Laporan Praktikum Hari, Tanggal : Senin, 20 dan 27 Maret 2017

Biomolekul Waktu : 08.00-11.00 WIB

PJP : Puspa Julistia Puspita, MSc
Asisten : M. Maftuchin Sholeh S.Si
Nurma Sumar Sidik
M. Alwin Azhari
Yuni Miftasari

ASAM NUKLEAT

Kelompok 11
Wafa Almulki G84140072
Fatmawati G84150025
Adella Cempaka G84150025
Rian Hidayat G84150055

DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2017
PENDAHULUAN
 Materi genetik adalah informasi yang terdapat pada setiap sel makhluk hidup
yang dapat diturunkan pada keturunan berikutnya. Materi genetik makhluk hidup
disebut juga dengan istilah asam nukleat atau dapat disebut juga faktor hereditas.
Setiap sel yang hidup pasti mengandung asam nukleat yaitu berupa Deoksiribonucleat
Acid dan (DNA) dan Ribonucleat Acid (RNA). Kedua molekul ini merupakan
polimer dari nukleotida yang berperan penting untu mempertahankan sebagai
pembawa informasi genetik. Informasi genetik yang mengatur segala metabolisme
dan bersifat herediter (gen) terletak pada molekul yang disebut DNA
(deoxyribobucleotide acid). Molekul DNA membawa informasi hereditas dari sel
(Fatchiyah et al. 2011). Molekul DNA berfungsi sebagai materi genetik dalam sel
hidup. Berfungsi dalam proses reproduksi, salinan karakteristik sel induk berupa
DNA akan diteruskan ke generasi berikutnya. DNA berisi informasi yang diperlukan
dalam membentuk organisme yang baru (Brenner and Miller 2001).
Materi genetik sangat penting untuk mempertahankan kelangsungan kehidupan
dari makhluk hidup dengan mempertahankan kesamaan sifatnya dari informasi yang
sama. Asam nukleat adalah suatu polimer nukleotida yang berperan dalam
penyimpanan serta pemindahan informasi genetik (Yuwono 2005). Komponen DNA
terdiri dari dua jenis Basa Nukleotida berupa purin dan primidin, gula deoksiribosa,
dan gugus fosfat yang dihubungkan dengan struktur kimia. Komponen ini
menentukan struktur tiga dimensi dari DNA (Passarge 2007). DNA, RNA, Gen, dan
Kromosom merupakan faktor pembawa dan penentu sifat pada makhluk hidup. Hal
ini diketahui sejak ditemukannya mikroskop elektron dengan jelas memperlihatkan
sel dan inti sel (nukleus) sampai komponen-komponen penyusun nukleusnya.
Benang-benang kromatin terbentuk jika sel sedang mengalami pembelahan untuk
membentuk kromosom. Di dalam kromosom terdapat lokus-lokus sebagai tempat gen
berada, sedangan gen tersusun atas senyawa kimia yang berupa DNA. Isolasi materi
genetik secara umum memiliki prinsip yang hampir sama antara satu dan lainnya.
Prinsip dasar isolasi total DNA atau RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan
mengekstraksi jaringantersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas
sel-sel jaringan, DNA dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipurifikasisehingga
dihasilkan pelet sel yang mengandung DNA atau RNA total. Prinsip pemecahan dan
pemurnian biasanya menggunakan teknik sentrifugasi. Teknik sentrifugasi adalah
memisahkan substansi berdasarkan beratjenis molekul dengan cara memberikangaya
sentrifugal sehingga substansi yanglebih berat akan berada di dasar,
sedangkansubstansi yang lebih ringan akan terletakdi atas (Schmid 2003).
DNA (deoxyribonucleic acid) dan RNA (ribonucleic acid) disebut sebagai
asam nukleat. Sedangkan unit struktural asam nukleat disebut nukleotida. Setiap
nukleotida memiliki tiga bagian: basa, gula pentosa yang disebut deoksiribosa atau
ribosa, dan fosfat. Basa nukleotida dinamai: adenin (A), thimin (T), sitosin (C),
guanin (G), dan urasil (U). A dan G disebut purin sedangkan T, C, dan U disebut
pirimidin. RNA mengandung basa adenin, guanin dan sitosin seperti DNA tetapi
tidak mengandungtimin, sebagai gantinya RNA mengandung urasil DNA di dalam sel
adalah berupa dua untaian panjang nukleotida yang berpasangan sambil berputar
sehingga membentuk struktur double helix sedangkan RNA tidak membentuk berupa
rantai tunggalyang terlipat, sehingga menyerupai rantai ganda. Organisme hidup
memiliki kromosom yang merupakan struktur sel yang membawa informasi herediter,
kromosom ini terdiri dari banyak gen. Gen adalah segmen-segmen DNA (Lucianus J
2003). Tujuan dari praktikum ini adalah menghitung kandungan asam
deoksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA) dalam sampel.

METODE

Waktu dan Tempat

Praktikum ini dilakukan pada hari Senin, 27

Maret 2017 yang dilaksanakan pada pukul 08.00 sampai dengan 11.00 WIB dan
bertempat di Laboratorium Pendidikan Biokimia I, Lantai 5, Gedung Fakultas
Peternakan, Institut Pertanian Bogor.

Bahan dan Alat

Alat yang digunakan adalah pipet, penangas air, spektrofotometer, sentrifus,

neraca analitik, gelas kimia, tabung sentrifus dan tabung reaksi. Bahan yang
digunakan adalah akuades, TCA 100 %, homogenat hati, HClO 4, pereaksi orsinol
HCl, asetaldehida, dan pereaksi difenilamin.

Prosedur Penelitian

Penentuan Konsentrasi RNA dalam Homogenat Hati

Sebanyak 2.5 mL homogenat hati tikus dan HClO4 0.6 M sebanyak 2.5 mL
dicampur dan dimasukkan ke dalam tabung sentrifus. Selanjutnya, tabung dikocok
dan direndam dalam air es selama 10 menit. Setelah direndam, homogenat hati tikus
di sentrifus selama 10 menit pada kecepatan 5000 rpm. Setelah larutan tersebut
disentrifus, pellet yang diperoleh, dipindahkan ke dalam tabung reaksi dan
ditambahkan KOH 0.3 M sebanyak 4 mL. Campuran tersebut diinkubasi selama 40
menit dengan suhu 40 C dan setelah diinkubasi direndam di dalam es selama 5
menit. Larutan tersebut ditambahkan HClO4 1.2 M sebanyak 2.5 mL lalu dikocok
dan direndam di dalam air es selama 10 menit. Kemudian larutan dipindahkan ke
dalam tabung sentrifus dan disentrifus kembali dengan kecepatan 5000 rpm selama
10 menit. Selanjutnya, supernatan yang diperoleh dari hasil sentrifus disimpan di
dalam botol dan diberi label DNA. Pellet yang diperoleh disuspensi kembali
menggunakan HClO4 0.2 M sebanyak 10 mL. Selanjutnya disiapkan empat buah
tabung reaksi bersih dan kosong. Tabung pertama tidak diisi larutan RNA, sebagai
blanko, tabung kedua diisi dengan larutan RNA sebanyak 0.2 mL, tabung ketiga diisi
dengan larutan RNA sebanyak 0.5 mL, dan tabung keempat diisi dengan larutan
standar RNA sebanyak 0.5 mL. Masing-masing tabung ditambahkan pereaksi orsinol
sebanyak 3 mL, lalu dipanaskan selama 20 menit pada suhu 100 oC. Setelah
dipanaskan, ditambahkan akuades dengan masing-masing tabung 4 mL, 3.8 mL, 3.5
mL, dan 3.5 mL. Selanjutnya, keempat tabung diukur absorbansinya pada 660 nm
dengan spektrofotometer.

Penentuan Konsentrasi DNA dalam Homogenat Hati

Pellet yang diperoleh pada percobaan asam nukleat I digunakan sebagai
sampel pada percobaan ini. suspensi pellet disentrifus pada kecepatan 5000 rpm
selama 10 menit. Setelah disentrifus dperoleh supernatan dan pellet. Supernatan yang
diperoleh dibuang dan pellet disuspensi dengan 2 mL HClO4 0.2 M dingin.
Kemudian, larutan dipindahkan ke dua tabung mikro sama rata. Larutan tersebut
disentrifus pada mikrofuse dengan kecepatan 5000 rpm selama 10 menit. Setelah
disentrifus dperoleh supernatan dan pellet. Supernatant dibuang dan pellet pada
tabung mikro dipanaskan dalam penangas air selama 10 menit pada suhu 100 oC.
Selanjutnya larutan diresuspensi dengan HClO4 0.2 M dingin sebanyak 1 mL. Larutan
disentrifus kembali selama 10 menit pada kecepatan 5000 rpm dan supernatan
dikumpulkan untuk penentuan kadar DNA. Selanjutnya disiapkan empat buah tabung
reaksi bersih dan kosong. Tabung pertama diisi larutan dengan akuades sebanyak 1
mL, sebagai blanko, tabung kedua diisi dengan larutan DNA sebanyak 0.5 mL,
tabung ketiga diisi dengan larutan DNA sebanyak 1 mL, dan tabung keempat diisi
dengan larutan standar DNA sebanyak 1 mL. Masing-masing tabung ditambahkan
pereaksi difenilamin sebanyak 2 mL, selanjtnya ditambahkan TC dengan masing-
masing tabung 4 mL, 3.5 mL, 3 mL, dan 3 mL. Selanjutnya, keempat tabung
dipanaskan dalam penangas air pada suhu 80oC. Setelah dipanaskan, keempat tabung
didiamkan dalam air es. Selanjutnya, keempat tabung diukur absorbansinya pada 600
nm dengan spektrofotometer dan hitung rasio RNA/DNA untuk jaringan hewan yang
akan digunakan.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam

rekayasa genetika sebelum melangkah ke proses selanjutnya. Prinsip dasar isolasi
total DNA/RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstraksi jaringan
tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri atas sel-sel jaringan, DNA,
dan RNA. Kemudian ekstrak sel dipuri-fikasi sehingga dihasilkan pelet sel yang
mengandung DNA/RNA total. Prinsip-prinsip isolasi DNA plasmid hampir sama
dengan isolasi total DNA/RNA dari jaringan (Faatih Mukhlissul 2009).
 Isolasi DNA adalah proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi
atau lisis) biasanya dilakukan biasanya dilakukan dengan penambahan homogenasi
atau buffer ekstraksi atau buffer lisis yang mencegah DNA rusak (Yuwono 2008).
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari bahan lain seperti
protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip utama dalam isolasi DNA ada tiga yakni
penghancuran (lisis), ektraksi atau pemisahan DNA dari
bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA (Donata 2007).
Pada percobaan kali ini kita menggunakan sampel hati ayam. Hati tersedia dalam
jumlah besar dan mudah didapat, selain itu hati ayam mudah direprasi. Selain itu,
Ekstrak DNA terbesar terdapat pada bahan hati ayam, hal ini disebabkan karena hati
ayam memiliki kandungan protein yang paling tinggi daripada bahan yang lainnya
(Mardiyaningsih 2013). Pelet akan ditambahkan KOH. Penambahan KOH tersebut
berfungsi untuk memisahkan antara DNA dan RNA (Bintang 2010). Lalu, sampel
didinginkan dan ditambahkan HClO dan kemudian di sentrifugasi. Penambahan
HClO berfungsi untuk memperoleh asam nukleat yang ada pada nucleus dan
mitokondria (Langga et al. 2012). Fungsi pemanasan adalah untuk mempercepat
isolasi DNA dengan campuran dengan pemutusan ikatan hidrogen. Penambahan
reagen orsinol pada suatu larutan juga disebut dengan uji bial. Uji bial merupakan uji
yang reaksinya bergantung pada pembentukan kromofor melalui kondensasi dari
dekomposisi gula dengan orsinol (3.5-dihidroksitoluena). Pereaksi pada uji bial
terdiri atas orsinol, asam hidroklorida, dan ferri klorida. Uji ini dilakukan untuk
menentukan adanya gula pentosa dan pentosan (Bintang 2010).
Penentuan kosentrasi RNA dilakukan dengan menggunakan pereaksi orsinol
yang akan bereaksi spesifik dengan gula ribosa pada RNA (Bintang 2010). Percobaan
isolasi DNA menggunakan pereaksi difenilamin, fraksi DNA tersebut akan
ditambahkan dengan pereaksi difenilamin lalu diukur nilai absorbansinya dengan
panjang gelombang 600nm yang memiliki prinsip dapat memutus ikatan fosfodiester
DNA dan menghidrolisis ikatan glikosidik antara gula dan basa purin ketika
dipanaskan. Pereaksi difenilamin ini akan bereaksi secara spesifik dengan gula
pentose yang terdapat pada purin.
Hal tersebut menandakan bahwa hanya setengah dari gula pentose yang terukur.
Reaksi fraksi DNA yang ditambahkan difenilamin akan merubah 2-deoksipentosa
menjadi beta-hidroksi-levunilaldehida. Kemudian, beta-hidroksi-levunilaldehida
bereaksi dengan difenilamin akan menghasilkan kompleks berwarna biru (Bintang
2010). Kekurangan difenil amin adalah difenilamin merupakan ligan yang lemah
sehingga tidak bias menggantikan semua molekul H2O. selain itu, indikator ini harus
dilarutkan dalam asam sulfat pekat karena sulit larut dalam air.

Absorbansi
Tabung [RNA] (g/mL)
Terukur Terkoreksi
Blanko 0.043 - -
Sampel 1 0.284 0.241 87.446
Sampel 2 0.520 0.477 173.077
Standar 1.421 1.378 500.000
Tabel 1 Kadar RNA homogenate hati ayam
 Hasil oksidasi ini membentuk endapan dengan ion Wolfram sehingga dalam
Analisa, ion tersebut tidak dapat dipakai (Patterson dan Mura 2013).

Kadar RNA hati ayam ditentukan dengan menggunakan standar yang dibuat
dengan larutan standar RNA 500g/mL berupa standar tunggal. Konsentrasi RNA
diukur dengan menggunakan jumlah volume supernatan yang berbeda. Berdasarkan
percobaan data yang didapat volume supernatan masing-masing sebanyak 0.2 mL,
dan 0.5 mL. Hasil konsentrasi RNA sampel hati ayam dapat dilihat berdasarkan Tabel
1. Konsentrasi RNA hati ayam dengan volume 0.2mL diperoleh sebesar 87.446g/mL
sedangkan konsentrasi hati RNA hati ayam dengan voulume 0.5 mL diperoleh sebesar
173.077 g/mL.
Penentuan konsentrasi DNA hati ayam diperlukan standar yang dibuat
dengan larutan standar DNA 250 g/Mlberupa standar tunggal. standar yang dibuat
dengan larutan standar RNA 500 g/mL berupa standar tunggal. Konsentrasi DNA
diukur dengan menggunakan jumlah volume supernatan yang berbeda. Volume
supernatan masing-masing sebanyak 0.5 mL, dan 1.0 mL. Adapun hasil pengukuran
konsentrasi DNA sampel hati ayam dapat dilihat berdasarkan Tabel 2. Konsentrasi
DNA hati ayam dengan volume 0.5 mL diperoleh sebesar 100.989 g/mL sedangkan
konsentrasi hati DNA hati ayam dengan voulume 1.0 mL diperoleh sebesar
110.876g/mL. Teknik isolasi materi genetik pada suatu organisme berbeda-beda
berdasarkan tingkatan taksonomi. Isolasi DNA tanaman, isolasi DNA hewan, isolasi
DNA bakteri, dan isolasi DNA mikroba pada dasarnya memiliki prinsip yang sama.
Prisnsip isolasi DNA pada berbagai jenis sel atau jaringan pada berbagai organisme
pada dasarnya sama namun memiliki modifikasi dalam hal teknik. isolasi DNA
hewan dilakukan dengan cara, organel yang dihancurkan berupa membransel terlebih
dahulu (Gusrina 2014). Isolasi DNA tanaman yang banyak mengandung polisakarida dan
senyawa polifenol dilakukan dengan cara penghancuran dinding sel (Ardiana 2009).
Fungi, bakteri dan mikroorganisme lainnya memiliki metode yang sama dengan
tumbuhan, yaitu proses isolasi DNA dilakukan melalui penghancuran dinding sel
(Faatih 2009). Namun pada isolasi DNA mikroba dikulturkan terlebih dahulu pada
media tertentu agar didapatkan hasil dalam jumblah besar (Lokapirnasari et al.
2017).
Selain dengan metode orsinol, Penentuan kadar DNA bisa dilakukan dengan
berbagai cara, yaitu metode kit ekstraksi DNA, metode CTAB, dan metode ekstraksi
DNA dengan thermal lysis. Beberapa metode ini merupakan metode umum yang
digunakan untuk isolasi DNA yang mengalami modifikasi (Lathifah et al. 2016).
DNA akan melakukan penyerapan cahaya maksimal pada A260. Namun, RNA juga
dapat menyerap cahaya pada A260 dan terdapat asam amino aromatic yang terdapat
pada protein dapat menyerap cahaya maksimal pada A280 (Hidayat 2015).
Absorbansi
Tabung [DNA] (g/mL)
Terukur Terkoreksi
Blanko 0.333 - -
Sampel 1 0.476 0.143 100.989
Sampel 2 0.490 0.157 110.876
Standar 0.687 0.354 250.000
Tabel 2 Kadar DNA homogenate hati ayam
Jika terdapat pada sampel DNA maka kedua kontaminan tesebut dapat
berkontribusi total pada pengukuran dengan A260 . Hal tersebut dapat menyebabkan
kuantitas DNA dapat berlebih. Maka dari itu dilakukan evaluasi kemurnian DNA
yaitu dengan cara rasio absorbansi A260 dibagi dengan bacaan pada absorbansi A280.
Hasil yang baik adalah pada rentang 1.7-2.0. Jika hasil yang didapat kurang dari
selang tersebut maka sampel mengandung kontaminan yang lebih banyak (Maftuchah
2014).

SIMPULAN

Isolasi DNA dan RNA dilakukan dengan menggunakan sampel hati ayam.
Keberadaan Molekul DNA dan RNA yang merupakan asam nukleat dapat diuji
dengan sentrifugasi. Penentuan konsentrasi DNA dan RNA dapat dilakukan dengan
metode spektrofotometri. Selain itu dapat dilakukan juga dengan metode CTAB
(Cationic Hexadecyl Trimethyl Ammonium Bromide). Pembacaan absorbansi baik
dilakukan pada panjang gelombang 260nm karena DNA menyerap cahaya paling
kuat. Nilai absorbansi tergantung dari perbandingan intensitas sinar yang diserap dan
intensitas sinar yang datang. Sedangkan, nilai transmitan dapat didapat dari cahaya
yang mampu melewati sampel.

DAFTAR PUSTAKA

Hidayat R. 2015. Perbandingan Metode KIT Komersial dan SDS untuk Isolasi DNA Babi dan
DNA Sapi pada Simulasi Cangkang Kapsul Keras untuk Deteksi Kehalalan
Menggunakan Real-Time PCr (Polymerase Chain Reaction [Skripsi]. Jakarta
(ID):UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Maftuchah, Winaya A, Zainudin A. 2014. Teknik Dasar Analisis Biologi Molekuler.
Yogyakarta (ID): Deepublish.
Schmid RD. 2003. Pocket Guide to Biotechnology and Genetic Engineering. German (DE):
Wiley VHC.
Fatchiyah, Arumingtyas EL, Widyarti S, Rahayu S. 2011. Biologi Molekular, Prinsip Dasar
Analisis. Jakarta (ID): Erlangga.
Brenner S, Miller JH. 2001. MRC Laboratory of Molecular Biology. Cambridge (UK):
Academic Press.
Passarge E. 2007. Color Atlas of Genetics, 3rd edition Revised and Updated. Germany (DE):
Institute of Human Genetics, University Hospital Essen. Thieme.
Yuwono T. 2005. Biologi Molekuler. Jakarta (ID): Erlangga.
Lucianus Johan 2003. Introduksi Genetika Molekular Virus. Jurnal KM 3(1) : 1-6.
Faatih M. 2009. Isolasi dan digesti dna kromosom. Jurnal Penelitian Sains dan Teknologi.
10(1) : 61-67.
Yuwono T. 2008. Biologi Molekuler. Erlangga. Jakarta.
Donata. 2007. Komunikasi pribadi. Ciri-ciri DNA murni dan penyebab keberhasilan serta
kegagalan dalam PCR dan elektroforesis.Erlangga. Jakarta.
Mardiyyaningsih AN. 2013. Teknik isolasi DNA sel hati ayam secara tradisional. Jurnal
Pendidikan Matematika dan IPA. 2(1): 23-28.
Bintang M. 2010. Biokimia Teknik Penelitian. Jakarta (ID) : Erlangga.
Gusrina. 2014. Genetika dan Reproduksi Ikan. Yogyakarta (ID): Deepublish.
Ardiana Dwi Wahyuni. 2009. Teknik isolasi dna genom tanaman pepaya dan jeruk
Dengan menggunakan modifikasi bufer ctab. 14(1): 12-16
Lokapirnasari WP, Sahidu AM, Nurhajati T, Supranianondo K, Yulianto AB. 2017.
Sekuensing 16s DNA bakteri selulolitik asal limbah cairan rumen sapi peranakan
ongole. Jurnal Veteriner. 18(1): 76-82.
Lathifah AU, Buwono ID, Subhan U. 2016. Deteksi keragaman genotip hibrid ikan lele
sangkuriang, mutiara transgenik dan mutiara non transgenik pada keturunan pertama.
Jurnal Perikanan Kelautan. 7(2): 111-120.
Langga IL, Restu M, Kuswinanti T. 2012. Optimalisasi suhu dan lama inkubasi dalam
ekstraski DNA tanaman bitti (Vitex cofassus Reinw) serta analisis keragaman genetik
dengan teknik RAPD-PCR. Jurnal Sains dan Teknologi. 12(3): 265-276.
Patterson J, Mura C. 2013.Rapid colorimetric assays to qualitatively distinguish RNA and
DNA in biomolecular samples. Journal of Visualized Experiments. 1-9.