LAPORAN PRAKTIKUM

KROMATOGRAFI
ISOLASI PIGMEN TANAMAN DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM

Dosen Pengampu :
FITRIA SUSILOWATI S.Pd, M.Sc

Disusun Oleh :
INDIANA GITA ANGGRAENI
36.2015.7.1.11.21

PRODI FARMASI
FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS DARUSSALAM GONTOR
2017
 KEGIATAN 3
ISOLASI PIGMEN TANAMAN DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM

I. TUJUAN
1. Melakukan isolasi pigmen tanaman dengan kromatografi kolom.
2. Memonitoring fraksi kolom dengan kromatografi lapis tipis.

II. DASAR TEORI

Kromatografi kolom adalah suatu teknik pemurnian untuk mengisolasi komponen yang
diinginkan dai sutu campuran. Dalam kromatografi kolom, fase diam (adsorben padat)
ditempatkan secara vertikal dalam kolom gelas dan fase gerak (cairan) ditempatkan pada
bagian atas kolom dan begerak ke bawah melewati kolom (karena gravitasi atau tekanan
eksternal). Sampel yang akan dianalisis dimsukkan ke bagian atas kolom. Eluen
ditambahkan ke dalam kolom dan bergerak ke bawah melewtikolom. Keseimbangan
terjadi antara komponen yang teradsopsi pda adorben dengan pelarut yang terelusi
mengalir melewati kolom. (Basset, 1994).

Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipsahkan diletakkan berupa pita pada
bagian atas kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau bahkan
tabung plastik. Kolom kromatografi atau tabung untuk pengaliran karena gaya tarik bumi
(gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca yang dilengkapi keran
jenis tertentu pada bagian bawahnya untuk mengatur aliran pelarut (Gritter, 1991).

Dalam kromatografi partisi cair-cair, suatu pemisahan dipengaruhi oleh distribusi sampel
antara fase cair diam dan fase cair bergerak dengan membatasi kemampuan
pencampuran. Jika suatu zat terlarut dikocok dalam sistem dua pelarut yang tidak
bercampur atau saling melarutkan maka zat terlarut akan terdistribusi di antara kedua fase
(Khopkar, 2008).

Klasifikasi Kromatografi Kolom berdasarkan interaksi komponen dengan adsorben adalah :

a. Kromatografi adsorbsia dalah kromatografi yang adsorbsi, komponen yang dipisahkan
secara selektif teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk bahan isian
kolom.
b. Kromatografi partisi, dalam kromtografi partisi, komponen yang dipisahkan secara
selektif mengalami partisi antara lapisan cairan tipis pada penyangga padat yang bertindak
sebagai fase diam dn eluen yang bertindak sebagai fase gerak.
c. Kromatografi petukran ion memishkan komponen yang berbentuk ion, komponen-
komponen tersebut yang terikat pda penukar ion sebagai fase diam secara selektif akan
terlepas/terelusi oleh fase gerak.
 d. Komatogrfi filtrasi gel, dalam kromatografi filtrasi gel, kolom diisi dengan gel yang
permeabel sebagai fase diam. Pemisahan berlangsung seperti proses pengayakan yang
didasarkan atas ukuran molekul dari komponen yang dipisahkan (Khopkar, 2000).

Menurut Alimin (2007, hal: 75) keuntungan pemisahan dengan metode kromatografi
adalah :
a. Dapat digunakan untuk sampel atau konstituen yang sangat kecil.
b. Cukup selektif terutama untuk senyawa-senyawa organik multi komponen.
c. Proses pemisahan dalam dilakukan dalam waktu yang relatif singkat.
d. Seringkali murah dan sederhana karena umumnya tidak memerlukan alat yang
mahal dan rumit.

III. ALAT DAN BAHAN

A. Alat
1. Kolom 1 buah
2. Klem dan statif 1 buah
3. Corong pisah 1 buah
4. Corong 1 buah
5. Botol vial 9 buah
6. Gelas beaker 4 buah
7. Mortar dan pestle 1 buah
8. Pipet tetes standar 4 buah
9. Pipet plastik 7 buah
10. Gelas ukur 5 mL 4 buah
11. Masker secukupnya
12. Pinset 1 buah
13. Sarung tangan secukupnya
14. Gelas ukur 25 mL 3 buah
15. Spatula 2 buah
16. Erlenmeyer 50 mL 1 buah

B. Bahan
1. Silika gel
2. Daun Bayam (Amarantus spinosus)
3. Kertas saring whatman
4. Plat KLT silica gel GF254
5. Solven PA aseton, n-heksan, methanol
6. Na2SO4 anhidrat
7. Kapas
8. Alumunium foil dan plastic wrap
IV. PROSEDUR KERJA
Penyiapan kolom

Timbang silica gel 3 gram

Tambahkan n-hexan secukupnya

Masukkan kapas ke dalam kolom

Masukkan campuran silica gel dan n-hexan kedalam kolom

Penyiapan ekstraksi sampel

Haluskan bayam dan tambahkan aseton 5 mL

Siapkan corong yang dilapisi kertas saring

Masukkan anhidrat kedalam kertas saring

Basahi kertas saring menggunakan aseton

Corong pisah

Masukkan aquades 5 mL, n-hexan 5 mL, dan ekstrak sampel 5 mL

kedalam corong pisah

Kocok kearah dalam dan diamkan

 Tunggu sampai terjadi pemisahan

Pisahkan pelarut dan ekstrak sampel, lalu masukkan ekstrak sampel

kedalam vial

Persiapan elusi

Siapkan eluen n-hexan 5 mL ; n-hexan:aseton (7:3) diambil 5 mL ;

aseton 5 mL ; aseton:methanol (8:2) diambil 5 mL ; methanol 5 mL

Masukkan ekstrak sampel kedalam kolom

Masukkan eluen satu per satu sesuai urutan sedikit demi sedikit

V. DATA PENGAMATAN
VI. PEMBAHASAN
Kromatografi kolom adalah metode yang digunakan untuk memurnikan bahan kimia
tunggal dari campurannya. Metode ini sering digunakan untuk aplikasi preparasi pada skala
mikrogram hingga kilogram. Keuntungan utama kromatografi kolom adalah biaya yang
rendah dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparative, menentukan jumlah
komponen campuran, dan memisahkan dan purifikasi substansi.
Kerugian kromatografi kolom yaitu untuk mempersiapkan kolom dibutuhkan kemampuan
teknik dan manual, metode ini sangat membutuhkan waktu yang lama Prinsip
kromatografi secara umum adalah pemanfaatan beda waktu tiap komponen yang
dikandung sampel sewaktu berada pada fasa stasioner.
Jenis tumbuhan yang diekstraksi pada percobaan ini yakni daun bayam. Dalam proses
ekstraksi pigmen digunakan daun bayam yang akan diekstraksi pigmennya. Untuk
mengekstrak pigmen dalam daun bayam hanya digunakan daunnya saja sementara tulang
daunnya tidak digunakan karena pada pigmen tumbuhan umumnya terkandung pada
daunnya. Daun bayam yang telah ditimbang kemudian ditambahkan aseton dan
dilumatkan hingga halus. Penambahan aseton berfungsi untuk melarutkan pigmen yang
terkandung dalam daun bayam, mengingat aseton merupakan pelarut non polar sehingga
dapat dengan mudah melarutkan pigmen daun.

Ekstrak yang telah diperoleh lalu disaring menggunakan corong gelas yang ujungnya diberi
kapas dan diisi dengan Na2SO4 anhidrat untuk memisahkan hasil ekstrak pigmen dengan
ampas daunnya. Adanya Na2SO4 anhidrat berfungsi untuk mengikat kandungan air yang
terdapat dalam ekstrak pigmen karena sifat dari NaSO anhidrat yang higroskopis,
sehingga diharapkan ekstrak pigmen tidak mengandung air.

Pada percobaan ini ekstrak pigmen aseton yang telah diperoleh di awal ditambahkan
dengan n-heksana dan akuades. Penambahan ini menyebabkan pigmen terdistribusi dalam
dua fasa, yakni fasa organik dan fasa air. Pigmen akan lebih terdistribusi ke fasa organik
karena kesamaan sifat kepolarannya (non polar). Saat larutan dikocok akan membentuk
dua lapisan yang tidak saling bercampur karena adanya perbedaan berat jenis antara
keduanya (berat jenis n-heksana lebih ringan daripada air). Dikarenakan yang akan
dianalisis adalah pigmen, maka yang diambil yakni fasa organiknya (lapisan atas).

Proses elusi pada kromatografi kolom dilakukan dengan mengelusikan larutan n-heksana
(sifatnya paling non polar) terlebih dahulu untuk mengondisikan kolom yang akan diisi
ekstrak pigmen (non polar). Setelah ekstrak pigmen dimasukkan ke dalam kolom,
kemudian diikuti mengelusikan n-heksana, n- heksana/aseton (70/30), aseton,
aseton/metanol (80/20), dan metanol. Urutan elusi ini berdasarkan sifat kepolarannya, di
mana n-heksana bersifat paling non polar, sedangkan metanol yang paling polar.

Saat setiap eluen mulai dimasukkan, maka senyawa dalam ekstrak pigmen tadi akan
melakukan migrasi, terbawa oleh eluen sesuai dengan sifat kepolarannya. Setiap senyawa
dalam komponen mempunyai kecepatan yang berbeda dalam melewati kolom. Selama
proses berlangsung akan diperoleh beberapa fraksi. Jika menurut urutan eluen yang
dimasukkan dalam kolom, maka diperkirakan fraksi awal yang keluar akan memiliki sifat
kepolaran yang paling rendah, sedangkan fraksi akhir yang keluar memiliki sifat kepolaran
yang paling tinggi.

Sesuai dengan hasil pengamatan, pigmen warna terbagi dalam 9 vial berupa dan empat
warna inti yaitu bening, coklat, kuning, dan hijau. Dari warna yang didapat maka dapat
dianalisa bahwa daun bayam mengandung karoten, xantofil, serta klorofil, yang
kestabilannya tahan pada panas. Kandungan besi pada bayam relatif lebih tinggi daripada
sayuran lain (besi merupakan penyusun sitokrom, protein yang terlibat dalam proses
fotosintesis) sehingga berguna bagi penderita anemia. Daun bayam mempunyai
kandungan klorofil yang tinggi, sehingga laju fotosintesisnya juga tinggi.
 Ada dua jenis klorofil yaitu klorofil a dan klorofil b, yang membedakan adalah adanya gugus
aldehid pada struktur klorofil b. Karoten adalah senyawa alkena dengan rantai panjang dari
sistem ikatan rangkap terkonjugasi. Daun hijau mengandung sekitar 90% beta karoten dan
10% alpha karoten. Xantofil adalah bentuk karoten yang terhidroksilasi, kandungan xantofil
dalam daun hijau selalu dua kali lebih besar dari karoten.

Pada percobaan kromatografi kolom ini kami mengalami sebuah kesalahan ditahap
pemisahan pigmen dari tumbuhan, dimana ekstrak sampel pada kolom mengalami
peretakan sehingga pemisahan warna kurang maksimal. Untuk menanggapi hal tersebut
maka sampel kolom harus didinginkan dengan cara membasahi tissu dengan metanol dan
membalutkannya pada kolom.

VII. KESIMPULAN
1. Penambahan Na2SO4 anhidrat berfungsi untuk mengikat kandungan air yang
terdapat dalam ekstrak pigmen karena sifat Na2SO4 yang higroskopis dan
diharapkan ekstrak pigmen tidak mengandung air.
2. Proses elusi berawal dari n-hexan lalu diikuti n-hexan: aseton (7:3) ; aseton 5 mL ;
aseton:methanol (8:2) ; methanol yang berdasarkan sifat kepolaran, dimana n-hexan
bersifat paling nonpolar dan methanol paling polar.
3. Daun bayam mempunyai kandungan klorofil yang tinggi yaitu klorofil a dan klorofil b,
karoten dengan 90% beta karoten dan 10% alpha karoten serta xatofil.

DAFTAR PUSTAKA
Alimin, dkk. 2007. Kimia Analitik. Makassar: Alauddin Press.
Basset, J. 1994. Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif Anorganik. Penerbit Buku Kedokteran
EGC. Jakarta.
Gritter, R. J. 1991. Pengantar Kromatografi. ITB. Bandung.
Khopkar, S.M. 2000. Konsep Dasar Kimia Analitik. UI-Press. Jakarta
Khopkar, S.M. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Jakarta: Erlangga,