(Tugas 4)

KIMIA ANALITIK II
REVIEW JURNAL ASSESSMENT OF DENSITY
GRADIENT CENTRIFUGATION (DGC) AND
SPERMCHROMATIN DISPERSION (SCD)
MEASUREMENTS IN COUPLES WITH MALE
FACTOR INFERTILITY UNDERGOING ICSI

NAMA : IJA NURJANNAH (4131131023)

KELAS : KIMIA DIK A 2013

JURUSAN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU
PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS NEGERI MEDAN
2015
PENDAHULUAN
Faktor infertilitas pria merupakan penyebab umum dari ketidaksuburan, dengan cacat sperma
yang ditemukan pada 40-50% kasus ketidaksuburan. Injeksi sperma intracytoplasmic (ICSI)
adalah pengobatan yang efisien untuk faktor infertilitas pria dengan kualitas sperma yang
buruk dan mereka yang telah gagal konvensi nasional fertilisasi in vitro (IVF) siklus.
Pemilihan spermatozoon yang akan digunakan untuk ICSI didasarkan pada penghakiman
embriologi, yang memilih spermatozoa motil dengan morfologi terbaik yang tersedia. Namun,
yang dipilih spermatozoa mungkin memiliki DNA yang rusak. Avendano et al. kembali
porting bahwa sperma pria infertil dapat morfologi yang normal sesuai dengan kriteria yang
ketat tetapi tetap menunjukkan DNA fragmentasi. Fragmentasi DNA sperma telah Asso
diasosiasikan dengan infertilitas pria. ICSI menggunakan spermatozoa dengan DNA yang
rusak dapat menyebabkan perkembangan embrio miskin atau transmisi bahan genetik yang
rusak kepada keturunannya. Karena integritas DNA sperma sangat penting bagi kedua
Evaluasi dan pengobatan infertilitas pria, berbagai tes telah dikembangkan untuk \menilai itu.
Salah satu tes ini adalah kromatin sperma dispersi (SCD) assay. Tes ini didasarkan pada
prinsip bahwa sperma dengan DNA terfragmentasi gagal untuk menghasilkan halo
karakteristik loop DNA tersebar yang diamati disajikan berikut denaturasi asam dan
penghapusan nuklir protein dari sperma dengan DNA nonfragmented. Asli- ly, mikroskop
fluoresensi digunakan dalam tes SCD ke menentukan sperma fragmentasi DNA; Namun,
baru-baru ini modifikasi diperbolehkan untuk penggunaan mikroskop terang-bidang. Hasil
SCD berkorelasi dengan baik dengan yang diperoleh dengan lainnya tes fragmentasi, seperti
struktural kromatin sperma ture assay (SCSA) dan terminal transferase-dimediasi DNA end-
label (TUNEL). Tidak semua laboratorium memiliki akses ke aliran cytometer atau keahlian
teknis dibutuhkan untuk melakukan uji SCSA. The TUNEL dan Tes SCD sederhana, lebih
murah, dan prosedur dapat dilakukan dalam waktu singkat. Namun, terang-uji lapangan SCD
mikroskop tampaknya lebih sensitif daripada TUNEL assay. Karena rendah biaya, kecepatan,
dan kehandalan, SCD merupakan metode menarik untuk penilaian integritas DNA. Gradien
densitas sentrifugasi (DGC) yang digunakan di sebagian besar IVF pusat untuk mencuci air
mani baku ICSI. Hal ini penting untuk Teknik pengolahan sperma untuk memilih sedangkan
sperma fungsional menyebabkan mereka kerusakan minimal. Efek dari DGC pada sperma
Integritas DNA yang kontroversial, dengan beberapa penelitian yang menunjukkan integritas
nuklir sperma meningkat, seperti yang dievaluasi oleh berbagai tes integritas DNA. Kedua
studi, yang termasuk 50 dan 234 kasus ICSI, masing-masing, dievaluasi DNA fragmentasi
tion suspensi sperma setelah DGC oleh assay TUNEL. Namun, Bungum et al. melaporkan
bahwa SCSA yang dilakukan pada air mani disiapkan oleh DGC tidak bisa memprediksi
hasilnya teknologi reproduksi yang dibantu (ART). Studi mereka termasuk 510 siklus ART,
yaitu, 197 IUI, 220 IVF, dan 93 ICSI siklus. Simon et al. melaporkan bahwa fragmen DNA
pemikiran bisa memprediksi hasil ART terkait dengan IVF tapi tidak ICSI. Mengkonversi
basis dimodifikasi menjadi lebih Untai DNA istirahat meningkatkan sensitivitas tes,
menghasilkan korelasi negatif antara fragmentasi DNA dan clin- kehamilan ical pada individu
menjalani ICSI atau IVF. Di Penelitian, fragmentasi DNA mereka di 360 pasangan (230 IVF
dan 130 ICSI) diukur dengan menggunakan tes Komet basa di air mani dan sperma berikut
DGC. Masih belum jelas apakah mengukur integritas kromatin sperma setelah DGC di
Pasien ICSI telah keunggulan dibandingkan pengukuran dilakukan pada sampel semen
mentah. Selain itu, penelitian sebelumnya melakukan tidak menggunakan assay SCD untuk
mengevaluasi integritas DNA sperma setelah DGC. Penelitian ini meneliti kemampuan DGC
untuk meningkatkan integritas nuklir sperma dan nilai pengukuran SCD integritas nuklir
sperma, baik asli dan DGC-diproses semen, dalam memprediksi hasil kehamilan pada
pasangan partisipasi pating dalam program ICSI.

METODE
Pengumpulan dan analisis
Sampel air mani dikumpulkan oleh masturbasi setelah 3-7 hari pantang seksual, pada hari
ovum pick-up. Setelah mencairkan air mani pada 37 C dalam 5% CO 2 di udara selama 20
menit, sampel diperiksa untuk konsentrasi dan motilitas sesuai dengan pedoman WHO
(WHO, 2010) dalam Makler chamber (Sefi Laboratories, Tel Aviv, Israel). Sperma morphol-
ogy tidak dinilai, karena tidak secara rutin dilakukan di pusat IVF kami. Gradien densitas
sentrifugasi Sperma disiapkan oleh standar DGC menggunakan 50 dan 90% Mengisolasi
(Irvine Ilmiah, Santa Ana, CA, USA). Maksimal dari 2 ml semen berlapis di atas dua lapisan
Mengisolasi (50 dan 90%), dan sampel disentrifugasi pada 360 g selama 20 menit. Pelet itu
kemudian dicuci dalam IVF-100TM (Vitrolife, Gothenburg, Swedia) dan disentrifugasi pada
360 g. Itu pengenceran akhir sampel dalam IVF-100TM (Vitrolife, Gothenburg, Swedia), dan
spermatozoa diinkubasi dalam 5% CO2 di udara pada 37 C sampai inseminasi. Tes SCD
Fragmentasi DNA diukur dengan tes SCD, menggunakan SpermFunc TM DNAf kit
(dibesarkan Life Science, Shenzhen, China), baik untuk air mani asli dan DGC dipisahkan.
Gel aliquot rendah titik lebur agarosa dalam tabung Eppendorf disediakan dalam kit untuk
pengolahan sampel air mani. Tabung Eppendorf ditempatkan dalam bak air pada 80 C untuk
20 menit untuk mencairkan agarosa dan kemudian dipindahkan ke bak air pada 37 C selama
5 menit untuk suhu equilibrium. Sebanyak 60 uL sampel air mani ditambahkan ke agarosa
dalam Eppendorf tabung dan dicampur. Kemudian, 30 uL air mani-agarosa Campuran ini
dipipet ke slide precoated yang disediakan sedikit dan tertutup dengan 22 22 mm coverslip.
Slide ditempatkan di piring dingin dalam kulkas (4 C) selama 5 menit untuk memungkinkan
agarosa untuk menghasilkan microgel di mana sperma sel tertanam. Para coverslips yang
lembut dihapus, dan slide segera tenggelam horizontal di Solusi A dan diinkubasi selama 7
menit. Selanjutnya, slide yang horizontal direndam dalam larutan B selama 25 menit. Setelah
mencuci selama 5 menit di sebuah nampan dengan air suling berlimpah, slide yang dehidrasi
dalam meningkatkan konsentrasi etanol (70- 90-100%) selama 2 menit masing-masing, udara
kering, dan disimpan di ruang Suhu di buram ditutup kotak. Untuk mikroskop terang-
lapangan, slide yang horizontal-perjanjian ered dengan campuran larutan pewarnaan Wright
(Bred Hidup Sains, Shenzhen, Cina) dan larutan buffer fosfat (Dibesarkan Life Science,
Shenzhen, Cina) (1: 2) selama 15 menit dengan aliran udara yang terus-menerus. Kemudian,
slide dicuci dalam menjalankan air selama 10 s dan dibiarkan kering. Pewarnaan yang kuat
lebih disukai untuk memungkinkan pinggiran tersebar lingkaran DNA lingkaran cahaya
menjadi terlihat lebih mudah. Minimal 500 spermatozoa per sampel diberi skor di bawah 100
tujuan. Lima pola SCD ditetapkan: (1) sel sperma dengan halos besar, lebar yang sama atau
lebih besar dari diameter kecil dari inti; (2) sel sperma dengan menengah halos, ukuran yang
antara yang besar dan sangat kecil halus; (3) sel sperma dengan lingkaran cahaya yang sangat
kecil, lebar yang mirip dengan atau lebih kecil dari 1/3 diameter kecil inti; (4) sel sperma
tanpa halo; dan (5) sel sperma tanpa halo dan terdegradasi. Inti dengan besar-to- ukuran
medium halo dianggap sperma dengan nonfragmented DNA, sedangkan inti dengan ukuran
kecil halo atau tanpa halo atau tanpa halo dan terdegradasi dianggap sperma dengan DNA
terfragmentasi. Akhirnya, nukleotida yang tidak sesuai dengan sel sperma diberi skor secara
terpisah. DNA sperma fragmentasi dinyatakan sebagai persentase sel sperma dengan DNA
terfragmentasi.
Stimulasi ovarium dan teknik ICSI Untuk stimulasi ovarium, baik agonis GnRH dan
antagonis protokol yang digunakan. Secara singkat, agonis GnRH protokol panjang
digunakan seperti yang dijelaskan sebelumnya [ 24 ], Dan cetrorelix (Cetrotide; Merk-
Serone, Jerman) diberikan dalam protokol antagonis. Teknik ICSI telah digambarkan yang
sebelumnya. Sperma untuk ICSI yang dipilih berdasarkan kriteria untuk sperma morfologi
normal (WHO, 2010). Setidaknya 3 oosit metafase II yang diambil dalam siklus ICSI di kami
studi. Tingkat fertilisasi Pada 16-18 jam setelah mikroinjeksi, oosit dinilai untuk menentukan
apakah telah terjadi pembuahan. Pemupukan adalah Hasil tes SCD dalam kasus
oligozoospermia berat. Sperma (A) menunjukkan inti dengan ukuran besar halo dan (b)
menunjukkan inti dengan ukuran medium halo yang dianggap dengan DNA nonfragmented,
sebagaimana (c) menunjukkan inti dengan ukuran kecil halo, (d) menunjukkan tanpa halo, (e)
menunjukkan tanpa halo dan terdegradasi, dan (f) menunjukkan tanpa halo dan peniti, yang
dianggap sperma dengan DNA terfragmentasi dianggap normal jika dua pronukleus dan dua
badan kutub diidentifikasi. Oosit tanpa pronukleus terlihat dianggap dibuahi. Oosit dengan
pronukleus tunggal atau dengan lebih dari dua pronukleus dianggap abnormal fertil- ized dan
dibuang. Transfer embrio segar yang per- terbentuk pada 48 atau 72 jam setelah pengambilan
oosit.

HASIL
Pengaruh DGC pada fragmentasi DNA sperma dan sperma karakteristik Untuk menganalisis
pengaruh DGC pada sperma fragmentasi DNA dan karakteristik sperma, 63 pasien dibagi ke
dalam kelompok berikut: asthenospermia (n = 32), oligozoospermia (N = 11),
oligozoospermia berat (n = 17), dan tak terduga Kegagalan fertilisasi lengkap dalam upaya
IVF sebelumnya (n = 3). Parameter air mani pada pasien ini, kecuali 3 pasien dengan
kegagalan fertilisasi lengkap tak terduga dalam IVF sebelumnya upaya. Motilitas progresif
oligozoospermia berat tidak diperiksa. Tidak ada perbedaan yang signifikan antara tiga
kelompok yang berkaitan usia laki-laki (P = 0,084; ANOVA satu arah). Ada sig- sebuah
Penurunan nifikan dalam konsentrasi sperma asli dibandingkan sampel DGC-diproses dari
asthenospermia yang (P <0,01; berpasangan-sampel t-test) dan oligozoospermia (P
<0,05;berpasangan-sampel t-test) kelompok, tapi tidak parah Kelompok oligozoospermia (P>
0,05; berpasangan-sampel t-test). Di sana juga peningkatan yang sangat signifikan dalam
motilitas progresif di asthenospermia yang (P <0,01; berpasangan-sampel t-test) dan
oligozoospermia (P <0,01; berpasangan-sampel t-test) kelompok. Mayoritas sampel
menunjukkan peningkatan sperma DFI berikut DGC, sedangkan DFI sperma meningkat
setelah persiapan hanya 6 (5 dari oligozoospermia berat kelompok dan 1 dari kelompok
asthenospermia) dari 60 sampel. Pada kelompok asthenospermia, DFI sperma berikut DGC
menurun dari 31,5 19,7-19,2 18,3 (P <0,01; paired- sampel t-test). Pada kelompok
oligozoospermia, DFI sperma.Berikut DGC menurun dari 28,5 10,3-16,0 12,8 (P <0,01;
berpasangan-sampel t-test.

KESIMPULAN
Sebagai kesimpulan, kami menunjukkan, untuk pertama kalinya, bahwa DGC bisa sangat
signifikan mengurangi fragmentasi DNA sperma di air mani pasien ICSI, sebagaimana dinilai
oleh SCD, dengan kecuali pasien dengan oligozoospermia berat. Sperma Fragmentasi DNA di
kedua semen asli dan DGC tidak terkait dengan tingkat fertilisasi, implantasi tingkat, atau
kehamilan klinis nancy tingkat di ICSI. Pengakuan Para penulis mengucapkan terima kasih
Perdamaian Maternity Internasionaldan Rumah Sakit Kesehatan Anak Afiliasi untuk
pendanaan penelitian.