LAPORAN PRAKTIKUM

KEGIATAN III
ISOLASI PIGMEN TANAMAN DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM

Dosen Pengampu:
Fitria Susilowati, S.Pd., M.Sc.

Disusun oleh:
Aisyah Rulina Safitri
NIM: 36.2015.7.1.2275

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN
UNIVERSITAS DARUSSALAM GONTOR
NGAWI
2017
 I. TUJUAN
1. Mengetahui pengertian kromatografi kolom
2. Melakukan isolasi pigemen tanaman dengan kromatografi kolom
3. Mengetahui kandungan pigmen dalam kangkung
II. DASAR TEORI

Kromatografi kolom merupakan suatu metode pemisahan fisik, dimana

komponen-komponennya dipisahkan dan didistribusikan diantara 2 fase, salah
satu fase tersebut adalah suatu lapisan stationer dengan permukaan yang luas,
yang lainnya sebagai fluida yang mengalir lembut disepanjang landasan stationer.
Pase stationer bisa berupa padat maupun cairan, sedangkan fase gerak bisa berupa
cairan atau gas (Day dan Underwood, 1986).

Kromatografi kolom adsorbsi merupakan salah satu contoh dari

kromatografi cair-padat yang termasuk teknik tertua yang dioperasikan
berdasarkan retensi terlarut pada permukaan adsorben. Pada kromatografi
adsorbsi, fase stationernya terdiri atas zar padat dan fase geraknya terdiri dari zar
gas atau cair. Yang temasuk dalam kromatografi cair-padat adalah kromatografi
kolom adsorbsi, kromatografi gas, dan kromatografi lapis tipis (Gandjar dan
Rohman, 2007).

Pada kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan

pada bagian atas kolom penjerat yang berada dalam tabung kaca, tabung logam,
atau tabung plastik. Kolom kromatografi tabung untuk pengaliran karena gaya
tarik bumi (gravitasi) atau sistem bertekanan rendah biasanya terbuat dari kaca
ynag dilengkapi dengan keran jenis tertentu oada bagian bawahnya untuk
mengatur aliran pelarut (Gritter, 1991).

Klasifikasi kromatografi kolom berdasarkan interaksi komponen dengan

adsorben adalah:

1. Kromatografi adsorbsia: komponen yang dipisahkan secara selektif

teradsorbsi pada permukaan adsorben yang dipakai untuk isian kolom.
2. Kromatografi partisi: komponen mengalami partisi antara kapisan cairan
tipis ada penyangga padat dan eluen.
3. Kromatografi pertukaran ion: komponen yang dipisahkan berbentuk ion.
4. Kromatografi filtrasi gel: pemisahan berdasarkan ukuran komponen yang
dipisahkan.
 Pengemasan kolom dapat dilakukan dengan cara basah atau cara kering.
Cara basah lebih mudah untuk memperoleh packing yng memberikan pemisahan
yang baik. Sedangkan cara kering umumnya dilakukan untuk alumina. Dalam cara
basah, fase diam dicampur terlebih dahulu dengan pelarut sebelum dimasukkan ke
tabung kolom. Sedangkan cara kering fase diam dimasukkan terlebih dahulu
kedalam kolom, baru dialiri fase gerak (Basset, 1994).

Kromatografi kolom memiliki peranan yang sangat luas dalam berbagai

bidang, misalnya dalam penentuan kualitatif atau kuantitatif suatu senyawa.
Metode ini juga diaplikasikan dalam pemisahan molekul-molekul penting seperti
asam nukleat, karbohidrat, lemak, vitamin, dan molekul penting lainnya. Selain
itu juga bisa digunakan untuk infestigasi suatu senyawa berbahaya dalam pasien
atau korban.

Kromatografi kolom memiliki kelebihan dan kekurangan. Kelebihannya

adalah dapat digunakan untuk analisis dan aplikasi preparatif, menentukan jumlah
komponen campuran, dan untuk memisahkan dan purifikasi. Selain itu metode ini
hanya membutuhkan alat dan bahan yang mudah didapat dan murah, hanya
membutuhkan waktu yang singkat, dan udah pelaksanaannya. Kekurangnnya
adalah membutuhkan kemampuan dalam teknik dan manual untuk menyiapkan
kolom yang sasuai dengan sampel, dan juga kurang akurat dalam penetapan
kuantitaitf komponen dalam senyawa (Gritter, 1991).

Kangkung (Ipomoea aquatica) merupakan semak yang kadang-kadang

berumur 1 tahun atau menahun. Batangnya menjalar diatas tanah basah atau
terapung. Tangkai daun tebal 3-20 cm, helaian daun sangat berbeda dalam bentuk
dan ukuran, bulat telur, segitiga, memanjang, bentuk garis/lanset, gundul,
rata/bergerigi, hidup ditanam atau liar, tempat lembab, berawa, genangan, parit,
sawah, pinggir jalan (Steenis, 1947).

Tanaman memiliki pigmen yang digunakan untuk membantu

kelangsungan hidupnya, macam-macam pigemen dalam tanaman adalah:
 1. Klorofil: merupakan pigmen fotosintesis yang terdapat pada sebagian
besar tumbuhan. Dibagi menjadi klorofil a yang mengandung warna hijau,
dan klorofil b yang mengandung warna biru.
2. Karotenoid: merupakan pigmen penyebab warna merah, orange, dan
kuning pada sayuran.
3. Antosianin: pembei warna merah, merah muda, ungu, dan biru.
4. Xantofil: pigmen berwarna kuning

III. ALAT DAN BAHAN

A. ALAT
1. Gelas ukur 10 ml : 2 buah
2. Gelas ukur 20ml : 2 buah
3. Gelas beaker 120 ml : 1 buah
4. Corong : 1 buah
5. Pipet tetes plastik : 2 buah
6. Pipet tetes kapiler : 1 buah
7. Kolom : 1 buah
8. Klem dan statif : 1 buah
9. Tube : 12 buah
10. Spatula : 2 buah

B. BAHAN
1. Silica gel : 3 gr
2. Daun kangkung : 7 lembar
3. Solven PA (Pro Analysis) : aseton, n-heksana, metanol
4. Anhidrat : secukupnya
5. Kertas saring : secukupnya
6. Alumunium foil : secukupnya

IV. PROSEDUR KERJA

A. PENYIAPAN KOLOM DAN FASE DIAM

Menimbang silica gel 3 gram dalam keadaan kering

Menambahkan n-heksana secukupnya dan diaduk hingga membentuk slurry

Memasukkan kapas ke pangkal kolom

 Memasukkan slurry secara perlahan dan menyiram sisa slurry di dinding
kolom dengan n-heksana

Mengurangi n-heksana hingga 1 cm diatas permukaan silica, meratakan

silica dengan menepuk kolom perlahan hingga packing kolom baik dan rapat

B. EKSTRAKSI DAUN KANGKUNG

Menghaluskan 7 lembar daun kangkung dengan lumpang alu dan

menambahkan kurang lebih 5ml aseton, mengaduknya hingga homogen

Menyiapkan kolom dan melapisinya dengan kertas saring dan

membasahinya dengan aseton

Memasukkan anhidrat secukupnya di pangkal corong

Menyaring kangkung yang telah halus dan filtratnya dimasukkan dalam tube
dan ditutup dengan alumunium foil

C. ELUSI DENGAN KROMATOGRAFI KOLOM

Menyiapkan 5 macam palarut, (1) 5ml n-heksana, (2) 5ml n-heksana : aseton
7:3, (3) 5ml aseton, (4) 5ml aseton : metanol 8:2, (5) 5ml metanol

Memasukkan larutan sampel (2,9 ml) secara perlahan-lahan dengan pipet

Memasukkan eluen sesuai urutan non-polar ke polar secara perlahan

 Menampung eluet sesuai warna ke botol-botol vial

V. DATA PENGAMATAN

Fraksi Warna
1 Bening
2 Kuning jernih segar
3 Kuning jernih pucat
4 Jernih kecoklatan
5 Coklat
6 Coklat muda
7 Kuning kehijauan
8 Hijau muda
9 Hijau bening
10 Jernih kehijauan
11 Bening

VI. PEMBAHASAN

Kromatografi kolom merupakan metode tertua yang digunakan untuk

pemisahan komponen dari suatu senyawa. Metode ini banyak digunakan dalam
berbagai bidang, contohnya dalam bidang klinis. Metode ini bisa dibunakan untuk
menganalisis komponen suatu senyawa berdasarkan kualitatif ataupun kuantitatif.

Metode kromatografi kolom banyak menjadi pilihan karena banyak

kelebihannya dari pada metode lain. Kelebihannya adalah dapar digunakan untuk
analisis dan aplikasi preparatif, menentukan jumlah komponen dalam senyawa,
dan untuk pemisahan dan purivikasi. Selain itu pelaksanaannya murah dan mudah
didapatkan sedangkan kekurangannya adalah bentuk kemampuan dan keahlian
khusus untuk membuat kolom yang sesuai dengan sampel, dan juga kurang akurat
dalam penetapan kuantitatif komponen.

Prosedur awal dari metode ini adalah penyiapann kolom dan fase diam.
Fase diam yang digunakan praktikan dalam praktikum ini adalah silica gel. Alasan
pemilihan silica gel karena memiliki tekstur dan struktur yang lebih kompak dan
teratur. Saat memadat, silica gel akan berbentuk tetrahedral raksasa sehingga
ikatannya kuat dan rapat, sehingga proses pemisahan menjadi optimal.

Silica gel dapat membentuk ikatan hidrogen dipermukaannya, karena

terikat gugus hidroksil. Oleh karenanya, silica bersifat polar. Jika fase gerak non
polar, komponen-komponen yang bersifat polar akan terikat dan tertahan dalam
fase diam. Komponen yang tidak polar akan keluar bersama fase gerak lebih
cepat.

Metode pembuatan fase diam dalam praktikum ini adalah metode basah.
Silica gel ditimbang gram dan dilarutkan dengan n-heksana. Setelah itu
dimasukkan perlahan ke dalam kolom melewati dinding kolom, alasan melewati
dinding kolom adalah agar gelembung udara tidak terjebak ditengah-tengah silica,
jika ada gelembung udara akan mengurangi kesuksesan proses pemisahan. Setelah
itu dinding kolom disirami n-heksana hingga tidak tersisa silica di dinding kolom.
Jika n-heksana berlebih, keran dibuka dan n-heksana dialirkan keluar hingga 1 ml
diatas permukaan silica. Ini bertujuan agar fase diam tidak mengaring dan pecah.
Untuk meratakan susunan silica, kolom ditepuk-tepuk perlahan hingga teksturnya
menjadi rapat dan padat. Setelah siap, kolom ditutup dengan alumunium foil
untuk mengurangi penguapan dari n-heksana.

Prosedur selanjutnya adalah ekstraksi daun kangkung. 7 Lembar daun

kangkung dihaluskan dengan lumpang alu hingga halus. Setelah itu ditambahkan
kurang lebih 5 ml aseton, ini bertujuan untuk melarutkan komponen-komponen
yang ada dalam kangkung. Dipilih aseton karena aseto erupakan salah satu pelarut
yang bersifat netral, sehingga bisa melarutkan senyawa polar dan non polar.
Setelah tercampur, menyiapkan corong yang telah dilapisi kertas saring. Kertas
saring dibasahi aseton dan dimasukkan anhidrat di pangkal corong. Anhidrat ini
berguna untuk menyerap air, sehingga ketika residu disaring akan menghasilkan
sampel yang pekat dengan kadar air yang sedikit.

Selanjutnya adalah persiapan elusi. Sebelum dilakukan elusi, terlebih

dahulu disiapkan fase gerak. Fase gerak yang digunkan ada 5 macam, yaitu:
 1. 5 ml n-heksana
2. 5 ml n-heksana : aseton (7:3)
3. 5 ml aseton
4. 5 ml aseton : metanol (8:2)
5. 5 ml etanol

Fase gerak ini berurutan dari non polar ke polar. Alasan digunakan campuran 2
pelarut karena agar mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat
terjadi secara optimal. Setelah tersedia, eluen ditutup rapat agar tidak terjadi
penguapan.

Tahap selanjutnya adalah penuangan sampel pada kolom. Penuangan ini

harus dilakukan secara lembut dan perlahan agar tidak merusak susunan silica
dalam kolom. Jika terlalu keras dalam penuangan, silica akan retak dan kolom
dikatakan rusak. Jika terjadi keretekan, bisa ditanggulangi dengan pembalutan
kolom dengan kertas tisu yang telah dibasahi dengan aseton atau alkohol. Sehu
rendah dari alkoholdan aseton akan menyatukan kembali retakan dalam silica,
sehingga menjadi pada dan rapat kembali.

Tahap terpenting adalah proses elusi. Eluen dimasukkan perlaha dengan

pipet tetes kapiler melalui dinding kolom. Disamping pemasukan eluen, keran
kolom dibuka dan tetesannya diatur sedemikian rupa agar tidak terlau pelan atau
cepat. Eluen yang ada di kolom harus selalu diamati agar tingginya tidak
meyerupai permukaan silica, ini bertujaun agar silica tidak kering dan retak. Eluet
yang keluar dimasukkan dalam botol-botol vial berdasarkan warnya. Jika terbagi
berdasarkan warna, eluet bisa dianalisis atau dimonitoring kembali menggunakan
KLT.

Penuangan eluen dilakukan secara berurutan mulai dari non polar hingga
polar. Komponen yang bersifat polar akan terikat dengan permukaan silica
sehingga akan tertahan sementara. Sedangkan komponen yang bersifat non-polar
akan terbawa dengan eluen non-polar keluar kolom. Saar eluen polar kasuk,
komponen polar aan terlepas dari silica dan ikut keluar bersama eluen. Jika
penuangan eluen dilakukan secara terbalik (polar non-polar), eluen akan
berinteraksi dengan silica, akhirnya proses pemisahan menjadi tidak optimal. Dan
dari jenis fase diam dan fase gerak tersebut, kromatografi kolom ini dapat
digolongkan menjadi kromatografi fase normal. Ini dikarenakan fase diam yang
digunakan bersifat polar, dan fase geraknya bersifat non-polar ke polar.

Fraksi-fraksi yang didapatkan dari kromatografi kolom iniada dalam

berbagai warna. Warna yang ada secara berurutan adalah kuning, coklat, kuning
kehijauan, dan hijau. Fraksi awal berwarna kuning mengartikan adanya senyawa
karotenoid. Setelah itu warna coklat yang mengartikan adanya senyawa
antosianin. Fraksi selanjutnya berwarna kuning kehijauan yang mengartikan
senyawa xantofil. Praktikan menyipulkan bahwa fraksi kuning kedua adalah
xantofil karena xantofil merupakan senyawa agak polar yang biasanya muncul
bersama klorofil. Fraksi selanjutnya adalah pigmen hijau yang mengartikan
adanya klorofil. Fraksi berwarna hijau hasil pemisahan ini didapatkan hanya
sedikit karena kandungan klorofil dalam kangkung tersebar pada seluruh badan
tanaman, didaun dan dibatang. Berbeda dengan bayam yang kebanyakan
klorofilnya berada di daun, sehingga fraksi yang didapatkan lebih banyak
berwarna hijau. Dan dibanding dengan fraksi kelompok 4, kebanyakan berwarna
hijau. Ini disebabkan karena sampel yanag mereka gunakan adalah daun kangkung
muda, yang disana terdapat banyak sekali kandungan klorofil untuk
berfotosintesis. Sedangkan praktikan menggunakan daun kangkung besar dan tua
yang kandungan klorofilnya mulai berkurang.

VII. KESIMPULAN

Kromatografi kolom merupakan suatu metode pamisahan fisik dimana

komponen-komponennya dipisahkan dan didistribusikan diantara 2 fase. Fase
diamnya berupa zat padat dan fase geraknya berupa zat cair atau gas.

Cara mengisolasi pigmen tanaman dengan kromatografi kolom adalah

dengan menyiapkan kolom dan fase diam, mengekstraks sampel, lalu dielusikan
dengan kromatografi kolom.
 Kandungan pigmen dalam kangkung adalah kuning (karotenoid), coklat
(antosianin), kuning kehijauan (xantofil), dan hijau (klorofil).

VIII. DAFTAR PUSTAKA

Basset, J, 1994, Buku Ajar Vogel Kimia Analisis Kuantitatif Organik, Penerbit
Buku Kedokteran EGC, Jakarta.
Day, R.A. Dan Underwood, A.L., 1986, Analisis Kimia Kuantitatif, Penerbit
Erlangga, Jakarta.
Gholib, Ibnu Gandjar Dan Rohman, Abdul, 2007, Kimia Farmasi Analisis,
Pustaka Pelajar, Yogyakarta.
Gritter, R.J., 1991, Pengantar Kromatografi, ITB, Bandung.
Khopkar, S.M., 2000, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta.
Steenis, C.G.G.J. Van, 1947, Flora, PT.Balai Pustaka Persero, Jakarta Timur.