BIODIVERSITAS ISSN: 1412-033X

Volume 3, Nomor 1 Januari 2002

Halaman: 169-173 DOI: 10.13057/biodiv/d030101

Identifikasi dan Karakterisasi Polimorfisme Gen Hormon Pertumbuhan

pada Sapi Bali, Sapi Madura dan Sapi Benggala
Identification and characterisation of the polymorphic growth hormone gene of
the Bali cattle, the Madura cattle and Ongole cattle

SUTARNO1, ARIS JUNAIDI2, AGUS PURWOKO1, NEO INDRA LELANA1

1 Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta 57126
2 Fakultas Kedokteran Hewan UGM Yogyakarta 55281

Diterima: 26 Nopember 2001. Disetujui: 4 Januari 2002

ABSTRACT

A total of 150 cattle consisting of 3 breeds (Bali, Madura and Ongole) of Indonesian native cattle were used in this
study. The aims of the study were to identify and characterize polymorphisms in the growth hormone loci of those
breeds of cattle. The genomic DNA was extracted using Wizard genomic DNA purification system from Promega. Two
fragments of growth hormone gene were amplified using PCR and continued with RFLP using restriction enzymes of
AluI and MspI. Polymorphisms were found at both loci of GH-L1 and GH-L2 of the growth hormone gene by PCR-
RFLP analysis in all breeds of those cattle.

2002 Jurusan Biologi FMIPA UNS Surakarta

Keywords: PCR-RFLP, growth hormone gene, polymorphism, Indonesian local cattle.

PENDAHULUAN awal yang diperlukan dalam konservasi

Diversitas genetik pada sapi, dan juga pada
hewan-hewan ternak lainnya mengalami
penurunan sangat cepat (Hall & Bradley,
1995; Hammond & Leitch, 1995). Pemilihan
suatu jenis sapi tertentu karena pertimbangan-
pertimbangan keunggulan ekonomis dalam hal
produksi telah menurunkan diversitas genetik,
dan bahkan menjadi salah satu mekanisme
utama yang sangat potensial menurunkan
diversitas genetik.
Diversitas genetik merupakan dasar
perkawinan silang bagi hewan ternak (Buis et
al, 1994) karena informasi ini dapat digunakan
sebagai titik awal untuk meningkatkan
kuantitas dan kualitas jenis melalui seleksi
buatan. Pengetahuan mengenai pola-pola
variabilitas genetik dari masing-masing jenis
akan membantu pengembangan program
persilangan, dan merupakan pengetahuan
sumber genetik (Kidd et al, 1974). Dengan
demikian maka informasi tentang diversitas
genetik dan kekerabatan genetik pada hewan
ternak termasuk sapi adalah sangat penting
dalam usaha mengembang-biakkan sapi untuk
memperoleh bibit unggul.
DNA marker, yang diperoleh dengan
menggunakan teknik deteksi berdasarkan
PCR telah banyak ditemukan, baik dari DNA
inti maupun DNA sitoplasma. Penemuan-
penemuan ini sebenarnya dimulai dari adanya
konsep diversitas genetik yang pada awalnya
hanya didasarkan pada keanekaragaman
morfologi. Dengan kemajuan di bidang
biomolekuler, maka keanekaragaman
morfologi dapat dicari langsung penyebabnya
pada level gen, materi yang bertanggung
jawab terhadap terjadinya variasi morfologi.
Namun demikian, belum semua variasi
morfologi dapat diketahui penyebabnya,
170 B IOD I VER SI TA S Vol. 3, No. 1, Januari 2002, hal. 169-173
karena tidak semua sifat yang tampak
dikodekan oleh gen tunggal. Pada umumnya
sifat yang memiliki nilai ekonomi tinggi
dikodekan oleh banyak gen, yang dikenal
dengan istilah polygenic traits, dengan
demikian tidaklah mudah untuk memperoleh
gen yang bertanggung jawab terhadap sifat
semacam ini.
Variasi DNA pada lokus gen hormon
pertumbuhan banyak dipelajari akhir-akhir ini.
Dengan kemajuan teknik molekuler, variasi
gen hormon pertumbuahan dapat dideteksi
secara lebih cepat dan akurat. Variasi pada
gen ini akan mempengaruhi produk yang
berupa hormon pertumbuhan. Pengaruh
variasi ini dapat bersifat positif dan negatif,
hormon pertumbuhan yang dihasilkan
mungkin juga dapat defektif. Banyaknya minat
untuk mempelajari variasi pada gen ini
mungkin disebabkan karena produk gen ini
sangat berpengaruh pada sifat-sifat yang
memiliki nilai ekonomi penting. Hormon
pertumbuhan mempunyai pengaruh utama
pada pertumbuhan, laktasi dan perkembangan
kelenjar susu (Cunningham, 1994; Hoj et al,
1993a).
Dari uraian di atas maka permasalahan
yang diangkat dalam penelitian awal ini
adalah: adakah variasi genetik (polimorfisme)
pada gen hormon pertumbuhan pada sapi
pedaging lokal Indonesia (sapi Madura,
Benggala dan Bali).
BAHAN DAN METODE
Sapi percobaan
Tiga jenis sapi digunakan dalam penelitian
ini, yaitu sapi Bali, sapi Madura dan sapi
Ongole (Benggala). Sampel sapi Bali diambil
dari Lombok, sampel sapi Madura diambil dari
Madura dan sapi Benggala diambil di
Surakarta.
Pengambilan sampel darah
Sampel darah diambil dari 150 individu sapi
dari masing-masing jenis tersebut di atas
secara venepuncture, menggunakan venoject.
Darah yang diperoleh dimasukkan ke dalam
50 mL tabung reaksi yang telah diisi heparin
sebagai antikoagulon. Sebanyak 10 mL darah
ini diambil dan disimpan pada suhu 70oC
untuk referensi dikemudian hari, sedangkan
sisanya digunakan langsung dalam penelitian
untuk diekstrak sel darah putihnya.
Pemisahan sel darah putih dari sampel darah
Sel darah putih diekstrak menggunakan
teknik Buffy coat. Total darah dimasukkan ke
dalam tabung sentrifus, kemudian
disentrifugasi pada kecepatan 1500 g selama
15-20 menit. Buffy coat yang diperoleh
kemudian diambil dengan pipet, dipindahkan
ke dalam tabung sentrifus 20 mL, dipenuhi
dengan larutan buffer TE1, dan disentrifugasi
lagi pada kecepatan 2000 g selama 10-15
menit. Pelet yang diperoleh kemudian
diresuspensikan dalam 1 mL bufer TE2, dan
dipindahkan ke dalam tabung penyimpan
(Nunc) untuk disimpan pada suhu 80oC
sampai saat digunakan untuk proses
selanjutnya.
Ekstraksi DNA
DNA diekstraksi dari sel darah putih
dengan menggunakan teknik Wizard Genomic
Purification System (Promega, Madison USA).
Amplifikasi gen hormon pertumbuhan
DNA yang diperoleh langsung digunakan
untuk reaksi PCR yang dilakukan dalam mesin
PCR (Perkin Elmer 2400/ 9700). Dua fragmen
gen hormon pertumbuhan, lokus 1 dan lokus 2
diamplifikasi dengan PCR menggunakan
primer berturut-turut GH1/GH2 dan GH5/GH6.
Semua reaksi amplifikasi dilakukan dalam
volume 25 L campuran reaksi yang terdiri
dari: 200 ng DNA template, 0.15 M dari
masing-masing oligonukleotida primer, 200
M dari masing-masing dNTPs, 2 mM MgCl2,
10x bufer dan 1,5 unit Taq DNA polymerase
dalam 0,6 mL tabung effendorf.
Kondisi reaksi amplifikasi PCR untuk gen
hormon pertumbuhan adalah sebagai berikut:
satu tahap reaksi denaturasi awal pada suhu
94oC selama 5 menit, diikuti dengan 30 siklus
amplifikasi yang masing-masing siklus terdiri
dari: denaturasi pada suhu 94oC selama 45
detik, annealing pada suhu 60oC selama 45
detik, dan ekstensi pada suhu 72oC selama 1
menit; diikuti dengan satu tahap polimerasi
final pada suhu 72oC selama 5 menit.
RFLP analisis
Hasil amplifikasi PCR digunakan dalam
reaksi digesti dengan menggunakan enzim
AluI untuk mengidentifikasi situs polimorfisme
AluI pada lokus 1, sedangkan lokus 2 didigesti
menggunakan enzim MspI. Hasil digesti
kemudian dielektroforesis pada bak
elektroforesis horizontal dengan mengguna-
 SUTARNO dkk. Polimorfisme Gen Hormon Pertumbuhan Sapi Lokal
kan gel yang terbuat dari 1-2% agarose dalam
bufer TAE. Elektroforesis dilakukan dengan
menggunakan gel horisontal selama 90 menit
pada 55 volt. Lama waktu sangat tergantung
pada konsentrasi gel dan voltase. Agar hasil
elektroforesis dapat divisualisasi, ethidium
bromida disertakan pada saat pembuatan gel
dengan konsentrasi final 0,12 g/mL. Setelah
elektroforesis selesai, DNA divisualisasi di
bawah sinar ultra violet dalam ruang gelap,
dan diambil gambarnya menggunakan film
Polaroid ukuran 57 dengan filter merah.
Pengambilan data fenotip
Data fenotip utama yang dikoleksi pada
penelitian ini adalah berat badan (berat lahir;
berat awal), berat pada hari ke-90 (dan berat
pada hari ke-150 dan ke-210 untuk sapi Bali),
sedangkan data fenotip pendukung adalah
jenis kelamin, umur dan breed.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Hasil analisis PCR
Lima puluh sampel dari masing-masing
jenis sapi Bali, sapi Madura dan sapi Benggala
telah dilakukan PCR untuk mengamplifikasi
DNA menggunakan primer GH-1, GH-2, GH-5,
dan GH-6. Fragmen yang diamplifikasi dengan
primer-primer tersebut adalah dua lokus DNA
pada gen hormon pertumbuhan. Amplifikasi
menggunakan GH-1 dan GH-2 menghasilkan
fragmen 223 bp lokus 1 gen hormon
pertumbuhan, sedangkan amplifikasi
menggunakan GH5 dan GH6 menghasilkan
fragmen 329 bp lokus 2 gen hormon
pertumbuhan.
Hasil RFLP
Analisis pola pemotongan oleh enzim
restriksi terhadap hasil amplifikasi PCR pada
lokus 1 dan lokus 2 gen hormon pertumbuhan
dilakukan terhadap 3 jenis sapi pedaging lokal
Indonesia. Pada semua jenis ditemukan
adanya polimorfisme DNA pada kedua lokus
gen hormon pertumbuhan. Polimorfisme yang
dideteksi dengan melakukan digesti
menggunakan enzim restriksi AluI terhadap
fragmen 223 bp lokus 1, serta dengan digesti
menggunakan enzim restriksi MspI terhadap
fragmen 329 bp lokus 2 gen hormon
pertumbuhan disajikan pada Gambar 2 dan 3.
Situs-situs restriksi yang dihasilkan dari
reaksi digesti dengan menggunakan enzim
171
restriksi AluI dan MspI terhadap lokus 1 dan
lokus 2 gen hormon pertumbuhan
dipresentasikan pada Table 1.
Tabel 1. Situs restriksi yang dihasilkan dari reaksi digesti
dengan menggunakan enzim restriksi AluI terhadap
fragmen 223 bp lokus 1 gen hormon pertumbuhan, dan
MspI terhadap fragmen 329 bp lokus 2 gen hormon
pertumbuhan.
Enzyme Allel JumLah Ukuran
situs fragmen (bp)
restriksi
AluI L 1 171, 52
V 0 223
MspI MspI + 1 224, 105
MspI - 0 329
Seperti yang diperlihatkan pada hasil di
atas, perkembangan-perkembangan yang
terjadi pada teknik molekuler telah
menghasilkan banyak data tentang variasi
genetik dari analisis DNA. Data-data semacam
ini akan memberikan pemahaman yang lebih
baik pada kita tentang variasi genetik inter dan
antar jenis sapi. Analisis dengan PCR-RFLP
mampu mendeteksi tipe polimorfisme yang
sama seperti yang diperoleh dengan
menggunakan teknik RFLP secara tradisional,
tanpa melalui Southern Blotting (Cushwa &
Medrano, 1996). Karena tanpa Southern
Blotting, maka waktu yang diperlukan lebih
pendek dan sensitivitasnya pun meningkat
(Weber & May, 1989). Jadi metode ini sangat
efektif dan efisien untuk mempelajari variasi
genetik.
Variasi genetik pada jenis yang sama
adalah sangat penting dan riset di bidang ini
banyak menarik perhatian pada jenis hewan
ternak, karena pengetahuan tentang variasi
genetik mempunyai banyak aplikasi pada
penyilangan dan genetika. Aplikasi variasi
genetik ini oleh Archibald (1983) disebutkan
misalnya untuk identifikasi hewan dan analisis
pedigree (silsilah), pemetaan gen dan
identifikasi marker/penanda gen yang
mengendalikan sifat-sifat yang diinginkan.
Karena semua sifat yang tampak (fenotip)
dipengaruhi oleh informasi genetik yang
dibawa oleh DNA, maka variasi DNA
berhubungan dengan terjadinya variasi
fenotip. Ide inilah yang merupakan dasar
teknik seleksi yang akhir-akhir ini
dikembangkan, yaitu seleksi berdasarkan gen
marker yang dikenal dengan istilah marker
172 B IOD I VER SI TA S Vol. 3, No. 1, Januari 2002, hal. 169-173

100bp marker
Un-cut

V/V

L/V
L/L
600bp

223bp
171bp
100bp
52bp

Gambar 2. Fotograf dari gel agarose memperlihatkan adanya polimorfisme DNA pada lokus 1 gen hormon
pertumbuhan yang dideteksi dengan menggunakan teknik PCR-RFLP menggunakan enzim AluI.

100bp marker
MspI +/+

MspI +/+
MspI +/-
MspI -/-
Un-cut

329bp 600bp

224bp
100bp
105bp

Gambar 3. Fotograf dari gel agarose memperlihatkan adanya polimorfisme DNA pada lokus 2 gen hormon
pertumbuhan yang dideteksi dengan menggunakan teknik PCR-RFLP menggunakan enzim MspI.

assisted selection (MAS). Teknik seleksi
melalui MAS ini telah berkembang sangat
cepat pada beberapa tahun terakhir (Schwerin
et al, 1995; Soller, 1994). Variasi genetik yang
diukur langsung pada level DNA, dapat juga
digunakan untuk melakukan test terhadap
munculnya variasi genetik pada sifat kuantitatif
pada suatu jenis. Hal ini sangat bermanfaat
dalam menjaga diversitas genetik.
Polimorfisme pada situs restriksi oleh enzim
AluI dan MspI pada lokus 1 dan lokus 2 gen
hormon pertumbuhan telah dilaporkan
sebelumnya pada sapi penghasil susu (Hoj et
al, 1993; Lucy et al, 1993; Schwerin et al,
1995; Soller, 1994), Bavarian Simmental
(Schlee et al, 1994) dan sapi India (Mitra et al,
1995). Analisis menggunakan PCR-RFLP di
atas menunjukkan bahwa terjadinya polimor-
 SUTARNO dkk. Polimorfisme Gen Hormon Pertumbuhan Sapi Lokal
fisme pada situs restriksi oleh enzim restriksi
AluI disebabkan oleh adanya substitusi antara
Leusin/Valin pada posisi 127 (Sutarno, 1998).
Sedangkan terjadinya polimorfisme pada situs
restriksi oleh enzim restriksi MspI disebabkan
oleh adanya transisi C menjadi T pada posisi
+837 (Sutarno, 1998).
KESIMPULAN
Dari hasil-hasil di atas dapat disimpulkan
bahwa polimorfisme ditemukan pada sapi Bali
dan sapi Benggala, serta pada sapi Madura
namun dengan prosentase yang rendah.
Perubahan leusin menjadi valin posisi 127
pada lokus 1 gen hormon pertumbuhan yang
dideteksi dengan RFLP menggunakan enzim
restriksi AluI, serta polimorfisme pada lokus 2
yang dideteksi dengan RFLP menggunakan
MspI ditemukan pada ketiga jenis sapi ini.
DAFTAR PUSTAKA
Archibald, A. L. 1983. Genetic variation-the raw material
of animal breeding. ABRO Report 28-32
Buis, R. C., J. K. Oldenbroek, and J.H.J. Vanderwerf.
1994. Preserving genetic variance resources in
commercial and non-commercial populations.
Netherlands Journal of Agricultural Science 42: 29-36
Cunningham, E.P. 1994. The use of bovine somatotropin
in milk production - a review. Irish Veterinary Journal
45 (5) 207-210.
Cushwa, W. T., and J.F. Medrano. 1996. Applications of
the Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)
Assay for Genetic Analysis of Livestock Species.
Animal Biotechnology 7: 11-31
Hall, S. J. G., and D.G. Bradley. 1995. Conserving
livestock breed biodiversity [Review]. Trends in
Ecology & Evolution 10: 267-270
173
Hammond, K., and H. Leitch. 1995. Towards better
management of animal genetic resources. World
Animal Review 84/85: 48-53
Hoj, S., M. Fredholm, N.J. Larsen, and V.H. Nielsen.
1993. Growth hormone gene polymorphism
associated with selection for milk fat production in
lines of cattle. Animal Genetics 24: 91-96
Kidd, K. K., L. Osterhoff, L. Erhard, and W.H. Stone.
1974. The use of genetic relationships among cattle
breeds in the formulation of rational breeding
policies: an example with South Devon (South
Africa) and Gelbvieh (Germany). Animal Blood
Groups and Biochemical Genetics 4: 21-28
Lucy, M. C., S.D. Hauser, P.J. Eppard, G.G. Krivi, and
J.H. Clark. 1993. Variants of somatotropin in cattle -
gene frequencies in major dairy breeds and
associated milk production. Domestic Animal
Endocrinology 10: 325-333
Mitra, A., P.P. Schlee, C.R. Balakrishnan, and F.
Pirchner. 1995. Polymorphisms at growth-hormone
and prolactin loci in Indian cattle and buffalo. Journal
of Animal Breeding & Genetics Zeitschrift fur
Tierzuchtung und Zuchtungsbiologie 112: 71-74
Schlee, P., R. Gram, L.O. Rottmann, and F. Pirchner.
1994. Influence of growth-hormone genotypes on
breeding values of simmental bulls. Journal of Animal
Breeding & Genetics Zeitschrift fur Tierzuchtung und
Zuchtungsbiologie 111: 253-256
Schwerin, M., G. Brockmann, J. Vanselow, and H.M.
Seyfert. 1995. Perspectives of molecular genome
analysis in livestock improvement. Archiv fur
Tierzucht Archives of Animal Breeding 38: 21-31
Soller, M. 1994. Marker assisted selection - an overview.
Animal Biotechnology 5: 193-207
Sutarno. 1998. Candidate gene marker for production
traits in beef cattle. In Veterinary Biology. Perth:
Murdoch University.
Weber, J. L., and P.E. May. 1989. Abundant class of
human DNA polymorphisms which can be typed
using the polymerase chain reaction. American
Journal of Human Genetics 44: 388-396.