Tcnicas para el
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 3 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
OBJETIVOS
GENERALIDADES
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado
distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un
tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), se utilizan como
indicadores de malas prcticas sanitarias.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxignica (ETEC), E. coli enteropatgena (EPEC), E. coli
enterohemorrgica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa
(EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han
sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras estn
implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos
contaminados.
Invasiva - - - +
Intiminas - + + -
Enterohemolisina - - + -
FUNDAMENTO
MATERIAL Y EQUIPO
a,b,c,d,e
Mechero, .
a
Propipeta .
a,b,c,e
Gradilla .
a
Balanza granataria .
a
Stomacher
Lentes de seguridad
a
Asa bacteriolgica
d
Portaobjetos
d
Microscopio ptico
b
Termmetro calibrado
b
Incubadora a 35 2,0C .
a
Autoclave
Versin para Administrador de Manuales y Documentos6 (AMyD). Facultad de Qumica, UNAM
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2011. Tcnicas para el
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 3 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
NOTAS
a Material necesario al inicio de la prctica.
b Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica.
c Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica.
d Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica.
e Material necesario a las 144 h. de iniciada la prctica.
37C
24 - 48 h
Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato Siembra con asa bacteriolgica de los tubos
2 a 3 asadas/tubo 2 a 3 asadas/tubo
37C 44.5C
24 48 h
24 48 h
8
Versin para Administrador de Manuales y Documentos (AMyD). Facultad de Qumica, UNAM
Siembra de tubos positivos en
placas de Agar EMB para la
bsqueda de Escherichia
coli
Camacho, A., M.Giles, A.Ortegn, M.Palao, B.Serrano y O.Velzquez. 2011. Tcnicas para el Anlisis
Microbiolgico de Alimentos. 3 ed. Facultad de Qumica, UNAM. Mxico.
PROCEDIMIENTO
1. Agua y hielo
Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay
formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa produccin de gas, incubar 24 h. ms.
Control de calidad
1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por
estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba
positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inculo ligero para evitar
turbiedad en el tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons)
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una
prueba positiva.
NOTAS
Para determinar la produccin de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al
agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogca de forma recta.
Para determinar la utilizacin del citrato de sodio como nica fuente de carbono,
tambin se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se
inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35C de 24 a 48 h. La presencia de
una coloracin azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba
positiva
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-
MUG (4 metil-umbeliferil--D-glucuronido)
FUNDAMENTO
Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de
gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato especfico
4-metilumbeliferil-beta-D-glucurnido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser
expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una
fluorescencia azul fcil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se
puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa
A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formacin de
gas , tomar una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de
confirmacin EC-MUG.
Incubar a 44,5 0,2C en bao de agua durante 24 h., observar si hay formacin de
gas; si no se observa la formacin de gas continuar la incubacin 24 h. ms.
Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la
lectura.
Control de calidad
Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.
pneumoniae como control negativo.
2. Alimentos
-1
Aadir 1.0 mL de la dilucin 10 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo
lauril sulfato de sodio.
-2 -3
Aadir 1.0 mL de las diluciones 10 g/mL y 10 g/mL a dos series de 3 tubos cada
una con caldo lauril sulfato de sodio.
Incubar a 35 2C durante 24 a 48 h.
Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el nmero
ms probable de organismos coliformes totales por mL.
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y produccin
de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Control de calidad
Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y
una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las
muestras.
Incubar las placas a 35 0.5C durante 24 2 h., observar las colonias tpicas
fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitacin de sales
biliares.
TABLA 2. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con
10 mL de muestra de agua o hielo.
BIBLIOGRAFA
Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiologa Mdica de
Jawetz. Manual Moderno 17a Edicin 2002, pp 274-275
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL