueron: 10mm de longitud y 2,5mm de ancho, segn condiciones

establecidas en la norma referenciada anteriormente.

Actividad antimicrobiana

Cultivos bacterianos

Colonias aisladas individuales de E. coli K-12 MG 1655 y B. subtilis 102 se cultivaron en

15 ml de caldo de soya trptica (TSB) (Oxoid, Inglaterra) durante la noche a 35 C, 80 rpm. El

cultivo bacteriano se centrifug a 4000 rpm durante 10 min. Las clulas se lavaron y se re

suspendieron en solucin de tampn de fosfato (PBS, 0,01 M, pH D 07:04) (Fisher Scientific,

EE.UU.) y la suspensin bacteriana se ajust para dar una densidad ptica (DO) de 0,5 a 600 nm,

que corresponde a una concentracin celular de 107 unidades formadoras de colonias UFC / ml-

1.

Ensayo de viabilidad bacteriana

Se tomaron imgenes de fluorescencia para determinar el nmero de clulas totales y

muertos expuestos a CS y CS - IR. Para este experimento, cubreobjetos circulares de dimetro 12

mm se limpiaron con etanol al 70 %. Los cubreobjetos limpios se recubrieron con CS y CS -GO

pelcula fina por cintas de doble cara. Cada cubreobjetos recubierto se deposit en una placa de

micro titulacin de fondo plano de 12 pocillos (Falon). Las alcuotas de 2 ml de cultivo

bacteriano en 0,5 DO600nm en PBS fueron aadidas en cada pocillo y despus se incubaron

durante 1 h (sin agitacin) a temperatura ambiente. Despus del perodo de incubacin, una

alcuota de la solucin de 10 ml se coloc en un portaobjetos de vidrio, se ti y fotografo con

34
un microscopio de fluorescencia. Para cada pocillo, se hicieron tres repeticiones y seis imgenes

fueron tomadas por cada rplica para dar un total de 18 imgenes por solucin. Para determinar

la cantidad total de clulas vivas y muertas en la suspensin de bacterias de la muestra, la

solucin se ti con un kit Baclight bacteriana viabilidad en vivo / muerto (Invitrogen), tal como

se describe por el fabricante en su boletn tcnico. El kit utiliza dos colorantes cidos nucleicos:

SYTO 9 (verde) y yoduro de propidio (rojo). El kit ti todas las celdas en verde (SYTO9) y las

clulas muertas con las membranas daadas en rojo (yoduro de propidio). Despus de la tincin,

la superficie se coloc en un portaobjetos de microscopio de forma cncava con un cubreobjetos

(25mm 25mm) y se fotografiaron utilizando un microscopio de fluorescencia Olympus BX 51

(Leeds Instrument Inc.) equipado con una cmara digital DP72 bajo un objetivo de 40x y un

isotiocianato de fluorescena (FITC) de filtro. Todas las imgenes fueron obtenidas y analizadas

usando un software de imgenes digitales de dimensin de Celdas Sens (Olympus). El mismo

software se utiliz para contar las clulas para cada una de las 18 imgenes durante cada ensayo.

El porcentaje de clulas inactivas se expres como la relacin de porcentaje del nmero total de

clulas inactivas (rojo) con el nmero total de bacterias (verde) adjunto. Los porcentajes de los

valores medios y desviacin estndar se calcularon segn el recuento de clulas.

35
 DISCUSIN Y ANLISIS DE RESULTADOS

1. Extraccin y obtencin de quitosano

Para el proceso de extraccin y obtencin de quitosano se prosigui la metodologa

experimental reportada por Mrmol et al. (2004) y Teli & Sheikh (2012), la cual consisti

primeramente en una limpieza del caparazn de los camarones por medio de agua destilada,

seguido por un secado del exoesqueleto a una temperatura de 110C durante 4 horas, para

despus realizar un proceso de trituracin el cual buscaba disminuir el tamao de grano a 250

micras, a continuacin se realizaron los procesos qumicos de despigmentacin,

desmineralizacin, desproteinizacin y desacetilacin, que permiten la eliminacin de

pigmentos, minerales, protenas y sustitucin de grupos acetamido por grupos amino,

respectivamente, en el exoesqueleto de camarn para la obtencin de quitosano.

Los resultados obtenidos en el proceso de extraccin y obtencin de quitosano,

permitieron establecer los parmetros reportados en la tabla 6.

Tabla 6. Parmetros para la extraccin de quitosano a partir de exoesqueleto de

camarn.

Proceso Solucin Relacin p/v Temperatura (C) Tiempo (h) Rendimiento (%)

Despigmentacin Acetona 1/6 25 2 93,51

Desmineralizacin HCl 2N 1/5 25 2 40,71

Desproteinizacin NaOH 2N 1/10 90 2 43,35

Desacetilacin NaOH 1/15 90 3 30,16

50%

36
 De acuerdo al rendimiento del proceso de extraccin y obtencin de quitosano, se obtuvo

un resultado del 30,16%, lo cual es menor a lo reportado por Hernndez Cocoletzi et al. (2009)

con un rendimiento del 51,94%, y mayor a lo reportado por Mohammed et al. (2013) con un

rendimiento del 25%; debido a la variabilidad en las condiciones de cada proceso y a la especie

de camarn trabajada.

Adicionalmente, se realizaron pruebas de determinacin de cenizas para las muestras

despigmentada y desmineralizada, con un resultado del 44,802 % (0,21%) y 0,25 % (0,01%)

de cenizas, respectivamente. El porcentaje de cenizas se redujo en un 99,44% con respecto al

material despigmentado, lo cual comprueba que la remocin de los carbonatos de calcio de los

caparazones fue efectiva.

2. Caracterizacin del quitosano

Titulacin potenciomtrica

Para la determinacin del grado de desacetilacin del quitosano extrado (experimental) y

el quitosano comercial se realiz una titulacin potenciomtrica, en la cual se evalu el

porcentaje de grupos amino que haba en cada quitosano. Los resultados se pueden apreciar en la

figura 10.

37
 2,5 EXPERIMENTAL COMERCIAL

pH/V
1,5

0,5

0
0 20 40 60 80 100 120
Volumen (ml)

Figura 10. Titulacin potenciomtrica del quitosano experimental y el quitosano

comercial.

Tabla 7. Datos de la titulacin potenciomtrica del quitosano experimental y el

quitosano comercial.

Quitosano

Experimental 69,34 85,00 96,00 0,25542 0,1

Comercial 64,17 84,00 94,00 0,25088 0,1

El grado de desacetilacin del quitosano experimental es mayor en comparacin al del

quitosano comercial, lo cual se puede apreciar en la tabla 7. Ambos resultados cumplen con el

rango establecido para que el material se considere quitosano, el cual est entre el 60% y el 90%

(Ramirez, Plascencia, Huerta, Vsquez, & Shirai, 2002). Los resultados obtenidos son similares a

los reportados por Hernndez Cocoletzi et al. (2009), Barra et al. (2012) y Beltrn Patio (2010),

con un 64%, 65% y 65,2% de grado de desacetilacin, respectivamente.

38
 Determinacin del peso molecular

La determinacin del peso molecular del quitosano por medio de la viscosimetra capilar,

se bas en la medicin de la viscosidad de las soluciones de quitosano en relacin con el tiempo

de cada de un volumen especfico a travs de un tubo capilar, contra el tiempo del solvente

utilizado. Las medidas viscosimtricas obtenidas para el quitosano comercial y el quitosano

experimental se aprecian en las tablas 8 y 9, respectivamente.

Tabla 8. Medidas viscosimtricas de quitosano comercial al 1% v/v de cido actico

a 25C.

Concentracin (g/mL) Tiempo (s) r sp red (mL/g) inh (mL/g)

0,002 37,32 9,19 8,19 4095,65 1109,13
0,004 92,34 22,74 21,74 5435,76 781,06
0,006 163,96 40,38 39,38 6563,90 616,40
0,008 350,94 86,44 85,44 10679,91 557,43
0,01 603,82 148,72 147,72 14772,29 500,21

Tabla 9. Medidas viscosimtricas de quitosano experimental al 1% v/v de cido

actico a 25C.

Concentracin (g/mL) Tiempo (s) r sp red (mL/g) inh (mL/g)

0,002 39,23 9,66 8,66 4331,28 1134,13
0,004 95,76 23,59 22,59 5646,55 790,17
0,006 168,43 41,49 40,49 6747,54 620,89
0,008 358,34 88,26 87,26 10907,64 560,04
0,01 612,56 150,88 149,88 14987,68 501,65

Adicionalmente la viscosidad intrnseca se obtiene extrapolando la viscosidad reducida a

una concentracin de cero. De esta manera se construye la curva de viscosidad reducida vs

39
concentracin de quitosano en soluciones al 1% v/v de cido actico, donde el intercepto con el

eje Y es la viscosidad intrnseca, como se puede observar en las Figuras 11 y 12, para el

quitosano comercial y el quitosano experimental, respectivamente.

16000
14000
12000
red (mL/g)

10000
8000
6000
4000 y = 1E+06x + 33.02
R = 0.9254
2000
0
0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012
Concentracin (g/mL)

Figura 11. Curva de viscosidad reducida vs concentracin de quitosano comercial en

soluciones al 1% de cido actico.

16000
14000
12000
red (mL/g)

10000
8000
6000
4000 y = 1E+06x + 55.19
R = 0.9234
2000
0
0 0,002 0,004 0,006 0,008 0,01 0,012
Concentracin (g/mL)

Figura 12. Curva de viscosidad reducida vs concentracin de quitosano

experimental en soluciones al 1% de cido actico.

40
 Las regresiones lineales obtenidas se observan en la Ecuacin 9 y 10.

y = 1E+06x + 33,02 (9)

y = 1E+06x + 55,19 (10)

Reemplazando en la Ecuacin 9 y en la Ecuacin 10 el valor de la viscosidad intrnseca y

tomando los valores de 0,00474 mL/g y 0,72 reportados por Kasaai (2007) para las constantes K

y en la Ecuacin 2 de Mark-Houwink-Sakurada, los valores encontrados para el peso

molecular promedio viscosimtrico fueron de 217519,52 g/mol y 443952,17 g/mol, para el

quitosano comercial y el quitosano experimental, respectivamente. Los resultados obtenidos son

similares a los obtenidos por Parada et al. (2004), Cardona & Padilla (2012) y Paz et al. (2013),

con 6,22x105 g/mol para quitosano extrado a partir de exoesqueletos de camarn, 2,08x105

g/mol para quitosano comercial y 3,1x105 g/mol para quitosano derivado de la quitina de

langosta, respectivamente.

Espectroscopia infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR)

La caracterizacin por medio de espectroscopia infrarroja de la quitina experimental

realizada preparando pastillas de este material con KBr, mostro el espectro que se aprecia en la

Figura 13; en donde se observan definidos los picos de absorcin correspondientes a la quitina: a

1661,75cm-1 se atribuyen a vibraciones de estiramiento del grupo C=O (carbonilo) asociados a

grupos amida y estiramientos de las amidas II a 1555,66cm-1, que son grupos importantes en la

composicin de la quitina, tambien se observan vibraciones de los grupos C-H en los

1425,46cm-1, que es muy probable que esten asociados en la estructura de la quitina con grupos

OH que vibran a 1378,2cm-1 o con el grupo acetilo de la misma. Se aprecian tambien tensiones

antisimetricas del enlace C-O-C a 1158,3cm-1 y vibraciones de tension de enlaces C-N de aminas
41
primarias a 1260,54cm-1 y 1026,17cm-1. El anterior resultado concuerda con lo reportado por

Benavente et al. (2011) y Escobar Sierra et al. (2013).

Figura 13. FTIR de quitina experimental.

Adicionalmente en la Figura 14 se puede apreciar el espectro del quitosano experimental,

en donde se observan las bandas de los grupos funcionales caractersticos de la molcula de

quitosano, se hace evidente la aparicin de la banda del grupo amino a 1660 cm-1 debido a la

vibracin de estiramiento del C=O, tpico de amidas. Luego se observa una banda ancha y fuerte

a 3434cm-1 a causa del estiramiento del OH tpico de alcoholes que solapa el estiramiento N-H,

tpico de amidas. Tambin se aprecian las bandas del estiramiento debido a la vibracin de

tensin -C-H alifticos entre 2926cm-1 y 2883cm-1, bandas del grupo Piransico a 1098 cm-1, y

bandas del grupo C-O-C a 1039cm-1. Cabe destacar que las seales correspondientes al C-O-C,

anillo piransico, C-H y O-H, se mantuvieron presentes en el espectro de la quitina y del

quitosano, mientras que las bandas correspondientes al grupo NH de la amina se definieron

mejor despus del proceso de desacetilacin (Nalwa, 1997). Los resultados del espectro del

42
quitosano experimental concuerdan con lo reportado por Hernndez Cocoletzi et al. (2009) y

Escobar Sierra et al. (2013).

Figura 14. FTIR de quitosano experimental.

Finalmente en la Figura 15 se observa el espectro del quitosano comercial; en donde se

aprecian las bandas debidas a los grupos funcionales o subestructuras NH2, OH, CH2OH, O

(Silverstein, Bassler, & Morrill, 1981) caractersticos de este material.

Figura 15. FTIR de quitosano comercial.

43
 3. Caracterizacin de las plantas

Clasificacin taxonmica

Se realiz una clasificacin taxonmica y por parmetros fsicos de las plantas de

organo y romero, en el laboratorio de Biologa de la Universidad de San Buenaventura, con

acompaamiento y asesora del herbario de la Universidad del Valle. Los resultados se aprecian

en las Tablas 10, 11, 12 y 13. (Botanical-online, 2014)

Tabla 10. Clasificacin taxonmica planta 1 (Origanum vulgare L. L.)

Reino Plantae
Divisin Magnoliophyta
Plantas con flores
Clase Magnoliopsida
Dicotiledneas
Orden Lamiales
Familia Labiadas
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Genero Origanum
Especie Origanum vulgare L.

Tabla 11. Clasificacin por parmetros fsicos planta 1 (Origanum vulgare L. L.)

Parmetros Descripcin
Tipo de hoja Opuestas, pecioladas, ovales o enteras; verde claro
Tipo de raz Fibrosa
Tipo de fruto Tetraquenio liso
Tipo de tallo Erectos, pilosos y aromticos; tonalidad rojiza
Tipo de flor Agrupadas en corimbos terminales densos; rosadas, vioceas o blancas

44
 Tabla 12. Clasificacin taxonmica planta 2 (Rosmarinus officinalis.)

Reino Plantae
Divisin Magnoliophyta
Clase Magnoliopsida
Orden Lamiales
Familia Lamiaceae
Subfamilia Nepetoideae
Tribu Mentheae
Genero Rosmarinus
Especie Rosmarinus officinalis

Tabla 13. Clasificacin por parmetros fsicos planta 2 (Rosmarinus officinalis.)

Parmetros Descripcin
Tipo de hoja Forma linear, firmes, verde oscuras por el haz y blanquecinas por el envs
Tipo de raz Fibrosa
Tipo de fruto Seco con semillas menudas
Tipo de tallo Tallos jvenes borrosos y tallos aosos de color rojizo y con la corteza
resquebrajada
Tipo de flor Axilares, color azul o violceo plidos con los estambres ms largos que los
ptalos y el labio superior de la corola curvado

Segn la clasificacin taxonmica realizada, se logr identificar y clasificar las plantas

seleccionadas para realizar el proyecto as:

- Organo: Origanum vulgare L. l.

- Romero: Rosmarinus officinalis.

Contenido de humedad de las plantas

De acuerdo con la medicin del porcentaje de humedad de las plantas de rgano y romero

se obtuvo un 9,810 % (0,16%) y 9,990 % (0,43%), respectivamente. Segn los resultados

obtenidos la planta de romero posee un mayor porcentaje de humedad en comparacin con la

45
planta de organo. Beln-Camacho et al. (2011) encontraron un contenido de humedad para el

organo del 8,45% (0,16%) y para el romero se reporta un contenido de humedad del 9%

(Herbotecnia, 2014), los cuales son muy similares a los valores determinados en esta

investigacin.

Extraccin del aceite esencial

Para la extraccin de aceite esencial se realiz un diseo factorial 2x3, en el cual las

variables fueron: tipo de planta (romero y organo) y el tiempo de secado (5, 10 y 15 horas).

3,50
3,00
Rendimiento (ml/g)

2,50
2,00
1,50
1,00
0,50
0,00
5 10 15
Oregano 1,10 0,83 0,68
Romero 1,25 2,49 2,91
Tiempo de Secado (h)

Figura 16. Extraccin de aceite esencial de romero y organo a diferentes tiempos de

secado (5, 10 y 15 horas).

Segn la Figura 16 se puede observar que con respecto a la planta de romero, al

incrementar el tiempo de secado incrementa el rendimiento; sin embargo teniendo en cuenta que

la cantidad media de aceite esencial que se encuentra en la mayora de las plantas aromticas es

46
alrededor de 1 a 2% (Servicio Nacional de Aprendizaje SENA , 2012); el tiempo de secado de 5

horas con 1,25 ml/g es adecuado para el experimento.

En caso contrario para la planta de organo, en donde el incremento del tiempo de secado

disminuye el rendimiento; permitiendo obtener un mejor resultado al emplear menor tiempo de

secado, como se aprecia al utilizar un tiempo de 5 horas de secado con un resultado de 1,10 ml/g.

Anlisis estadstico

Adicionalmente se realiz un anlisis estadstico de los resultados por medio de un

anlisis de varianza (ANOVA), un pos-ANOVA utilizando el mtodo Tukey y un grfico de

interaccin. El anlisis estadstico se realiz mediante el software de MiniTab 16.

Tabla 14. ANOVA de dos factores: rendimiento (ml/g) vs. Tipo de planta*tiempo de

secado.

Fuente GL SC CM F P

Tipo de planta 1 7,1288 7,12884 196,77 0

Tiempo de secado 2 0,7597 0,37985 10,48 0,002

Interaccin 2 4,4787 2,23934 61,81 0

Error 12 0,4347 0,03623

Total 17 12,802

S = 0,1903

R-cuadrado = 96,60%

R-cuadrado (ajustado) = 95,19%

47
 Se ejerci un buen control de los niveles de los factores debido a que las sumas de

cuadrados de tipo de planta, tiempo de secado e interaccin son mayores que el error.

Con respecto a la prueba de hiptesis de interaccin o dependencia entre los dos factores

la cual se aprecia en la Tabla 14, se hayo que a un nivel de significancia de 0,000 hay

dependencia entre el tipo de planta y el tiempo de secado por lo tanto para realizar las

comparaciones se fij el tipo de planta y se compararon los tiempos de secado,

Se plantea la prueba post ANOVA asumiendo igualdad de medias vs diferencia entre las

medias, la cual se puede apreciar en la Tabla 15.

Tabla 15. Mtodo de Tukey con una confianza de 95,00%.

Tipo de planta Tiempo de secado (horas) N Media Agrupacin

2 15 3 2,9 A
2 10 3 2,5 A
1 5 3 1,4 B
2 5 3 1,3 B C
1 10 3 0,8 C D
1 15 3 0,7 D

Se debe tener en cuenta que:

Las medias que no comparten una letra son significativamente diferentes.

El tipo de planta numero 1 representa a la planta de organo.

El tipo de planta numero 2 representa a la planta de romero.

Se observa que la planta 2 a 15 horas presenta el mejor rendimiento, y que la misma

planta a 10 horas es estadsticamente igual que a 15 horas, a un nivel de significancia del 5%.

48
 Se observa que la planta 2 a 5 horas es estadsticamente igual a la planta 1 a 5 y 10 horas,

a un nivel de significancia del 5%.

Se observa que la planta 1 a 10 horas es estadsticamente igual que a 15 horas, a un nivel

de significancia del 5%.

Figura 17. Interaccin del tipo de planta segn el rendimiento (ml/g).

Segn la Figura 17 se puede observar que el comportamiento de la planta 1 en

comparacin con la planta 2, con respecto al rendimiento (ml/g) es inversamente proporcional; es

decir que para la planta 1 el incremento del tiempo de secado disminuye su rendimiento, y en

contraste para la planta 2 el incremento del tiempo de secado aumenta su rendimiento.

Anlisis por cromatografa de gases

Los datos analticos de GM (MS) de los compuestos principales del aceite esencial de

organo (AEO) se muestran en la Tabla 16. El compuesto de Alcanfor fue un compuesto

49
predominante y represento el 23,9% del rea total del pico. Los otros componentes fueron 1,8-

cineol (22,7%), -Pineno (20,5%) y Canfeno (10,4%). Olmedo et al. (2013) encontro resultados

diferentes en donde los componentes mayoritarios del oregano fueron -terpineol (55.5 g/100 g),

terpinen-4-ol (15.9 g/100 g) y el timol (12.9 g/100 g), debido a que se observan dos quimiotipos

diferentes.

Tabla 16. Composicin qumica de AEO (Origanum vulgare L.).

N Compuesto RI % del rea total del pico

1 Alcanfor 27.07 23.9

2 1,8-cineol 22,18 22.7
3 -Pineno 17.76 20.5
4 Canfeno 18.52 10.4
5 -pineno 19.74 4.6
6 Limoneno 22.00 3.9
7 Borneol 27.92 2.5
8 p-Cimeno 21.75 2.1
9 Acetato de bornilo 31.95 1.8
10 Isoborneol 27.59 1.6
11 -Terpineol 28.69 1.1
12 Trans--cariofileno 37.32 1.0
13 -Fencheno 18.40 0.8
14 -Mirceno 20.05 0.6
15 Linalool 24.77 0.6

De la misma forma los datos analticos de GM (MS) de los compuestos principales del

aceite esencial de romero (AER) se muestran en la Tabla 17. El compuesto de -Mirceno fue un

compuesto predominante y represento el 27,8% del rea total del pico. Los otros componentes

fueron Alcanfor (23,9%), 1,8-cineol (16,2%) y Canfeno (5,5%). Los resultados obtenidos
50
coinciden con los resultados reportados por Tafurt et al. (2005) en donde los compuestos

mayoritarios fueron: alcanfor (28,7%), eucaliptol (15,9%), -pineno (10,4%), canfeno (7,6%) y

-pineno (5,1%).

Tabla 17. Composicin qumica de AER (Rosmarinus officinalis).

N Compuesto RI % del rea total del pico

1 -Mirceno 20,04 27.8

2 Alcanfor 26,92 23.9
3 1,8-cineol 22,02 16.2
4 Canfeno 18,40 5.5
5 -Pineno 17,61 4.6
6 -Pineno 19,64 4.5
7 Acetato de bornilo 31,87 3.4
8 trans--cariofileno 37,27 2.2
9 Limoneno 21,84 2.1
10 p-Cimeno 21,62 1.5
11 -Terpineol 28,59 1.1
12 -Tujeno 17,23 1.0
13 xido de cariofileno 42,46 0.9
14 Borneol 27,79 0.8
15 Terpinen-4-ol 28,06 0.7
16 -Humuleno 38,49 0.7
17 Linalool 24,65 0.6
18 -Terpineno 23,02 0.3
19 cis-Hidrato de sabineno 24,86 0.2
20 Terpinoleno 24,18 0.2

51
 4. Preparacin de la pelcula de quitosano

Se prepararon pelculas de quitosano comercial suplementadas con aceites esenciales de

organo y romero al 0,4 y 1,5%, y pelculas de quitosano experimental sin aceite; de acuerdo a la

metodologa planteada por Ojagh et al. (2010). Las pelculas obtenidas se pueden apreciar en la

Figura 18, en donde se observa que aquellas que contienen aceites poseen una tonalidad amarilla,

en comparacin a las pelculas sin aceite. Hernndez-Ochoa et al. (2011) tuvieron resultados

similares al adicionar aceites esenciales a peliculas de quitosano de mediano peso molecular, con

una coloracin amarrillo/mbar y Peng et al. (2013) obtuvieron pelculas de quitosano con un

aspecto ligeramente amarillo.

Figura 18. Pelcula de quitosano experimental PQE (A), pelcula de quitosano

comercial PQC (B), PQC con 0,4% organo (C), PQC con 1,5% organo (D), PQC con

0,4% romero (E) y PQC con 1,5% romero (F).

52
 5. Caracterizacin pelculas de quitosano

Propiedades fsicas de las pelculas

Espesor

Los resultados de las mediciones del espesor de las pelculas se pueden apreciar en la

Figura 19.

0,140
0,120
0,100
Espesor (mm)

0,080
0,060
0,040
0,020
0,000
Experimental Comercial 0,4 Oregano 1,5 Oregano 0,4 Romero 1,5 Romero
Espesor 0,067 0,086 0,105 0,121 0,105 0,133
Pelicula

Figura 19. Espesor de las pelculas.

En cuanto al espesor de las pelculas, el quitosano experimental (extrado) presenta

valores menores en comparacin con la pelcula de quitosano comercial en un 28,36%. Por lo

que se refiere a las pelculas de quitosano comercial suplementadas con aceites esenciales de

organo y romero se observ que en ambos casos el espesor aumenta a medida que incrementa la

concentracin de los aceites; este comportamiento se observ en las investigaciones de Ojagh et

53
al. (2010) y Alfonso Arce (2011) al adicionar aceite esencial de canela y romero,

respectivamente.

Cabe destacar que las pelculas con 0,4% de aceite esencial presentaron el mismo espesor

de 0,105mm; sin embargo a una concentracin de 1,5% la pelcula con aceite esencial de romero

presenta un mayor espesor en comparacin con la pelcula con aceite esencial de organo; la

primera con un porcentaje de incremento del 15,24% y la segunda con 26,67%. As pues el

aceite esencial de organo al 1,5% ofrece el menor espesor a esta concentracin.

Contenido de humedad

De acuerdo con la medicin del porcentaje de humedad de las pelculas de quitosano

suplementadas con aceites esenciales se obtuvieron los resultados reportados en la Figura 20.

30

25

20
% Humedad

15

10

0
Patron Patron
PQC-0,4R PQC-1,5R PQC-0,4O PQC-1,5O
experimental comercial
% HUMEDAD 27,94 21,4 17,7 20,43 22,09 21,31
Pelicula

Figura 20. Porcentaje de humedad de las pelculas.

Con respecto a las pelculas suplementadas con aceite esencial de romero el incremento

de la concentracin de aceite aumenta el porcentaje de humedad de la pelcula, debido a que la

54
planta de romero tena mayor contenido de humedad en comparacin a la planta de organo,

como se report anteriormente. En contraste en las pelculas suplementadas con aceite esencial

de organo el incremento de la concentracin de aceite disminuye el porcentaje de humedad de

la pelcula. Cabe destacar que la incorporacin de aceites esenciales a las pelculas de quitosano

disminuy su contenido de humedad, lo cual concuerda con lo reportado por Ojagh et al. (2010),

Peng et al. (2013) y Alfonso Arce (2011) al adiconar aceite esencial de canela, de limon y de

romero, respectivamente.

Anlisis trmico

Se realiz un anlisis termogravimtrico (TGA) de la prdida de peso de las pelculas de

quitosano comercial suplementadas con aceites esenciales de organo y romero, el cual se puede

observar en las Figuras 21 y 22. De acuerdo a la temperatura se pueden identificar diferentes

transiciones en el termograma, estando cada uno de ellos asociado a diferentes prdidas de masa

y humedad; los datos de estas transiciones para todas las pelculas de quitosano se pueden

observar en la Tabla 18. El primer evento trmico ocurre entre los 48,6C y 54,09C el cual se

atribuye a la perdida de humedad y de los componentes ms voltiles de los aceites esenciales. El

segundo evento ocurre entre los 152,48C y los 165,79C en donde el quitosano empieza a

descomponerse a travs de sus enlaces termolbiles C-O.

El ltimo evento ocurre entre los 248,39C y los 255,94C el cual se atribuye a la

formacin de carbn de quitosano o a reacciones de despolimerizacin de las cadenas de

quitosano. A partir de este rango de temperatura las pelculas comienzan a degradarse, debido a

que alcanzan su temperatura de degradacin trmica (Don, King, Chiu, & Peng, 2005). Los

resultados obtenidos son similares a los reportados por Lin & Pascall (2014).

55
 100

90

80

70
Peso (%) 60 Control
50 Oregano 0,4

40 Oregano 1,5
Romero 0,4
30
Romero 1,5
20

10

0
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
Temperatura (C)

Figura 21. Anlisis termogravimtrico de las pelculas de quitosano comercial

suplementadas con aceites esenciales.

Figura 22. DTGA de las pelculas de quitosano comercial suplementadas con aceites

esenciales.

56
 Tabla 18. Datos del anlisis termo gravimtrico de las pelculas de quitosano

comercial suplementadas con aceites esenciales.

Pelcula Temperatura (C) Peso (%)

Control 54,09 7,79
164,18 47,27
251,68 72,32
Organo 0,4 50,53 8,58
152,48 41,08
251,42 68,69
Organo 1,5 50,95 7,92
157,27 42,28
248,39 67,29
Romero 0,4 50,88 9,78
165,79 53,97
252,02 78,04
Romero 1,5 48,60 7,57
153,78 40,21
255,94 67,85
349,44 78,14

Propiedades de superficie

Se midi el ngulo de contacto de las pelculas de quitosano suplementadas con aceites

esenciales. Como se puede observar en la Tabla 19, el ngulo de contacto increment al

incorporar los aceites esenciales a las pelculas de quitosano. Ojagh et al. (2010) reportaron

resultados similares al adicionar aceite de canela.

57
 Tabla 19. ngulos de contacto de las pelculas de quitosano.

Pelcula de quitosano Angulo de contacto con el agua

Control 43.03 1,70

Organo 0,4% 72.53 1,23

Organo 1,5% 77,37 2,00

Romero 0,4% 68,37 1,12

Romero 1,5% 82,46 1,73

Colorimetra y opacidad

Las caractersticas de las pelculas con respecto al color y opacidad se muestran en la

Tabla 20. El parmetro b*, y opacidad de la pelcula de control fueron 14.67, 11.95 y 4.75,

respectivamente. La adicin de aceite esencial de romero y de organo increment los

parmetros de b*, E y opacidad de las pelculas de quitosano, mientras que los parmetros de

L* y WI disminuyeron. Resultados similares fueron reportados por Peng et al. (2013) y Ojagh et

al. (2010).

Con respecto a la norma ISO 12647-2, se obtuvo una diferencia total de color de calidad

buena y calidad suficiente, para las pelculas de romero y organo, respectivamente. Lo anterior

supone que las pelculas son aptas en apariencia segn los estndares de la norma.

58
 Tabla 20. Colorimetra y opacidad de las pelculas de quitosano.

Pelcula L a b Delta E WI O

Blanco 89,150,06 -0,100,01 3,240,02 x x x

Experimental 88,120,02 -0,530,01 6,780,09 11,980,02 86,270,04 4,860,06

Patrn 85,920,85 -1,130,29 14,672,67 11,952,77 79,542,50 4,720,04

0,4R 86,670,28 -1,230,02 13,370,31 10,000,38 81,810,42 8,760,8

1,5R 86,280,57 -1,090,00 14,251,47 11,831,56 80,851,41 11,901,02

0,4O 84,500,29 -1,160,22 17,750,04 14,860,03 76,400,15 13,230,43

1,5O 80,385,08 0,462,36 18,900,76 17,861,76 72,563,15 16,540,23

Microscopia electrnica de barrido

Se realiz un anlisis morfolgico a las pelculas de quitosano suplementadas con aceites

esenciales de organo y romero el cual se puede apreciar en la Figura 23 y Figura 25; y las

secciones transversales de las pelculas se aprecian en la Figura 24 y Figura 26.

Con respecto a la pelcula de control y con aceite de organo se observ un aspecto liso y

aparentemente uniforme, exceptuando unas pequeas partculas que se evidencian en la Figura

23, estas partculas se atribuyen al surfactante por falta de homogeneidad de la mezcla.

59
 Figura 23. Imgenes de microscopa electrnica de barrido de la pelcula (A)

control de quitosano, (B) con 0,4% de aceite esencial de organo y (C) con 1,5% de aceite

esencial de organo.

Figura 24. Imgenes de microscopa electrnica de barrido de la seccin transversal

de la pelcula (A) control de quitosano, (B) con 0,4% de aceite esencial de organo y (C)

con 1,5% de aceite esencial de organo.

Por lo que se refiere a la morfologa de las pelculas de quitosano comercial

suplementadas con aceite esencial de romero, se observ que no hubo una buena dispersin del

aceite en la pelcula, lo cual se evidencia en la Figura 25 en donde se distinguen dos fases.

60
 Figura 25. Imgenes de microscopa electrnica de barrido de la superficie de las

pelculas (A) con 0,4% de aceite esencial de romero y (B) con 1,5% de aceite esencial de

romero.

Figura 26. Imgenes de microscopa electrnica de barrido de la seccin transversal

de las pelculas (A) con 0,4% de aceite esencial de romero y (B) con 1,5% de aceite esencial

de romero.

Microscopia de fuerza atmica

La morfologa superficial de las pelculas de quitosano comercial suplementadas con

aceites esenciales, se estudi por medio de la microscopa de fuerza atmica, AFM, en el modo

tapping de imagen. Como se puede observar la Figura 26 en las pelculas con aceite esencial

de organo la rugosidad disminuyo conforme se aument la concentracin de aceite. En el caso

61
contrario para las pelculas con aceite esencial de romero las cuales se pueden apreciar en la

Figura 27, en donde la rugosidad aumento conforme se increment la concentracin de aceite.

Cabe destacar que las pelculas suplementadas con aceite de romero presentan menor rugosidad

en comparacin con las pelculas suplementadas con aceite de organo, debido posiblemente a la

composicin qumica de cada aceite esencial. Los resultados obtenidos de la rugosidad de las

pelculas se aprecian en la Tabla 21. Nosal et al. (2005) reportaron una rugosidad menor de

0.33nm para las peliculas de quitosano y de 0.9nm para las peliculas modificadas;

adicionalmente en otra investigacin realizada por Nosal et al. (2005) se reporto una menor

rugosidad de 0.33nm para las peliculas de quitosano y 3.1nm para las peliculas modificadas con

1,2 Epoxy-3-phenoxy-propane.

Tabla 21 Rugosidad de las pelculas de quitosano comercial suplementadas con

aceites esenciales

Pelcula de quitosano comercial Rugosidad (nm)

Aceite esencial de organo 0,4% 15,097

Aceite esencial de organo 1,5% 6,470

Aceite esencial de romero 0,4% 1,250

Aceite esencial de romero 1,5% 8,885

62
 Figura 27. AFM pelcula de quitosano con aceite esencial de organo al 0,4% (a) y

AFM pelcula de quitosano con aceite esencial de organo al 1,5% (b).

Figura 28. AFM pelcula de quitosano con aceite esencial de romero al 0,4% (a) y

AFM pelcula de quitosano con aceite esencial de romero al 1,5% (b)

63
 Contenido total de fenoles

Se determin el contenido total de fenoles de las pelculas de quitosano, y los resultados

se compararon una curva de calibracin de cido glico, la cual se observa en la Figura 29.

0,04
y = 0,0069x - 0,0012
0,035 R = 0,9845
0,03
Absorbancia (nm)

0,025
0,02
0,015
0,01
0,005
0
0 1 2 3 4 5 6
Concentracin (mg/mL)
.

Figura 29. Curva de calibracin del cido glico equivalente.

0,12

0,09
mg AGE/g pelicula

0,06

0,03

0,00
PQ PQ-0,4R PQ-1,5R PQ-0,4O PQ-1,5O
TPC 0,0066 0,0162 0,0523 0,0421 0,1098
Pelicula

Figura 30. Contenido total de fenoles para las pelculas de quitosano suplementadas

con aceites esenciales de organo y romero.

64
 Como se puede apreciar en la Figura 30, las pelculas de quitosano incorporadas con

aceites esenciales tuvieron mayor contenido de fenoles en comparacin con la pelcula control.

Resultados similares fueron obtenidos por Moradi et al. (2012) y Ruiz Navajas et al. (2013) al

incorporar aceites esenciales de Zatari multiflora y Thymus moroderi, respectivamente. Este

resultado puede ser atribuido a la formacin de cromgenos, debido a la reaccin del reactivo

Folin y Ciocalteu con la reduccin de sustancias no fenlicas las cuales pueden ser detectadas

espectrofotometricamente.

Actividad antioxidante (DPPH)

Se determin la actividad antioxidante por medio del reactivo DPPH, midiendo el

porcentaje de inhibicin. Los resultados obtenidos se observan en la Figura 31, como se aprecia

el porcentaje de inhibicin aumenta con la incorporacin de los aceites esenciales, sin embargo

al aumentar la concentracin de los aceites esenciales disminuye el porcentaje de inhibicin,

siendo el resultado de la concentracin al 0,4% mayor que el de 1,5%, pero con ambos pelculas

se obtiene un porcentaje de inhibicin mayor al de la pelcula control. Ruiz Navajas et al. (2013)

y Moradi et al. (2012) reportaron resultados similares al incorporar aceites esenciales de Thymus

moroderi y Zatari multiflora, respectivamente. El anterior comportamiento se atribuye a que los

aceites esenciales presentan gran cantidad de fenoles, los cuales benefician a la captacin de

radicales libres. Con respecto al desempeo de los aceites esenciales, el aceite de romero tuvo

mayor porcentaje de inhibicin en comparacin con el aceite de organo.

65
 20

Captacin de radical libre (%)

16

12

0
PQP 0,4O 1,5O 0,4R 1,5R
% INHIBICION 7,18 10,08 9,27 16,47 12,79
Pelicula

Figura 31. Captacin de radical libre de las pelculas.

Propiedades mecnicas

Se realizaron ensayos a traccin para las pelculas de quitosano experimental, quitosano

comercial y suplementadas con aceite de organo y romero. Los resultados de las propiedades

mecnicas se observan en la Tabla 22.

Tabla 22. Propiedades mecnicas de las pelculas de quitosano

Pelculas Esfuerzo de Porcentaje de
traccin Deformacin
(MPa)* a la ruptura*
Experimental 29,00 1,43a 10,15 0,41c
Comercial 23,28 1,84b 9,16 0,52d
0.4 Organo 8,53 3,70c 8,30 0,48e
1.5 Organo 0,79 0,29d 7,96 0,06f
0.4 Romero 0,78 1,02e 10,83 0,28a
1.5 Romero 0,61 0,05f 10,74 0,32b
*Los resultados en cada columna con diferente letras de superndice son significativamente diferentes (p < 0,005).

Con respecto a la pelcula de quitosano experimental se observ que se necesit un mayor

esfuerzo para romper y deformar la pelcula, con 29,00 1,43 MPa y 10,15 0,41 %,

66
respectivamente, en comparacin a la pelcula de quitosano comercial. Cabe destacar que los

resultados son similares, lo cual supone que una futura implementacin de los aceites esenciales

en las pelculas de quitosano experimental tendra un comportamiento similar a las pelculas de

quitosano comercial suplementadas con aceites esenciales.

En relacin al comportamiento de las pelculas suplementadas con aceites esenciales, se observa

que al adicionar aceite esencial de organo el esfuerzo a traccin y la deformacin a la ruptura

disminuyeron. Peng et al. (2013) encontraron comportamientos similares al analizar las

propiedades mecanicas de peliculas de quitosano suplementadas con aceite esencial de limon.

En contraste al comportamiento de las pelculas con aceite esencial de romero, en las

cuales el esfuerzo a traccin disminuy y la deformacin a la ruptura aument. Abdollahi et al.

(2012) tambien trabajaron con aceite esencial de romero, y tuvieron comportamientos similares

al adicionar este tipo de aceite en peliculas de quitosano.

Actividad antimicrobiana

Se determin el porcentaje de inhibicin de las pelculas de quitosano suplementadas con

aceites esenciales de romero y organo, frente a los patgenos de E. coli y B. subtilis, los

resultados obtenidos se observan en la Tabla 23 y en la Figura 32. Adicionalmente en la Figura

33 y 34 se evidencian las imgenes de fluorescencia, en donde se observan las celdas en verde

(SYTO9) y las clulas muertas con las membranas daadas en rojo (yoduro de propidio).

67
 Tabla 23. Porcentaje de inhibicin de pelculas de quitosano suplementadas con

aceites esenciales.

Pelcula de quitosano Porcentaje de inhibicin Porcentaje de inhibicin

de E. coli de B. subtilis

Control 3,77 2,01 12,46 4,75

Organo 0,4% 4,70 1,06 15,93 6,25

Organo 1,5% 6,94 2,18 23,75 5,22

Romero 0,4% 6,32 1,04 35,69 7,55

Romero 1,5% 11,96 4,17 36,29 9,8

50
Porcentaje de inhibicin (%)

45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
Control Organo 0,4% Organo 1,5% Romero 0,4% Romero 1,5%
Ttulo del eje

E. Coli B. Subtilis

Figura 32. Porcentaje de inhibicin de las pelculas de quitosano frente a E. coli y B.

Subtillis.

68
 Figura 33. Porcentaje Inactivacin de E. coli de las pelculas de quitosano

suplementadas con aceites esenciales.

Figura 34. Porcentaje Inactivacin de B. subtilis de las pelculas de quitosano

suplementadas con aceites esenciales.

69
 Como se observa en la Tabla 23 y en la Figura 32, 33 y 34, las pelculas con aceites

esenciales de organo y romero superaron el porcentaje de inhibicin de la pelcula control frente

a E. coli y B. subtilis. Para el caso de E. coli el porcentaje de inhibicin de la pelcula control fue

de 3.77%, y las pelculas con aceite esencial de organo al 1.5% y romero al 1.5% tuvieron un

6.94% y 11.96% de inhibicin, respectivamente. As mismo, en el caso de B. subtilis el

porcentaje de inhibicin de la pelcula control fue de 12,46%, y las pelculas con aceite esencial

de organo al 1.5% y romero al 1.5% tuvieron un 23,75% y 36,29% de inhibicin,

respectivamente.

Con respecto al comportamiento de ambos aceites esenciales en la inhibicin de E. coli y

B. subtilis, el aceite esencial de romero presento mejor inhibicin en comparacin al aceite

esencial de organo para ambas bacterias. Se observ que la relacin entre la concentracin de

los aceites esenciales y el porcentaje de inhibicin es directamente proporcional, es decir, que el

incremento de la concentracin en ambos aceites esenciales beneficia a la inhibicin del

crecimiento de la bacteria. En general la respuesta de todas las pelculas hacia la inhibicin de las

bacterias fue mayor frente a la bacteria B. subtilis, en comparacin con la bacteria E. coli.

Adicionalmente, se ha reportado actividad antimicrobiana en pelculas de quitosano por

Youn et al. (2000) frente a B. subtilis en el alimento de salchica y Rao et al. (2005) frente a E.

coli y B. subtilis en alimentos de filete de bacalao y salchicha.

70
 CONCLUSIONES

Se logr extraer quitosano a partir del camarn titi de la especie Xiphopenaeus riveti,

como se pudo evidenciar en las pruebas de caracterizacin del mismo, en donde se obtuvo un

grado de desacetilacin del 69,34% y un peso molecular del 443952,17 g/mol, adicionalmente la

espectroscopia IR permiti identificar los grupos correspondientes al quitosano.

Con respecto a las pelculas de quitosano, las propiedades fsicas tales como apariencia y

rugosidad se vieron beneficiadas con la adicin de aceites esenciales. Cabe destacar que estas

propiedades influyen en la calidad superficial del recubrimiento, siendo los resultados obtenidos

favorables para la aplicacin.

Las propiedades antioxidantes y antimicrobianas incrementaron con la adicin de aceites

esenciales; la capacidad antioxidante el aceite esencial de organo present la mayor capacidad

antioxidante en comparacin al aceite de romero. En relacin con la actividad antimicrobiana se

observ mayor porcentaje de inhibicin de las pelculas contra el patgeno B. subtilis, en donde

el romero brind la mayor inhibicin. Se evidenci que los aceites esenciales cumplieron su

papel de agentes antioxidantes y antimicrobianos, lo cual supone un beneficio en la preservacin

de alimentos.

Sin embargo, las propiedades mecnicas de las pelculas se vieron afectadas

negativamente con la incorporacin de los aceites esenciales, siendo el aceite de organo el que

present mayor resistencia a la tensin en comparacin con el aceite de romero. As pues las

propiedades mecnicas de las pelculas suplementadas con aceites esenciales no contribuyen a la

aplicacin como recubrimiento.

71
 BIBLIOGRAFA

Abdollahi, M., Rezaei, M., & Farzi, G. (2012). A novel active bionanocomposite lm

incorporating rosemary essential oil. Journal of Food Engineering, 343350.

Alfonso Arce, C. (2011). Caracterizacin de peliculas comestibles de quitosano y la afectacin

de las propiedades por aplicacin de aceites esenciales. Bogota, Cundinamarca,

Colombia: Universidad Nacional de Colombia.

Asociacin MERCOSUR de normalizacin. (30 de Octubre de 2008). NM ISO 12647-2:2008 .

Tecnologa grafica - Control de procesos para la separacin de colores en medio tono,

pruebas y produccin de impresin. Uruguay.

Avila, A., Costamanga, V., Barrientos, A., Pucci, G., Snchez, E., & Strumia, M. C. (2010).

Pelculas de quitosano con sorbato de potasio unido fsica y covalentemente. Revista

Iberoamericana de Polmeros, 73-87.

Barra, A., Romero, A., & Beltramino, J. (2012). Obtenido de Sitio Argentino de Produccin

Animal: http://www.produccion-animal.com.ar/produccion_peces/piscicultura/173-

Quitosano.pdf

Beln-Camacho, D., Lpez, I., Sojo, C., Linares, O., Medina-Martnez, C., Garca-Pantalen, D.,

& Moreno-lvarez, M. (2011). Efecto de extractos de organo (Origanum vulgare L.) ante

la oxidancin en aceite vegetal comestible. Rev. Fac. Agron., 628-635.

72
Beltrn Patio, J. (2010). Extraccin y caracterizacin del camaron titi y su aplicacin en la

liberacin controlada de un farmaco. Extraccin y caracterizacin del camaron titi y su

aplicacin en la liberacin controlada de un farmaco. Cali, Valle del Cauca, Colombia.

Benavente, M., Arias, S., Moreno, L., & Martnez, J. (29 de Septiembre de 2011). Produccin de

Clorhidrato de Glucosamina a partir de Desechos de Crustceos. Managua, Managua,

Nicaragua.

Botanical-online. (12 de 03 de 2014). Botanical-online. Obtenido de http://www.botanical-

online.com/medicinalsoreganocastella.htm

Burt, S. (2004). Essential Oils: their antibacterial properties and potential aplications in food. A

review. International journal of food microbiology, 223-253.

Cardona, V., & Padilla, B. (2012). Preparacin y caracterizacin fisicoqumica y estructural de

un gel conductor a base de quitosano. Preparacin y caracterizacin fisicoqumica y

estructural de un gel conductor a base de quitosano. Cali: Escuela de Ingenieria

Quimica.

Castaeda Ramrez, C., M. de la Fuente Salcido, N., Pacheco Cano, R., Ortiz-Rodrguez, T., &

Barboza Corona, J. (2011). Potencial de los quito-oligosacridos generados. Guanajuato:

Acta Universitaria.

Cerpa Chvez, M. (Abril de 2007). Hidrodestilacin de aceites esenciales: modelado y

caracterizacin. Hidrodestilacin de aceites esenciales: modelado y caracterizacin.

Valladolid, Provincia de Valladolid, Espaa: Universidad de Valladolid.

73
Darmadji, P., & Izumimoto, M. (1994). Effects of chitosan and nitrite onthe properties of

fermented meat. Anim. Sci. Technol., 639-646.

de la Paz, N., Prez, D., Fernndez, M., Lpez, O. D., Nogueira, A., Rapado Paneque, M., . . .

Garca, C. M. (2013). Evaluacin viscosimtrica del quitosano derivado de la quitina de

langosta. Revista Iberoamericana de Polmero, 84-91.

Dinesh, S., & Alok, R. (2000). Biomedical Applications of chitin, chitosan and its derivatives.

Macromol. Chem. Phys., 69-83.

Don, T. M., King, C. F., Chiu, W. Y., & Peng, C. A. (2005). Preparation and characterization of

chitosan-g-poly (vynyl alcohol)/poly (vinyl acohol) blends used for the evaluation of

blood-coating compatibility. Carbohydrate Polymers, 331-339.

Escobar Sierra, D. M., Ossa Orozco, C. P., Quintana, M. A., & Ospina, W. A. (2013).

Optimizacin de un protocolo de extraccin de quitina y quitosano desde caparazones de

crustceos. Scientia et Technica, 260-266.

FAO/WHO (Food and Agriculture Organization World Health Organization). (2003). Hazard

characterization for pathogens in food and water. VialedelleTerme di Caracalla:

Microbiological Risk Assessment Series.

Flores Vasquez, J., Ly, M., Tapia Huanambal, N., & Maldonado Garcia, H. (2001).

Bioremediacin de metales txicos en efluentes mineros aplicando Biosorcin. Revista

del Instituto de Investigacin de la Facultad de Ingeniera Geolgica, Minera,

Metalurgica y Geogrfica, 46-51.

74
Fornaguera, J., & Gmez, G. (2004). Bioqumica: la ciencia de la vida. Costa Rica: EUNED.

Herbotecnia. (12 de Marzo de 2014). Herbotecnia. Obtenido de

http://www.herbotecnia.com.ar/poscosecha-secadoMetodos.htm

Hernndez Cocoletzi, H., guila Almanza, E., Flores Agustin, O., Viveros Nava, E., & Ramos

Cassellis, E. (2009). Obtencin y caracterizacin de quitosano a partir de exoesqueletos

de camarn. Superficies y Vaco, 57-60.

Hernandez-Lauzardo, A., Bautista-Baos, S., Velazquez-Del Valle, M., Mnedez-Montealvo, M.,

Sanchez-Rivera, M., & Bello-Perez, L. (2008). Antifungal effects of chitosan with

different molecular weights on in vitro development of Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.)

Vuill. Carbohydrate Polymers, 541547.

Hernndez-Ochoa, L., Gonzales-Gonzales, A., Gutirrez-Mendez, N., Muoz-Castellanos, L., &

Quintero-Ramos, A. (2011). Estudio de la actividad antibacteriana de pelculas

elaboradas con quitosano a diferentes pesos moleculares incorporando aceites esenciales

y extractos de especias como agentes antimicrobianos. Revista Mexicana de Ingeniera

Qumica, 455-463.

Ikeda, T., Tazuk, S., & Suzuki, Y. (1984). Biologically active polycations, 4. Synthesis and

antimicrobial activity of poly(trialkylvinylbenzylammonium chloride)s. Macromol.

Chem. Phys., 869-876.

Investigacin y Desarrollo. (3 de Marzo de 2000). Investigacin y Desarrollo. La quitina y su

potencial industrial. Obtenido de me://A:La quitina y su potencial industrial.htm

75
Khknen, Marja, Anu, I., & Heinonen, M. (2001). Berry fenolics and their Antioxidant activity.

J. Agric. Food Chem., 4076-4082.

Kasaai, M. (2007). Calculation of Mark-Houwink-Sakurada (MHS) equation viscometric

constants for chitosan in any solvent-temperature system using experimental reported

viscometric constants data. Carbohydrate Polymers, 447-488.

Lrez Velsquez, C. (2008). Algunas potencialidades de la quitina y el quitosano para usos

relacionados con la agricultura en Lationamerica. Revista UDO Agrcola, 1-22.

Lee, H., Park, S., & Ahn, D. (2003). Effect of storage properties of pork dipped in chitosan

solution. J Korean Soc. Food Sci., 519-525.

Lin, S.-J., & Pascall, M. A. (2014). Incorporation of vitamin E into chitosan and its effect on the

lm forming solution (viscosity and drying rate) and the solubility and thermal properties

of the dried lm. Food Hydrocolloids, 78-84.

Madigan, M., & Martinko, J. (2005). Brock Biology of Microorganisms. New Jersey: Prentice

Hall.

Mrmol, Z., Gutirrez, E., Pez, G., Ferrer, J., & Rincn, M. (2004). Desacetilacin

termoalcalina de quitina de conchas de camarn. Revista Multiciencias, 91-95.

Mrmol, Z., Pez, G., Rincn, M., Araujo, K., Aiello, C., Chandler, C., & Gutirrez, E. (2011).

Quitina y Quitosano polmeros amigables. Una revision de sus aplicaciones. Revista

Tecnocientfica URU, 53-58.

76
Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural Observatorio Agrocadenas Colombia. (2005). La

cadena del camaron de pesca en Colombia. Bogota: Ministerio de Agricultura y

Desarrollo Rural Observatorio Agrocadenas Colombia.

Mohammed, M., Williams, P., & Tverezovskaya, O. (2013). Extraction of chitin from prawn

shells and conversion to low molecular mass. Food Hydrocolloids, 166-171.

Moradi, M., Tajik, H., Razavi Rohani, S., Oromiehie, A., Malekinejad, H., Aliakbarlu, J., &

Hadian, M. (2012). Characterization of antioxidant chitosan film incorporated with

Zataria multiflora Boiss essential oil and grape seed extract. LWT - Food Science and

Technology, 477-484.

Nalwa, H. (1997). Handbook of Organic Conductive Molecules and Polymers: Conductive

polymers. New York: Wiley.

Nosal, W. H., Thompson, D. W., Yan, L., Sarkar, S., Subramanian, A., & Woollam, J. A. (2005).

Infrared optical properties and AFM of spin-cast chitosan lms chemically modied with

1,2 Epoxy-3-phenoxy-propane. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 2631.

Nosal, W. H., Thompson, D. W., Yan, L., Sarkar, S., Subramanian, A., & Woollama, J. A.

(2005). UVvisinfrared optical and AFM study of spin-cast chitosan lms. Colloids and

Surfaces B: Biointerfaces, 131137.

Ojagh, S. M., Rezaei, M., & Razavi, S. H. (2010). Effect of chitosan coatings enriched with

cinnamon oil on the quality of refrigerated rainbow trout. Food Chemistry, 120, 193-198.

77
Ojagh, S., Rezaei, M., Razavi, S., & Hosseini, S. (2010). Development and evaluation of a novel

biodegradable film made from chitosan and cinnamon essential oil with low affinity

toward water. Food Chemestry, 161-166.

Olmedo, R. H., Nepote, V., & Grosso, N. R. (2013). Preservation of sensory and chemical

properties in avoured cheese prepared with cream cheese base using oregano and

rosemary essential oils. LWT - Food Science and Technology, 409-417.

Parada, L. G., Crespn, G. D., Miranda, R., & Katime, I. (2004). Caracterizacin de quitosano

por viscosimetra capilar y valoracin potenciomtrica. Revista Iberoamericana de

Polmeros.

Park, S., & Zhao, Y. (2004). Incorporation of a high concentration of mineral or vitamin chitosan

films. Journal of Agricultural and Food Chemestry, 1933-1939.

Park, S., Youn, S., Kim, H., & Ahm, D. (1999). Studies on the improvement of storage property

in meat sausage using chitosan. J Korean Soc. Food Sci. Nutr., 167-171.

Parzanese, M. (2003). Peliculas y recubrimientos comestibles. Argentina: Tecnologas para la

Industria Alimentaria.

Peng, Y., Yin, L., & Li, Y. (2013). Combined effects of lemon essential oil and surfactants on

physical and structural properties of chitosan films. International Journal of Food

Science and Technology, 44-50.

78
Peral, I., & Gartzia, I. (2001). Elementos valiosos en los residuos de industrias transformadoras

de productos de la pesca: Quitina-Quitosano y sus aplicaciones. Revista Agropecuaria,

52-54.

Rabea, E., Badawy, M., Stevens, C., Smagghe, G., & Steurbaut, W. (2003). Chitosan as

antimicrobial agent: applications and mode of action. Biomacromol, 1457-1465.

Ramirez, L., Plascencia, M., Huerta, S., Vsquez, H., & Shirai, K. (2002). Obtencin y

caracterizacin de quitinas parcialmente desacetiladas mediante tratamiento biolgico-

qumico. VIII Simposio Lationoamericano de polmeros, II Simposio Iberoamericano de

Quitina, 593-594.

Ramirez, L., Plascencia, M., Huerta, S., Vsquez, H., & Shirai, K. (2002). Obtencin y

caracterizacin de quitinas parcialmente desacetiladas mediante tratamiento biolgico-

qumico. En I. S. VIII Simposio Lationamericano de polmeros, Libro de resmenes

(pgs. 215-222). Mxico.

Ramrez, M., Rodrguez, A., Alfonso, L., & Peniche, C. (2010). Chitin and its derivatives as

biopolymers with potential agricultural applications. Biotecnologa Aplicada, 270-276.

Rao, M., Chander, R., & Sharma, A. (2005). Development of shelf-stable intermediate moisture

meat products using active edible chitosan coating and irradiation. J. Food Sci., 325-331.

Rhazi, M., Desbrieres, J., Tolaimate, A., Alagui, A., & Vottero, P. (2000). Investigation of

different natural sources of chitin: influence of the source and deacetylation process on

the physicochemical characteristics of chitosan. PolymerInt, 337-344.

79
Robbins, R. (2003). Phenolic acids in foods: an overview of analytical methodology. J. Agric.

Food Chem., 2866-2887.

Romanazzi, G., Nigro, F., Ippolito, A., Diverene, D., & Salerno, M. (2002). Effect of pre- and

post harvest chitosan treatments to control storage grey mold of table grapes. J. Food

Sci., 1862-1867.

Ruiz Navajas, Y., Viuda Martos, M., Sendra, E., Perez Alvarez, J., & Fernandez Lopez, J.

(2013). In vitro antibacterial and antioxidant properties of chitosan edible flims

incorporated with Thymus moroderi or Thymus piperella essential oils. Food Control,

386-392.

Snchez, M. F. (2006). Manual prctico de aceites esenciales, aromas y perfumes. Espaa:

Aiyana Ediciones.

Secretaria de Agricultura y Pesca. (s.f.). Guia argonomica de los cultivos representativos del

departamento para la realizacin de las estimaciones agricolas por metodos indirectos -

EAMI. Cali.

SEDICI Repositorio Institucional de la UNLP. (3 de Marzo de 2014). SEDICI Repositorio

Institucional de la UNLP. Obtenido de

http://sedici.unlp.edu.ar/bitstream/handle/10915/2685/4_-

_Evaluaci%C3%B3n_de_propiedades_fisicoqu%C3%ADmicas_de_sustratos.pdf?sequen

ce=9

Servicio Nacional de Aprendizaje SENA . (2012). Introduccin a la Industria de los Aceites

Esenciales extrados de Plantas Medicinales y Aromticas. Bogota: SENA.

80
Seydim, A., & Sarikus, G. (2006). Antimicrobial activity of whey protein based edible films

incorporated with oregano, rosemary and garlic essential oils. Food Research

International 39, 639644.

Silverstein, R., Bassler, G., & Morrill, T. (1981). Spectrometric identification of organic

compounds. Mishawaka: Wiley.

Singleton, V., & Rossi, J. (1965). Colorimetry of Total Phenolics with Phosphomolybdic-

Phosphotungstic Acid Reagents. American Journal of Enology and Viticulture, 144-158.

Siripatrawan, U., & Harte, B. (2010). Physical properties and antioxidant activity of an active

film from chitosan incorporated with green tea extract. Food Hydrocolloids, 770775.

Sun, X., Wang, Z., Kadouh, H., & Zhou, K. (2014). The antimicrobial, mechanical, physical and

structural properties of chitosanegallic acid lms. LWT - Food Science and Technology,

83-89.

Tafurt, G., Martnez, J., & Stashenko, E. (2005). Evaluacin de la actividad antioxidante de

aceites esenciales en emulsiones degradadas por radiacin ultravioleta. Revista

Colombiana de Qumica, 43-55.

Teli, M., & Sheikh, J. (2012). Extraction of chitosan from shrimp shells waste and application.

International Journal of Biological Macromolecules, 11951200.

Tharanathan, R., & Kittur, F. (2003). Chitin--the undisputed biomolecule of great potential. Crit.

Rev. Food Sci., 61-87.

81
Tolaimate, A., Desbrires, J., Rhazi, M., Alagu, A., Vicendon, M., & Vottero, P. (2000). On the

influence of deacetylation process on the physicochemical characteristics of chitosan

from squid chitin. Polymer, 24632469.

Torres, A. G. (2010). Pathogenic Escherichia coli in Latin America. Texas: Bentham Science

Publishers.

Univ. J. Autnoma de Tabasco. (2006). En U. J. Tabasco, XVI Verano de la Investigacin

Cientfica 2006 (pgs. 92-95). Tabasco.

Valderrama, J. (2000). Informacin Tecnolgica. La Serena: Centro de Informacion

Tecnologica.

Valenzuela V., C., & Arias, J. (2012). Potenciales aplicaciones de pelculas de quitosano en

alimentos de origen animal: una revisin. Avances en Ciencias Veterinarias, 33-47.

Wang, W., Jiang, Y., Wu, N., Fu, Y.-J., Luo, M., Zhao, C.-J., . . . Liu, X.-L. (2011). Chemical

composition and antimicrobial activity of the essential oil of Rosemary. Environmental

Toxicology and Pharmacology, 63-68.

Yanishlieva, N., Marinova, E., & Pokorny, J. (2006). Natural antioxidants from herbs and spices.

European Journal of Lipid Science and Technology, 776-798.

Youn, S., Park, S., & Ahn, D. (2000). Studies on the improvement of storage property in meat

sausage using chitosan. II DIfference of storage property by molecular weight of

chitosan. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr., 849-853.

82
Zakrzewska, A., Boorsma, A., Delneri, D., Brul, S., Oliver, S., & Klis, F. (2007). Cellular

processes and pathways that project Saccharomyces cerevisiae cells against the plasma

membrane-perturbing compound chitosan. Eukaryot, 600-608.

83