JournalofIntegrativePertanian2013,12(12):21342142Desember2013

PENELITIANPASAL

Optimasi Agrobacterium tumefaciensMediated belum menghasilkan Sistem

EmbrioTransformasidanTransformasiGlyphosateResistantGene2mG2EPSPS
diJagung(ZeamaysL.)
YUGuirong1,2,LIUYan3,DUWenping2,LAGUJUN2,LINMin4,XULiyuan2,XIAO
Fangming5danLIUYongsheng1
1KeyLaboratoryuntukBioSumberDayadanEcoLingkungan,KementerianPendidikan/NegaraKunciLaboratorium
hidrolikadanMountainRiver
Engineering,CollegeofLifeScience,UniversitasSichuan,Chengdu610064,PRChina2InstituteofBiotechnology&Nuklir
Teknik,SichuanAkademiIlmuPertanian,Chengdu610066,PRChina3TanamanSciencesResearchInstitute,CinaAkademi
IlmuPertanian,Beijing100.081,PRChina4BioteknologiResearchInstitute,CinaAkademiIlmuPertanian,Beijing100081,
PRChina5Departementanaman,TanahdanIlmuEntomologi,UniversityofIdahoMoscow,ID838442339,USA

Abstrak
Sejakjagungmerupakansalahsatutanamanserealiayangpalingpentingdidunia,pembentukansistemtransformasigenetik
yang efisien sangat penting untuk perbaikan nya. Dalam penelitian ini, beberapa jalur jagung elit diuji untuk kesesuaian
Agrobacterium tumefaciensdimediasi transformasi dengan menggunakan embrio yang belum matang sebagai eksplan.
KemampuaninfeksidanefisiensitransformasiA.tumefacienssp.strainEHA105danLBA4404,yangberbedakaliperlakuan
panasdariembrioyangbelummatangsebeluminfeksi,pengaruhpenambahanLsisteindalammediumcobudidayasetelah
transformasi,danbagaimanacarapemilihandanbudidayapengaruhefisiensitransformasiyangberbedadibandingkan.Gen
glyphosateresistant2mG2EPSPSmenjelmamenjadibeberapagenotipejagungkhastermasuk78.599,Zong31danBA,di
bawahkondisioptimal.HasilpenelitianmenunjukkanbahwahipervirulenAgrobacteriumtumefacienssp.reganganEHA105
lebihmenulardibandingkanLBA4404.PencantumanLsistein(100mgL1)dalammediumcobudidaya,danpemanasandari
embrio yang belum matang selama 3 menit sebelum infeksi menyebabkan peningkatan yang signifikan dalam efisiensi
transformasi.Pertumbuhanberistirahatmediauntuk410ddanmenundaseleksibermanfaatbagikelangsunganhidupkalus
tahan.Selamainduksiperkecambahan,menambahkankonsentrasitinggi6BA(5mgL1)dankonsentrasirendah2,4D(0,2mg
L1) ke media regenerasi secara signifikan ditingkatkan persentase perkecambahan. Menggunakan prosedur transformasi
dioptimalkan, lebih dari 800 tanaman transgenik diperoleh dari 78.599, Zong 31 dan BA. Dengan penyemprotan herbisida
glyphosatepadadaundarigaristransgenik,kamimengidentifikasi66tanamanglyphosateresistantutama.Efisiensitransformasi
adalah8,2%.PCRdanSouthernblotanalisisdikonfirmasiintegrasitransgendalamgenomjagung.
Katakunci:jagung,embriobelummatang,Agrobacteriumtumefaciensdimediasitransformasi,pendekatantransgenik,glifosat
ketahanan

PENDAHULUAN
Jagungmerupakansalahsatutanamanserealyangpalingpentingdidunia.Dalamrangkauntuk
memperluassumberdayapeternakan
2013,CAAS.Seluruhhakcipta.DiterbitkanolehElsevierLtdDoi:10,1016/S20953119(13)60567
5danmemecahkanisolasireproduksiantaraspesies,tekniktransgenikdanbioteknologimoderntelah
diadopsiuntukberkembangbiakunggul,penyakitatauseranggatahan,herbisidaataustresses
lingkungantoleranvarietasjagung.Secarakhusus,geneksogen
Diterima12November,2012Diterima8Maret2013YUGuirong,Email:yuguirong@163.com;KorespondensiLIUYong
sheng,Email:liuyongsheng1122@hfut.edu.cn
OptimasiAgrobacteriumtumefaciensMediatedbelummenghasilkanembrioTransformasiSistemdanTransformasi2135

mengendalikansifatberhargatelahdiklondari
beberapatahunterakhir.Misalnya,genRDV
telahspesieslaindanberubahmenjadijagung.Namun,
berhasildiintegrasikankedalamgenomjagung
olehpembentukancodaritransformasigenetikyangefisien
budidayabenihberkecambahdengansistem
Agrobacteriumuntukjagunginbridalinekonvensional
tumefaciens,danketurunangenetikyangstabil
telahkritisuntukpembibitanberbasisrekayasatransgenik.
diperoleh(Wangetal.2007).Selainitu,
transformasidenganmenggunakanAgrobacteriumtumefaciensdimediasiadalah
embriobelummatangjagungsebagaieksplan,
GusdanBartanamanalamisistemtransformasigenetikdantelah
genjugatelahberhasildiintegrasikankedalam
telahbanyakdigunakandalamtomat,kedelai,kapas,kacangtanah,
genomjagunginbridaatauhibridabarisdari
A188kacang,beras,danjagung(Umbecketal1989;.Schroeder
menggunakantransformasiAgrobacterium
dimediasietal1993;.Hieietal1994;.Chengetal1996;.Ishida
sistem(Ishidaetal.1996).etal.1996).A.
tumefaciensdimediasitransformasi
Dalampenelitianini,genglyphosateresistant
2mG2memilikibeberapakeunggulandibandingkandenganpemuliaankonvensional,
EPSPS(GenBankada.Eu126547)sebelumnya
telahtermasukkesederhanaan,biayarendah,kemudahaninvitro
diisolasidaristrainPseudomonasfluorescens
manipulasi,integrasistabilgeneksogen
ditekankanolehglyphosate.Initelah
ditunjukkanuntukmenunjukkankegenomtanaman,dansedikitstrukturalpergantian
510kalilebihkuatglyphosatekemampuan
tahandarigenterpadu(Ishidaetal1996;.Zhangdan
lainlaindilaporkansebelumnya,danstrukturgen
ituRong2008).
novel.Padatingkatasamnukleat,iatidakmemiliki
homologikalusinduksidanregenerasiadalah
 mendasardenganEPSPSdilaporkangensynthase
encoding.dasaruntuksemuapendekatantransgeniksukses.Menggunakan
Padatingkatasamamino,ituadalah24,53%
homologdengankalusyangberasaldariembrioyangbelummatangjagung
A.tumefaciensCP4dilaporkanolehMonsanto,
daninbridabarisA188,tanamanjagungdiregenerasiuntuk
mengandungadaurutanperlindunganpatendan
pertamakalinyapadatahun1975(GreendanPhillips1975).Sejak
situsmutasi(Zhu2002).Dalampenelitianini,
maka,sistemtransformasigenetikjagungtelah
genglyphosateresistant2mG2EPSPS
dikembangkandengancepatberdasarkanteknikregenerasi.
diubahmenjadibeberapabarisjagung,termasuk
Telahdilaporkanbahwakalusjagungdapatdiinduksi
78.599,Zong31danBA,yangtelahsebagian
besardariberbagaieksplan,sepertiantera(Tingetal.
digunakandalamkombinasihibridisasi.Kami
menemukanbahwa1981),jumbaidewasa(Rhodesetal1986;.Songstad
beberapafaktorsignifikanmempengaruhi
efisiensietal1992),glumesjumbaidewasalakilaki
transformasiembrioyangbelummatang
dimediasioleh(Suprasannaetal1986),perbungaandewasatumefaciens...
A.Kamidioptimalkantransformasi(Pareddy
danPetolino1990),menembakmeristemZhang
(sistembelummenghasilkanembriojagungdan
diperolehetal.2002),daunbibit(RaydanGhosh
35S::2mG2EPSPStanamantransgenik.1990),
segmenbibit(Santosetal.1984),beberaparumpunmenembak,danembriosomatikdari
HASILtunaspucuk(Zhongetal.1992).
Penyelidikaninimenunjukkanbahwaembriobelummatangsebagaieksplanmenganugerahkan
PengaruhstrainAgrobacteriumyangberbeda
padatransformasitertinggidanefisiensiregenerasi.Penelitiantentangkompetensijagungyangbelum
matang
efisiensitransformasi
embriountukAgrobacteriumdimediasitransformasi
embriobelummenghasilkandiisolasidarigaris
jagungZong31danmenunjukkanbahwahanyaselselkompetendengan
BAterinfeksiselama5menitdenganA.
tumefaciensstrainregenerasiyangkuatdankemampuanintegrasitersebut
LBA4404danEHA105.Setelahinfeksi,dewasa
sebagaijaringanmeristematikdapatsegeraditerima
embriodipindahkankemediacobudidaya.
InfeksiAgrobacterium(Vasiletal1984;.Armstrong
histokimiaGussementaratesekspresiyangdan
Green1985;SchlappidanHohn1992).Karena
digunakanuntukmenilaiGusekspresigenpada
dewasadaripertumbuhanmerekacepatdandivisi,dannomorbesar
embriosetelah3dcobudidaya.Seperti
ditunjukkandalamselkompeten,eksplanembrioyangbelummatangmemiliki
Tabel1danGambar.1,A.tumefaciensEHA105
telahumumdigunakandalamtransformasijagungdi
kompetensitinggiuntuktransformasidariLBA4404
2013,CAAS.Seluruhhakcipta.DiterbitkanolehElsevierLtd
2136YUGuirongetal.

dimenginfeksijagungembriobelummatang,danefisiensitransformasiA.tumefaciensEHA105adalah
65% lebih tinggi dari LBA4404. Selanjutnya, garis jagung BA lebih rentan untuk A. tumefaciens
EHA105infeksidarigarisjagungZong31,sedangkangarisjagungZong31lebihrentanterhadapA.
tumefaciensLBA4404infeksidaripadaBAbarisjagung(Tabel1danGambar.1).Secarakeseluruhan,
hasil kami menunjukkan bahwa kedua A. tumefaciens straindangenotipe eksplanmemainkanperan
pentingdalamsistemtransformasitanamanAgrobacteriumdimediasi.
PengaruhwaktukejutanpanaspadaefisiensiasiTransform
KamiberusahauntukmenentukanpengaruhwaktukejutanpanassebeluminfeksiAgrobacteriumembrio
yangbelummatangpadaefisiensitransformasi.Untuktujuanini,belummatang
2013,CAAS.Seluruhhakcipta.DiterbitkanolehElsevierLtdembrioterisolasidari
barisjagung78.599yangpanasterkejutpada45Cselama0,2,3,4,atau5menit,diikutiolehinfeksi
A.tumefaciensEHA105daninkubasipadamediacobudidayadalamgelappada23 Cselama3d.
MenggunakanhistokimiaGusekspresisementarauji,kamimenemukanbahwaperlakuanpanasshock
secarasignifikanmeningkatkanefisiensitransformasiembriobelummatang,dan3menitadalahwaktu
perlakuanpanasshockoptimal(Tabel2).Namun,efisiensitransformasitidakberubahsecarasignifikan
dalamembriobelummatangsedang(0,81,5mm)mengalamisyokpanasuntuk4atau5menit(Tabel2).
Dengandemikian,kamimenyimpulkanbahwapanasshockadalahpengobatanyangdiperlukanuntuk
meningkatkanefisiensitransformasi,mungkindenganmemfasilitasiinfeksiselkompetensiembrioyang
belummatangolehA.tumefaciens.Namun,kamimenemukanbahwanomornomortertentudariembrio
yangbelummatanglebihkecil(0.50,8mm)meninggalsetelahpanasshock,menunjukkanbahwahati
hatidiperlukankarenaembriomungkinlebihrentanterhadapAgrobacteriumsetelahperlakuanpanas
shock.
PengaruhLsistein(LCys)padaefisiensiasiTransform
UntukmengujiefekLCysdalammediumcobudidayapadaefisiensitransformasiembriobelummatang,
embriobelummatangdarigarisjagungBAdibudidayakanselama3dpadamediumcobudidayadengan
atautanpa100mgL1LCyssetelahinfeksiolehA.tumefaciensEHA105.MenggunakanhistokimiaGus
sementaraujiekspresi,kamimenemukanbahwaefisiensitransformasi,ditunjukkandenganekspresiGus
positif,embriobelummatangdiinokulasilebihdari95%dalammediumyangmengandung100mgL1
LCys,sedangkanefisiensitransformasikurangdari
Ara.1EkspresigenGusdiimaturjagungZong31danBAembriozigotikterinfeksiA.tumefaciensEHA105atau
65%dalammediumtanpaLCys(Tabel3).Khususnya,dengantidakadanyaLCys,ekspresiGusLBA4404gen.A,BA
terinfeksiEHA105.B,Zong31terinfeksiEHA105.C,Zong31terinfeksiLBA4404.D,BAterinfeksiLBA4404.

hanyaditemukandiujungembrioyangbelummatang(Gambar.2),lagimenunjukkanefisiensi
transformasiyanglebihrendah.
Tabel1PengaruhkombinasiyangberbedadariA.tumifaciensEHA105danLB4404danreseptorgenotipepadaefisiensi
transformasi
A.tumifacienstrainJagunggaris
Guspositifembrioyangbelummatang/diinokulasiMeniruIMeniruIIembrioyangbelummatang
meniruIII
efisiensiTransformasi(ratarata,%)
EHA105Zong3129/3232/3218/2885
BA37/3732/3430/3494,1LB4404Zong3115/2819/0513/4137,2BA17/421/203/4017,7
OptimasiAgrobacteriumtumefaciensdimediasibelummenghasilkanSistemembriotransformasidantransformasi2137
Tabel2Pengaruhwaktukejutanpanasyangberbedasebeluminfeksiembrioyangbelummatangdarigarisjagung78.599pada
efisiensitransformasiolehA.tumifacien

bahwainiglifosatantibiotikdalammediumseleksidipengaruhikalussproutingdandiferensiasi
Guspositifembrioyangbelummatang/
Transformasi

karenakurangnyatoleransiantibiotikpada
waktuyangbelummatang(min)
diinokulasiembriobelummatang
efisiensiMenirusayaMeniruIIMeniruIII(ratarata,%)013/2022/4910/1954,2

embrio.Dalammetodeseleksipertama,tekananselektifsecarabertahapdiberlakukan,yangmungkin
memiliki
212/2219/2419/3065,7

toleransiantibiotikditingkatkandarimereka
belumdewasa3429/3232/3218/2885,020/2318/2716/2176,6
embrioataukalus;dengandemikian,efekdariantibiotik
524/3217/2521/2773,6

glifosatpadasproutingdandiferensiasikalusmenjadikurangefektif.SepertiterlihatpadaTabel4,untuk
semuatigabarisjagungdiuji,transformasiefisiensiTabel3PengaruhmenambahkanLCysmenjadico
budidayapada
daritinggikerendahadalahdiurutanZong31,transformasi
BAembrioyangbelummatangdarilinijagungBA
Lsistein(mgL1)
GuspositifdiinokulasiMenirusayabelumdewasaembrio/
transformasiembrioyangbelummatang
efisiensiMeniruIIMeniruIII

(ratarata,%)dan78.599,dantransformasi78599adalahjauhlebihefisiendibandingkandengandua
lainnya.Menurutpengamatankami,iniadalahkemungkinankarenakalusdari78599010021/4219/30
16/2262,024/2432/3430/3494,1
lebihsensitifterhadapglifosatdibandingkandengandualainnya.
Ara.2TransientGusekspresigendiimaturjagungBAembriozigotikdibudidayakandimediadenganatautanpa100mgL1L
cysteine.A,BAdibudidayakandihadapan100mgL1Lcysteine.B,BAdibudidayakandengantidakadanyaLsistein.

Pengaruhmetodeseleksiyangberbedapadaefisiensitransformasi
Untukmengetahuipengaruhmetodeseleksipadaefisiensitransformasi,duametodeseleksiyangberbeda
diterapkan dalam penelitian kami: 1) Setelah 3d inkubasi pada media cobudidaya, Agrobacterium
terinfeksiembrioyangbelummatangyangditransferkeberistirahatmediauntuk47d,dandiinkubasi
padapemilihanmediaI,IIdanIIIselanjutnya;2)setelah3dpadamediacobudidaya,Agrobacterium
terinfeksiembrioyangbelummatangyanglangsungditransferkemediumseleksiIII.Sepertiterlihat
padaTabel4,untuksemuatigabarisjagungdiuji,efisiensitransformasidenganmetodeseleksipertama
adalahsekitarduakalilipatdarimetodeseleksikedua(Tabel4).Kamiberspekulasi
2013,CAAS.Seluruhhakcipta.DiterbitkanolehElsevierLtd
Tabel4PengaruhmetodeseleksiyangberbedapadaefisiensiAgrobacteriumdimediasitransformasi
Jagunggaris
diinokulasiembrioyangbelummatang(A)
efisiensiTransformasi(B/A,%)
78.599
MetodeSeleksi
antibiotiktahankalusyangdihasilkan(B)
1(istirahat)50071.42(tidakadaistirahat)48030.6
Zong31
1(istirahat)2(tidakistirahat)5004901605032,010,2
BA
1(istirahat)4832(tidakadaistirahat)4951105522,811,1

Pengaruhyangberbedahormonpersentaseasigermin
dalamrangkameningkatkanpersentaseperkecambahantahankalus,konsentrasiyangberbedadari6BA
dan2,4Dditambahkankedalammelantikembryoiddanregenerasimenengah.Kamimenganalisistahan
kalus dari 78.599 dan menemukan bahwa menambahkan konsentrasi tinggi 6BA (5 mg L1) dan
konsentrasi rendah 2,4D (0,2 mg L1) persentase ke dalam media regenerasi secara signifikan
meningkatkanperkecambahan(tabel5).
Skriningbibitglyphosateresistant
Sebanyak3500embriojagungdewasadiubah,dariyang810bibitulangdiperolehdandipindahkanke
lapangan.Bibithasilregenerasiterdiridari545dariZong31,178dariBAdan87dari78599.10hari
setelahtanamtrans,satudaunsetiapbibitdiaplikasikan
2138YUGuirongetal.
Tabel5Pengaruhhormonyangberbedapadapersentaseperkecambahanbarisjagung78.599tahankalus
BA+2,4D(mgL1)
Tahankalus
perbenihankalus(rataratatidak.Untuk
(rataratatidakada.Selamatigaulangan)
tigaulangan)
Perkecambahan
Hijaupersentase(%)
bibit
1+0,510550183+0,510660245+0,21010100535+01088041

dengan solusi glifosat baru disiapkan dan kemudian mencetak gol untuk ketahanan herbisida atau
sensitivitas herbisida. Tanaman transgenik yang resisten terhadap glifosat tumbuh tanaman kontrol
biasanyapositif(Gambar.3A),sedangkantanamanrentanditampilkancacatpertumbuhan.Daunujung
tanamanrentanmulaisecarabertahapmenjadikuningdanlayu,danakhirnyamati(Gambar.3B).Secara
total, kami memperoleh 66 tumbuh normal tanaman yang tumbuh normal dan berspekulasi untuk
glyphosatetanamantahan.Tanamaninitahanterdiridari33
Gambar.3Identifikasitanamanglifosattahan.A,tahan
Zong31,21BAdanduabelas78.599transgeniktanaman,
tanaman.B,tanamansensitif.C,tanamantransgeniksubur.
D,transgeniksebagianbesaryangmampuberkembangsecaranormaldan
telingadanbiji.

menghasilkan biji yang layak (Gambar. 3D), tetapi beberapa dipamerkan hermafrodit "throwback"
fenotipe (Gambar. 3C). Sisa bibit regenerasi yang tanaman nonpositif yang mungkin telah tumbuh
karenawaktupemilihantidakcukuptahankalus.
AnalisisPCRdariT
0

tanamantransgenik
JumlahDNAdari66T
0

tanamanyangtumbuhnormaldiekstraksidandianalisisdenganPCRuntuk
menentukan
Gambar.4transgenikanalisisPCRtanamanDNA;T
M,0

transgenik2000tanamandari,pembuatDNA78599.112bp;13,airsteril;14,kontrolnegatif,non
transgenikjagung78.599DNA;15,kontrolpositif,plasmidDNA.Kehadiran2mG2EPSPStransgen.
SepertiyangditunjukkanpadaGambar.4,57dari66diperiksatanamanmengandungtransgen2mG2
EPSPS,yangterdiridari29Zong31,21BAdantujuh78.599tanamantransgenik.Padatitikini,kita
 percaya57tanamanyangtanamanpositiftransgenik,dansembilanlainnyatanamanyangnontanaman
positifyangmungkintelahdikembangkankarenatekananseleksimemadaiataukurangnyapaparansolusi
glifosat.
IdentifikasitanamanglifosattahandananalisisSouthern
blotT
0

2013,CAAS.Seluruhhakcipta.DiterbitkanolehElsevierLtdpaparan,kamimencetak
gol untuk ketahanan herbisida atau sensitivitas herbisida (Gambar. 5A). Kami menemukan bahwa
beberapatanamanyangtahandanbeberapasensitifdibarisyangsamadaritelingajagungyangsama,
menunjukkanbahwaglifosatresistancetanamantransgenikadalahstabil,mungkinsemacaminibahan
yangmemisahkan.Melaluipenyemprotanlarutanglifosat,kamijugamemperolehbeberapabaristahan
stabil.
DalamT
1

generasi,kamimengidentifikasilimatanamantransgenikdari78.599olehSouthernblothybridization.
Ara.5BmenunjukkanSouthernhasilhibridisasitanamanmenyerbuksendiriuntukT
1

generasi.
dilakukanpadalimatanamantransgenik.T
1

bibitdisemprotdenganbarudisiapkan200mg
Secarakeseluruhan,semuahasildiatas
menunjukkanbahwasolusiL1glyphosate.1015harisetelahglifosat
tanamantransgenikmengandunggen2mG2EPSPS.
OptimalisasiAgrobacteriumtumefaciensMediatedbelummenghasilkanSistemEmbrioTransformasidanTransformasi2139

(Zhaoetal2002;.HuangdanWei2005;.Yangetal2006).
KontenmediajugamemainkanperanpentingdalambacteriumdimediasitransformasiAgro,parti
yangsirkulerhorm,yangseringmemainkanperanyangmenentukandalammendorongpembelahansel,
pertumbuhan dan diferensiasi. Penelitian telah menunjukkan bahwa penambahan auksin (2,4D) dan
sitokinin(KT/BA)diyang
Gambartepat.5IdentifikasidanSouthernblotanalisisglyphosate

konsentrasidapatmempromosikan
pengembangantahansetelahglyphosateT
1
paparantransgenik.tanamanB,dariSouthernblot78599.A,analisisT
1bibittanamanyangpositif.1,negatifpada15d
T
1
PCR

mikrosporasporophyte.Selainzattambahankedalammediabisajugatanamansecaraefektiftransgenik
DNA.
meningkatkanefisiensitransformasi.Misalnya,menambahkan10mgL1
AgNO3
2013,CAAS.Seluruhhakcipta.DiterbitkanolehElsevierLtd
control,reseptor78.599DNA;26,T
1

PEMBAHASAN
transformasiAgrobacteriumdimediasiembriojagungdewasadipengaruhiolehwaktusampling,ukuran
dannegarapertumbuhanembriobelummatang,kondisibudidayainvitro,dangenotipepenerima.Dalam
penelitian kami, tiga jagung elit jalur anakan Zong 31, BA dan 78.599 yang sensitif terhadap A.
tumefaciens yang digunakan sebagai penerima. Kami memberikan bukti yang menunjukkan bahwa
penerima genotipe masih merupakan faktor pembatas utama untuk transformasi embrio yang belum
matang.Dengandemikian,genotipeharusmenjadisalahsatuperhatianutamauntukmanipulasigenetik
yangdidasarkanpadatransformasiembrioyangbelummatang.
Strain Agrobacterium juga dapat mempengaruhi efisiensi transformasi jagung. Beberapa studi
menunjukkan bahwa kombinasi dari strain dan vektor transformasi sangat penting bagi transformasi
jagung.Misalnya,vektorsuperbinerpSB131danpTOK233telahdiusulkanuntukdigunakanbersama
sama dengan Agrobacterium LBA4404 regangan (Ishida et al. 1996). Di masa lalu, A. tumefaciens
LBA4404ketegangantelahdigunakanuntuktransformasijagungdengansuksesbesar.Namun,penelitian
kami menunjukkan bahwa A. tumefaciens EHA105 regangan confered efisiensi yang lebih tinggi
dibandingkan LBA4404 ketegangan ketika diterapkan pada transformasi embrio jagung yang belum
matang (Tabel 1 dan Gambar 1.). Konsisten dengan pengamatan kami, penelitian lain juga telah
mengungkapkanbahwajenisstrainAgrobacteriummerupakanfaktorpentingyangharusdiperhatikan
dalamtransformasigenetikthroughputyangtinggidimediasiolehA.tumefacienspadajagung
ke dalam media secara efektif dapat menghambat jagung kalus
kecoklatan,dan2umolL1Ancymidoldapatmemperlambatpertumbuhanplanletjagungulang(Wang
et al. 2010). Selanjutnya, penambahan antibiotik selama proses diferensiasi dan perakaran dapat
meningkatkanefisiensitransformasiuntukbeberapatanaman(Huangetal.2002),sedangkanyanglain
telah menunjukkan bahwa penambahan antibiotik pada tahap ini bisa menghambat diferensiasi dan
perakarankalustahandanmengarahpadapenangkapanpembentukanbibit(Howeetal.2006).Hasil
kami menunjukkan bahwa tekanan skrining moderat sangat penting untuk meningkatkan efisiensi
transformasi;Namun,iniharusdilakukandenganhatihati.Untukembrioyangkurangrentanterhadap
toksisitasagenskriningpadatahapdiferensiasi,penambahanantibiotikselamaprosesdiferensiasidan
perakarandapatmeningkatkanfrekuensitanamanberubah.
Hal ini umumnya berpikir bahwa Agrobacterium dimediasi Ti sistem plasmid masih merupakan
sistemtransformasitanamanyangideal.Namun,sampaisekarang,metodetransformasitidakmemiliki
standarseragam,dandalambanyakkasusefisiensitransformasirelatifrendah.Olehkarenaitu,penelitian
ini bertujuan untuk membangun sebuah sistem transformasi yang efisien, stabil dan bersatu masih
merupakantopikpentingdaripenelitiantransformasijagung.Banyakciriciripentingdaritanamandi
alam dikendalikan oleh beberapa gen, tapi sejauh ini, transformasi genetik penelitian jagung telah
difokuskanpadatransformasigentunggal.Olehkarenaitu,penelitianmasadepankitaharusmencakup
transformasipoligenik,transformasifixedpointdantransformasipenandabebas.
2140YUGuirongetal.

KESIMPULAN
hipervirulenAgrobacteriumtumefacienssp.reganganEHA105lebihmenulardibandingkanLBA4404.
Pencantuman Lsistein (100 mg L1) dalam medium cobudidaya, dan pemanasan dari embrio yang
belummatangselama3menitsebeluminfeksimenyebabkanpeningkatanyangsignifikan
Gambar.6PembangunanpCAMBIA230135S::2mG2EPSPSvektorekspresitanaman.LB,meninggalkanperbatasan;NOS,
nopalineterminatorgensynthase;NPTII,genphosphotransferaseneomisin(berundingdalamefisiensitransformasi
Pertumbuhanistirahatkanamisin.);

ketahanantanamanuntukMenengah35S,virus
kembangkolmosaik35Suntuk410ddanmenundaseleksibermanfaatbagikelangsunganhidupkalus
tahan.Selama
promotor;CTP,kloroplasangkutanpeptida;2mG2EPSPS,gencodingwilayahsynthase5
enolpyruvylshikimate3fosfat;Gus,glucuronidasegenreporter;RB,bataskanan.induksi
perkecambahan,menambahkankonsentrasitinggi6BA(5mgL1)dankonsentrasirendah2,4D(0,2
mgL1)kemediaregenerasisecarasignifikanditingkatkanpersentaseperkecambahan.Glyphosategen
tahan2mG2EPSPSmenjelmamenjadi
mediauntukOD
600
=0,3,dan100umolL1ASditambahkanuntukcobudidayadenganembriojagungyangbelummatang.
UntukinfeksiAgrobacterium,embriobelummatang(0.81,5mm)yangdibedahdalambakteribebasinfeksimenengahbeberapa
genotipejagungkhastermasuk78.599,
(1,8mL)di2mLtabungeppendorf(20100embrioper
Zong31danBA,dibawahkondisioptimum.
tabung),danpanaskagetpada45Cselama2,3,4,atau5
menit.Efisiensitransformasiadalah8,2%.
mediainfeksitelahdihapus,dan11,5mlA.tumefacienssuspensiditambahkanuntukmenginfeksiembrioselama5menit.
Setelahinfeksi,embriodipindahkankeBAHANcoDANMETODE
budidayamenengahdankelebihanA.tumefacienssuspensidipipetdaripermukaanmedium.Embrio

BahanTanaman
yangberorientasidengansisiembrioaxiskontakdenganmedia(scutellumsisiatas).Pelatdiinkubasidalamgelappada23C
selama3d,setelahituembrioJagunggarisinbrida78.599diberikanolehInstituteof
ditransferkeberistirahatmenengah.Bioteknologi&Nuklir
Teknik,SichuanAkademiIlmuPertanian.Zong31danBAdisediakanoleh
seleksidanregenerasiCropScienceResearchInstitute,
CinaAkademiIlmuPertanian,Beijing,China.
Setelah47dinkubasipadaberistirahatmenengah(2528C,gelap),

Agrobacteriumtumefaciensstraindan
embriodiinkubasidalammediaseleksidalamgelappada25C,danmediumseleksisegarditambahkansetiap2minggu.
plasmid
Sementaraitu,kamimendirikansebuahkontroldimanaembrioyangbelummatangyanglangsungditransferkemediumseleksi
A.tumefaciensstrainEHA105berasaldarilabkami.A.tumefaciensstrainLBA4404dangen2mG2EPSPSdisediakanoleh
Prof.LuWeidiBioteknologiInstitute,CinaAkademiIlmuPertanian.BinervektorpCAMBIA2301yangberisi35S::2mG2
EPSPS(Gbr.6)digunakanuntukpercobaan.
setelahcobudaya.Kalusyangdihasilkandipindahkankemediuminduksiembryoiddalamgelappada25Cselama2minggu,
setelahitukalusembryoiddipindahkankedalammediaregenerasidalamruangpertumbuhanpada25Cdibawah16/8h(hari/
malam)fotoperiode.Ketikatunasmulaimuncul,kalusyangdipindahkankerootingmediaselama4minggu.Tanamanyang
berakaryangditransplantasikandipot

Infeksidancobudidaya
tanah,tertutupuntukbeberapaharipertamadengantutuptransparanuntukpemulihan,diikutiolehpertumbuhandalamkondisi
rumahkaca(DongdanQu2005).A.tumefaciensstrainLBA4404danEHA105,menyimpanvektorbinerpCAMBIA230135S::
2mG2EPSPS(Gbr.6),yangberlapisdarisahamgliserol12dsebelumpercobaandantumbuhpadasuhu28C.Kolonitunggal
adalah

ekspresihistokimia
analisisdarigenGus
dipilihdanditanamdalammediaYEPdengan50mgL1rifampisindan50mgL1kanamisinsampaiOD
600
mencapai0,6.Bakteri
histokimiaGustes(Jeffersonetal.1987)yangdigunakan
dikumpulkandankembaliditangguhkandenganinfeksicairan
untukmenilaiekspresitransiengenGusdidewasa
2013,CAAS.Seluruhhakcipta.DiterbitkanolehElsevierLtd
OptimasiAgrobacteriumtumefaciensMediatedbelummenghasilkanSistemEmbrioTransformasidanTransformasi2141
Tabel6Mediumyangdigunakandalampenelitianini
NamadanmenggunakankomposisiMainBasicmedia4.0gL1NB(N6macroelementsand+B5mikro)1molL1N6organik
+0,7gL1proline+0,5gL1dihidrolisiscasein+20gL1
sukrosa+3,0gL1PhytagelInfeksimenengah2,15gL1MSgaram(MSmacroelementsand+mikro
MS)+1molL1MSorganik+0,1gL1Inositol+68,5gL1sukrosa+36gL1
glukosa+2mgL12,4D+100umolL1AS,pH=5,2Cobudayamenengah2,15gL1MSgaram+1molL1MSorganik+
20gL1sukrosa+10gL1Gucose+0,7gL1proline+0,5gL1dihidrolisiskasein(AHC)2mgL1
2,4D+100umolL1AS+10mgL1
AgNO3
100mgL1sistein+3,0gL1Phytagel,pH=5,8Beristirahatmedia
Basicmenengah+2mgL12,4D+10mgL1
AgNO3
0,5gL1MES+250mgL1sefotaksim,pH=5,8menengah
Seleksi1Pemulihanmenengah10mgL1AgNO
3
+0,6mmolL1glyphosate,pH=5,8menengahSeleksi2Pemulihan
menengah+0,8mmolL1glyphosate,pH=5,8menengahSeleksi3Pemulihanmenengah10mgL1
AgNO3
1mmolL1glyphosate,pH=5,8melantikembryoidmediaBasicmenengah
+20gL1sukrosa+5mgL16BA+0,2mgL12,4D+250mgL1sefotaksim,pH=5,8DiferensiasimediaBasicmenengah
+20gL1sukrosa+250mgL1sefotaksim,pH=5,8Rootingmenengah2,15gL1MSgaram(MSmacroelementsand+MS
mikro)1molL1MSorganik+30gL1sukrosa+0,2mgL1NAA+0,01mmolL1
glyphosate+2,5gL1Phytagel,pH=5,8
NB,organikN6,Phytagel,MSgaram,danMSorganikyangdibelidariPhytoTechnologyLaboratoriesTMCo,USA.
embrio1atau2dsetelah3dcobudidaya(4atau5harisetelahinfeksi).TingkatekspresiGusdinilaipadabasisperembrio
denganmemperkirakanjumlahfokusbiruterlihatdisisiscutellumsetiapembrio.Embriomenampilkanfokusbiruhanyapada
sisiembriosumbueksplandicetaksebagainonexpressors.
EfisiensiekspresiGussementaraembrioyangbelummatang(%)=Jumlahembrioyangbelummatangdenganbintikbintik
biruataubirudot/Jumlahno.darimengubahembrioyangbelummatang.

Analisisselatanblot
GenomicdaunDNAdisiapkan23gjaringandaunsegardiisolasidariT
1
2013,CAAS.Seluruhhakcipta.DiterbitkanolehmetodeElsevierLtd.DNAtanamantransgenikdianalisis
denganPCRuntukmenentukankehadiran2mG2EPSPS.Primerdirancanguntuk2mG2EPSPSkonfirmasiintegrasiyangF:5
TGGCTACCTTAGGTCAGAATG3danR:5TCCTGCATTTGTGATCCTACC3.
UcapanTerimaKasihPenelitianinididukungolehKeyProyekNasionalvarietastransgenikberkembangbiak(2009ZX08003
003B),CahayaBaratTalentPelatihanProyekChina(20102011)danProyekSichuanProvinceKeuanganRekayasaGenetika,
Cina(2011JYGC01002).
didugatanamanjagungtransgenikmenggunakan
Referensiyangsetiltrimetilamoniumbromidametode
(CTAB),sepertiyangdijelaskanolehMurraydanThompson(1980).40ugDNAgenompersampeldicernadenganenzim
restriksiHindIIIpada37Csemalamdandipisahkanpada0.8%(w/v)gelagarosa.DNAanalisisgelblot(Sambrooketal.
1989)dilakukanpadasampelDNAmenggunakanprobedigoksigeninlabel.
ArmstrongCL,HijauCE.1985.PembentukandanpemeliharaangemburkalusjagungembriogenikdanketerlibatanLprolin.
Planta,164,207214.BrettschneiderR,BeckerD,LorzH.1997.transformasiEfisienjaringanscutellarembriojagungyang
belummatang.TeoritisdanTerapanGenetika,94,737748.ChengM,JarretRL,LiZ,XingA,DemskiJW.1996.Identifikasi
tanamanglyphosateresistant
Produksikacangtanahtransgeniksuburtanaman(ArachiskypogaeaL.)menggunakanAgrobacteriumtumefaciens.Sebuahtes
glyphosatedaunsemprot(Brettschneideretal.1997)digunakanuntukmengidentifikasiekspresigenEPSPsdiketurunan.
HerbisidaRoundup(Monsanto,Amerika)dilarutkandalamairbersamadengan0,1%(v/v)Tween20kekonsentrasiglifosat
akhir200mgL1.Seedlingsweresprayedwithafreshlypreparedglyphosatesolutionwhentheyweregrowingwithfiveleaves,
andthenscoredforherbicideresistance(alive)orherbicidesensitivity(dead).
PlantCellReports,15,653657.DongSJ,QuRD.2005.HighefficiencytransformationoftallfescuewithAgrobacterium
tumefaciens.PlantScience,168,14531458.GreenCE,PhillipsRL.1975.Plantregenerationfrom
tissueculturesofmaize.CropScience,15,417421.HieiY,OhtaS,KomariT,KumashiroT.1994.Efficienttransformationof
rice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundaries

DNAextractionandPCRamplification
oftheTDNA.ThePlantJoural,6,271282.HoweA,SatoS,DweikatI,FrommM,ClementeT.2006.Rapidandreproducible
AgrobacteriummediatedTotalDNAofputativetransgenicplantswasextracted
transformationofsorghum.PlantCellReports,25,784
byusingthecetyltrimethylammoniumbromide(CTAB)
791.
2142YUGuirongetal.
HuangX,WeiZ.2005.SuccessfulAgrobacteriummediatedgenetictransformationofmaizeeliteinbredlines.PlantCell,Tissue
andOrganCulture,83,187200.HuangYH,ZhouMP,YeXG,TangKX,ChengHM,LuWZ.2002.Studyonthedevelopment
oftransgenicwheatmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.ActaAgronomicaSinica,28,510515.(inChinese)IshidaY,Saito
H,OhtaS,HieiY,KomariT,KumashiroT.1996.Highefficiencytransformationofmaize(ZeamaysL.)mediatedby
Agrobacteriumtumefaciens.NatureBiotechnology,14,745750.JeffersonRA,KavanaghTA,BevanMW.1987.GUSfusions:
glucuronidaseasasensitiveandversatilegenefusionmarkerinhigherplants.EMBOJournal,6,39013907.MurrayMG,
ThompsonWF.1980.RapidisolationofhighmolecularweightplantDNA.NucleicAcidsResearch,8,43214325.PareddyDR,
PetolinoJF.1990.Somaticembryogenesisandplantregenerationfromimmatureinflorescencesofseveraleliteinbredsof
maize.PlantScience,67,211219.RayDS,GhoshPD.1990.Somaticembryogenesisandplantregenerationfromculturedleaf
explantsofZeamays.AnnalsofBotany,66,497500.RhodesCA,GreenCE,PhillipsRL.1986.Factorsaffectingtissueculture
initiationfrommaizetassels.PlantScience,46,225232.SambrookJ,FritschEF,ManiatisT.1989.MolecularCloning:A
LaboratoryManual.Ed2.ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY.SantosMA,TorneJM,BlancoJL.
1984.MethodsofobtainingmaizetotipotenttissuesI:seedlingsegmentsculture.PlantScienceLetter,33,309315.SchlappiM,
HohnB.1992.CompetenceofimmaturemaizeembryosforAgrobacteriummediatedgenetransfer.ThePlantCell,4,716.
SchroederHE,SchotzAH,WardleyRichardsonT,SpencerD,HigginsTJV.1993.Transformationandregenerationoftwo
cultivarsofpea(PisumsativumL.).PlantPhysiology,101,751757.SongstadDD,PetersonWL,ArmstrongCL.1992.
Establishmentoffriableembryogenic(typeII)callusfromimmaturetasselsofZeamays(Poaceae).AmericanJournalofBotany,
79,761764.SuprasannaP,RaoKV,ReddyGM.1986.Plantletregenerationfromglumecalliofmaize(ZeamaysL.).
2013,CAAS.Seluruhhakcipta.PublishedbyElsevierLtd.TheoreticalandAppliedGenetics,72,120122.
TingYC,YuM,WanZZ.1981.Improvedanthercultureofmaize(ZeamaysL.).PlantScienceLetter,23,139145.UmbeckP,
SwainW,YangNS.1989.Inheritanceandexpressionofgenesforkanamycinandchloramphenicolresistanceintransgenic
cottonplants.CropScience,29,196201.VasilV,VasilIK,LuC.1984.Somaticembryogenesisinlongtermcallusculturesof
ZeamaysL.(Gramineae).AmericanJournalofBotany,71,158161.WangJX,SunY,LiY.2007.Maize(Zeamays)genetic
transformationbycocultivatinggerminatingseedswithAgrobacteriumtumefaciens.BiotechnologyandAppliedBiochemistry,
46,5155.(inChinese)WangXH,BaiJR,SunY,ShiXY,RenZQ.2010.StudyonAgrobacteriumtumefaciensmediated
glyphosateresistantgene(EPSPS)transformationandcorrelationfactorinmaize.JournalofShanxiAgriculturalScienses,38,
1114.(inChinese)YangAG.2006.Studyonetheoptimizationofthemaizecallusgenetictransformationsystemmediatedby
Agrobacteriumandthemalesterilelineingeneticengineering.PhDthesis,SichuanAgriculturalUniversity,China.(inChinese)
YuanY,LiQY,HaoWY.2006.StudiesoninfluencingfactorsofAgrobacteriumtumefaciensmediatedmaizetransformation.
MolecularPlantBreeding,14,228232.ZhangS,WilliamsCarrier,LemauxPG.2002.Transformationofrecalcitrantmaize
eliteinbredsusinginvitroshootmeristematicculturesinducedfromgerminatedseedlings.PlantCellReports,21,263270.
ZhangSZ,RongTZ.2008.AdvanceofAgrobateriummediatedgenetictransformationsystemofmaize(ZeamaysL.).
Hereditas,30,12491256.ZhaoZY,GuW,CaiT,TaglianiL,HondredD,BondD,SchroederS,RudertM,PierceD.2002.High
throughputgenetictransformationmediatedbyAgrobacteriumtumefaciensinmaize.MolecularBreed,8,323333.ZhongH,
SrinivasanC,SticklenMB.1992.Invitromorphogenesisofcorn(ZeamaysL.).Planta,187,483489.ZhuY.2002.
IdentificationofglyphsatetolerantPsedomonasfluorescensstrainG2fromextremlypollutedenvironmentandcloningofits
EPSPsynthasegene.MScthesis,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,China.(inChinese)
(ManagingeditorWANGNing)