La selectividad es consecuencia de la
especificidad enzimtica
Factores que
Caractersticas afectan a la
cinticas de las velocidad de las
reacciones reacciones
enzimticas. Km enzimticas y por
y vmax, su tanto a la
significado. actividad
enzimtica.
Factores que influyen la
Actividad enzimtica
Concentracin de sustrato
Adems, para desarrollar un ensayo enzimtico deben
controlarse todas aquellas variables experimentales que
puedan afectar a la velocidad de la reaccin enzimtica.
Concentraciones de:
Enzima (Actividad enzimtica)
Activadores
Inhibidores
Temperatura
pH
Fuerza inica, naturaleza de los iones presentes en el medio, etc.
Determinacin de la actividad
enzimtica
La formacin de producto o
desaparicin del compuesto de partida
puede monitorizarse
espectrofotomtricamente midiendo
cambios en la absorcin ptica de la
solucin que contiene los substratos y el 1 Unidad de actividad
enzima enzimtica se define como
aquella cantidad de enzima
capaz de transformar 1 mol
de substrato por minuto.
Para determinar la actividad enzimtica es
necesario conocer:
La estequiometra de la reaccin que cataliza (cantidades de
reactivos y productos a usar en la reaccin)
HK
Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADP
G-6PDH
Glucosa-6-P + NADP+ 6-fosfogluconato + NADPH + H+
Reaccin indicadora
Se mide la velocidad de
la reaccin enzimtica
medida de Producto
medida de Sustrato
medida de Cofactor
Se realiza una nica medicin de absorbancia en la mezcla de reaccin
a un tiempo determinado (At).
Fosfatasa
cida
FA
p-Nitrofenil fosfato p-Nitrofenol + Pi
( = 420 nm )
2. Medida del Cofactor
Mtodo de dos puntos
La velocidad de transformacin
puede calcularse empleando la
frmula:
Mtodo de tres puntos o ms
Absorbancia
de transformacin de mantiene
constante durante todo el periodo de 2
mediciones.
A partir de las mediciones obtenidas
se calcula el incremento de la
absorbancia por unidad de tiempo.
Tiempo
Procedimiento continuo. 1. Medicin correcta. 2.
Medicin incorrecta por agotamiento de sustrato.
Medida de la actividad enzimtica de
muestras biolgicas
Usar:
Preparaciones liofilizadas que contienen diversas enzimas
Mezclas de sueros preparados en el laboratorio (no usar
sueros con VH, VIH)
Se debe realizar:
Control de calidad interno
Control de calidad externo
Grficas de control de calidad
Grfica de Levey-Jennings (se observa la media y la desviacin
estndar
Grfica de Cusum (mtodo de sumas acumuladas)
Principales enzimas
de inters clnico
ENZIMAS PRESENTES EN LAS
ENFERMEDADES HEPTICAS
Transaminasas
Alanina Aminotransferasa
Siglas: ALT, GTP, TGP
pH ptimo: 7.4
pH ptimo: 7.4
pH ptimo: 6.8 cuando se usa como sustrato creatinfosfato y 9.0 cuando se usa
como sustrato creatina
Isoenzimas:
CK-BB (CK1): cerebro.
CK-MB (CK2): msculo cardaco.
CK-MM (CK3): msculo esqueltico.
Causas del incremento de CK total: infarto agudo al miocardio, distrofia
muscular, infarto pulmonar, convulsiones, alcoholismo crnico, hipocalcemia,
etc.
Localizacin: citoplasma.
Isoenzimas:
LDH1 (CCCC):corazn, eritrocitos y rin
LDH2 (CCCM): corazn y sistema retculo endotelial
LDH3 (CCMM): pulmones y otros tejidos
LDH4 (CMMM): placenta y pncreas
LDH5 (MMMM): hgado y msculo esqueltico
Causas del incremento de LDH total: infarto del miocardio,
infarto pulmonar, hepatitis, cirrosis, ictericia obstructiva,
distrofia muscular, anemias, tumores, accidente cerebro-vascular.
Marcadores clsicos
Creatn fosfoquinasa (CPK total y CK-MB)
Lactato deshidrogenasa (LDH total y LDH1)
Aspartato aminotransferasa (AST/TGO)
Nuevos Marcadores
Troponina
Mioglobina
Miosina de cadena ligera
Tras el infarto, hay una liberacin de protenas intracelulares de las clulas
daadas. La primera en ser detectada es la troponina (5 10 horas post
infarto), seguida de la CK-MB, y finalmente la LDH, cuyo mximo se alcanza
a los 2 - 3 das post infarto
Enzimas presentes en las
enfermedades pancreticas
Amilasa
Siglas: AMS
pH ptimo: 7
Localizacin: citoplasma.
Siglas: LPS
pH ptimo: 3.5 a 7