La Fermentacin Malolctica: Objetivos y Variables de

Control.
Antonio Palacios**; Sibylle Krieger*; Carlos Surez**; Jose Mara Heras**;
* Lallemand Alemania; ** Lallemand Pennsula Ibrica;

La fermentacin malolctica se produce en el vino como resultado de la actividad

metablica de ciertas cepas de bacterias lcticas bien adaptadas. La reduccin de la
acidez del vino y la modificacin de su sabor, que se producen por esta fermentacin
bacteriana, se suelen considerar beneficiosas para el vino. La ventaja de la induccin de
la fermentacin malolctica (FML) por inoculacin de cepas seleccionadas de bacterias
lcticas es doble; en primer lugar, mejora el control del tiempo y la velocidad de la
conversin del cido mlico y, en segundo lugar, ejerce una influencia positiva en el sabor
y la calidad del vino. Los estudios sensoriales demuestran que los compuestos de sabor
producidos por las bacterias del cido lctico provocan cambios reconocibles en las
caractersticas de sabor del vino (1). Varios estudios prueban que distintas cepas de
bacterias malolcticas tienen distintos efectos sensoriales en el vino (1,2,3,4,5), pero la
influencia de la programacin temporal de la incorporacin de las bacterias, as como el
nivel de inoculacin, no se terminan de comprender del todo.

INOCULACIN SIMULTNEA DE LEVADURAS Y BACTERIAS

En Burdeos, Francia, se recomienda la inoculacin de bacterias malolcticas (BML) una

vez completada la fermentacin alcohlica para evitar la posible produccin de cido
actico y cido D-lctico, una situacin que se denomina picado lctico (6). La FML que
se produce durante la fermentacin alcohlica (FA) podra ocasionar una parada de dicha
fermentacin. La experiencia en EE.UU. no ha confirmado las conclusiones francesas de
una mayor produccin de cido actico, antagonismo de las levaduras o paradas de la FA
cuando se detecta un prematuro crecimiento de las bacterias lcticas. La inoculacin de
BML con la levadura se ha propuesto con la idea de posibilitar a las bacterias para crecer
y aclimatarse mejor en ausencia de etanol. Las bacterias no se resentirn por el dficit de
nutrientes ni estarn expuestas a los efectos txicos del etanol en estas circunstancias.
Beelman y Kunkee (7) demostraron que la FML en presencia de azcares fermentables
no implica necesariamente la produccin de cantidades excesivas de cido actico por las
bacterias en la medida en que la fermentacin de las levaduras se inicie inmediatamente
y se complete (1). Por el contrario, King y Beelman (8) sugirieron que el crecimiento de
PSU-1 Oenococcus oeni (antes Leuconostoc oenos) durante la FA en un sistema de
mosto modelo podra verse retrasado por la produccin de compuestos txicos derivados
de las levaduras distintos del etanol y el dixido de azufre. Cuando compararon las curvas

1
de crecimiento bacteriano en cultivos puros y en cultivos mixtos con levaduras,
encontraron que la presencia de levaduras de crecimiento rpido era antagonista del
desarrollo bacteriano (Figura 1). Atribuyeron la inhibicin del crecimiento bacteriano a la
presencia de metabolitos de levaduras y/o la eliminacin por parte de las levaduras de
substancias importantes para la nutricin bacteriana. Los datos de la Figura 1 demuestran
que el momento de la transicin de las bacterias desde la fase de latencia hasta la fase
logartmica del crecimiento en cultivos mixtos con levaduras, coincide con la fase de
muerte del ciclo de crecimiento de las levaduras. Este fenmeno puede resultar de la
reaparicin de nutrientes bacterianos esenciales al sistema como consecuencia de la
muerte de las levaduras y la autlisis. Al comparar las curvas de crecimiento de las
levaduras en cultivos puros y mixtos, pudieron demostrar que el crecimiento de las
levaduras a lo largo de la fase estacionaria no se vea afectado por la presencia de
bacterias. Sin embargo, se observ una tasa de muerte acelerada de las levaduras en los
cultivos mixtos cuando se produca un rpido crecimiento bacteriano.

Figura 1. Crecimiento de las levaduras del vino y de las bacterias en cultivos puros y
mixtos.
9
log cel. viables (ufc/ml)

7
6

5
Levaduras
4
(c ultivo puro)
Levaduras
3
(c ultivo mixto)
2 bac teria
(c ultivo puro)
1 bac teria
(c ultivo mixto
0
0 2 3 5 8 10 15 20 30 35 40 50
tiempo (das)

PRODUCCIN DE ACIDEZ VOLTIL

Un crecimiento potente bacteriano puede inhibir el crecimiento de las levaduras y esto

provocar posteriormente la produccin de cantidades excesivas de acidez voltil (9). En
la Figura 2, Radler (22) seal un consumo de azcares de 0,2-2g durante el crecimiento
en las tres fases que se muestran a continuacin. Durante el crecimiento en la Fase I,
pueden producirse pequeas cantidades de cido actico y cido D-lctico. Cuando los

2
recuentos de clulas superan los 5x106 ufc/ml en la Fase II, comienza la degradacin del
cido mlico, pero no se produce cido actico durante la degradacin del cido mlico.
La Fase III se caracteriza por la degradacin del cido ctrico y los azcares, acompaada
de un aumento del cido actico. Sin embargo, las bacterias empezarn a consumir
azcares slo cuando se complete la degradacin de los cidos orgnicos. El cido
mlico ser el primero en consumirse, y le seguirn el cido ctrico, fumrico y otros (10).
La degradacin de los azcares en este punto dar lugar a un importante aumento de la
acidez voltil.

Figura 2. Metabolismo de los azcares y los cidos orgnicos durante la FML en el vino

azcar
(Fructosa)
biomass
biomasa

lactato
malato

citrato
acetato

CRECIMIENTO FASE ESTACIONARIA I FASE ESTACIONARIA II

Catabolismo
CELULAR de azcar No catabolismo de azcar No catabolismo de azcar
No catabolismo de Degradacin de mlico No catabolismo de malato
Nomalato
catabolismo de No catabolismo de Cataboilismo de citrato
Ligera
citrato produccin de acetato No produccin de acetato
citrato Produccin de acetato
Ligera produccin de lactato Produccin de lactato No produccin de lactato

Los experimentos desarrollados por el grupo de investigacin de Lallemand confirmaron

que no se producir cido actico durante el crecimiento de las BML y la FML activa. En
esos experimentos, se observ produccin de cido actico slo cuando se haba
degradado la mitad del cido mlico y las bacterias haban empezado a consumir cido
ctrico. Las pruebas desarrolladas con inoculacin simultnea de bacterias y levaduras
frente a la inoculacin bacteriana una vez completada la FA, no mostraron ninguna
diferencia en la concentracin final de cido actico, sino una relacin directa con la

3
degradacin del cido ctrico y se prob un aumento de la concentracin de cido actico
(11). En funcin de la disponibilidad de oxgeno y el potencial de oxidacin-reduccin del
medio, el cido ctrico puede utilizarse como aceptor de electrones, lo que resultar en
produccin de cido actico, o puede degradarse en diacetilo. La posterior reduccin del
diacetilo en acetona y 2,3-butanodiol tambin depende del potencial de oxidacin-
reduccin del vino. El diacetilo se considera como un importante compuesto del sabor y
en concentraciones entre 0,02 y 2 mg/l puede conferir al vino un aroma a mantequilla muy
distintivo. El umbral olfativo de la acetona y el 2,3-butandiol es muy superior a las
concentraciones en las que se encuentra normalmente en el vino. Por tanto, no
contribuyen al aroma del vino. Se precisan estudios adicionales para definir de forma ms
precisa el efecto del oxgeno y el potencial de oxidacin-reduccin y las concentraciones
finales de diacetilo y cido actico en el vino. La FML en presencia de las siempre dar
lugar a unos niveles de diacetilo menores, ya que la potencia reductiva de las levaduras
viables convertir el diacetilo en compuestos con menos sabor. Por tanto, la coinoculacin
del vino con levaduras y bacterias dar lugar a menos aromas lcticos y de mantequilla, lo
que generar un estilo de vino ms afrutado.

Lallemand, en colaboracin con la Universidad Massey de Nueva Zelanda, produjo vino

utilizando una cepa de levadura y dos cepas de bacterias malolcticas. Para cada
combinacin de levadura/bacteria, las bacterias malolcticas se inocularon bien junto con
la levadura (FA/FML simultnea) o bien una vez completada la fermentacin alcohlica
(FA/FML secuencial). El vino se produjo con uvas Chardonnay de un viedo comercial en
la zona de Fernhill de la regin neocelandesa de Hawke's Bay. Las frutas se prensaron,
no se aadi SO2 y el mosto se estabiliz en fro a 4C durante 24 horas, momento en el
que se aadieron 300 mg/l de fosfato de diamonio. Las vinificaciones se llevaron a cabo
por triplicado en damajuanas de 25 litros y el anlisis inicial del mosto fue como sigue: -
20,7 0B, pH 3,28 y 10 g/l de acidez total medida en cido tartrico. Los resultados que se
presentan en la Tabla 1 demuestran que la FA/FML secuencial siempre dio lugar a una
FML prolongada en comparacin con la FA/FML simultnea.

Tabla 1. Retraso de la FML frente a la secuencia de inoculacin

FA/FML simultnea FA/FML secuencial

Cultivo de iniciacin ML 26 das 74 das (con cido
Lalvin EQ54 mlico residual)
Cultivo de iniciacin ML 19,5 das 68 das
Uvaferm Alpha

El cido mlico, en una concentracin inicial de 5 g/l, se degrad aproximadamente en 3

semanas, que es un perodo idntico al necesario para la conversin del azcar en
alcohol durante la FA/FML simultnea. Cuando se inocularon BML despus de la
4
fermentacin alcohlica, la FML result difcil y dur bastante ms tiempo. El tratamiento
secuencial utilizando el cultivo de inoculacin bacteriano A dio lugar a una fermentacin
malolctica incompleta, y persistieron dejaron sin fermentar 100 mg/l de cido mlico en el
vino (Tabla 1).

En las primeras dos semanas del experimento, no se apreciaron diferencias significativas

en la degradacin de la glucosa y la fructosa al comparar las inoculaciones de FA/FML
simultneas y secuenciales. Sin embargo, 20 das despus de completarse la FA/FML
simultnea, tanto la glucosa como la fructosa eran indetectables en el protocolo de
coinoculacin, mientras que la glucosa y la fructosa persistan en una concentracin
combinada de 700 mg/L en las inoculaciones secuenciales. Puesto que la glucosa y la
fructosa pueden actuar con fuentes de carbono y energa para muchos microorganismos,
la ausencia total de estos dos azcares aumentar la estabilidad microbiolgica.

La degradacin del cido ctrico fue diferente en los tratamientos con inoculaciones de
FA/FML simultneas o secuenciales. En los tratamientos simultneos, el cido ctrico se
degrad ms rpidamente y se produjo un poco ms de cido actico. Sin embargo, las
diferencias en las concentraciones finales de cido actico fueron pequeas y
estadsticamente significativas.

Tabla 2. Produccin de cido actico (g/L) frente al protocolo de inoculacin

FA/FML simultnea FA/FML secuencial

Cultivo de iniciacin ML 0,195 0,147
Lalvin EQ54
Cultivo de iniciacin ML 0,187 0,168
Uvaferm Alpha

La evaluacin sensorial de los vinos producidos en este experimento demostr que

existan diferencias entre los vinos producidos utilizando las distintas fases de inoculacin,
pero pocas o ninguna de estas diferencias eran atribuibles a la cepa malolctica utilizada.
Los vinos producidos con coinoculacin eran ms afrutados que los producidos con
inoculacin simultnea.

En colaboracin con las unidades de investigacin alemanas de Neustadt y Trier,

Lallemand estudi la inoculacin simultnea de las levaduras y las bacterias en vinos
Riesling. Este experimento se dise para determinar el impacto de la adicin simultnea
de levaduras (Lalvin EC1118 y Lalvin CY3079) y BML (Uvaferm Beta) en los aromas
varietales de las uvas y la produccin bacteriana de excesivo cido actico. Los
resultados presentados en la Figura 3 muestran que la inoculacin simultnea de

5
levaduras y bacterias no influy en la fermentacin de las levaduras y no se formo cido
actico.

Figura 3. Adicin simultnea de levaduras y bacterias frente a la fermentacin alcohlica

200
simultanea
Azcares Totales (g/l)

levadura EC1118
160
post FA
levadura EC1118

120 simultanea
levadura CY3079
post FA
80
levadura CY3079

40

0
0 2 6 10 14 17 21 24 28 31 35
Das despus de Inoculacin

La temprana inoculacin bacteriana dio lugar a una FML mucho ms rpida y el cido
mlico se degrad en 23 das frente a los ms de 50 das necesarios cuando la
inoculacin se produjo despus de la FA (Fig. 4). La programacin de la inoculacin tuvo
un gran impacto en el perfil sensorial del vino. En el caso de la inoculacin simultnea, el
rpido inicio de la FML permiti la degradacin del cido mlico en las condiciones
reductivas generadas por las clulas de levaduras que todava estaban activas. En el
experimento de coinoculacin, este entorno reductivo evit la formacin de aromas de
mantequilla o lcticos, y el vino conserv los sabores y aromas tpicos de las uvas
Riesling. Los vinos inoculados despus de la FA mostraban los sabores de mantequilla y
frutos secos tpicos de la fermentacin malolctica y faltaban los sabores y aromas de las
uvas Riesling.

6
Figura 4. Momento de inoculacin frente a la degradacin del cido mlico

4
Inoculacin despus
Fermentacin alcohlica

Levadura
3
CY3079
sim FA/FML
Ac. Mlico (g/l)

Levadura
2 EC 1118
sim FA/FML
Levadura
CY3079
1 post FA
Levadura
EC 1118
post FA
0
0 10 20 30 40 50 60

Das

Estos resultados demuestran que la induccin simultnea de la FA/FML genera unos

vinos que completan la FML antes. Los vinos producidos de esta forma son ms estables
desde el punto de visto microbiolgico, ya que el dixido de azufre puede aadirse antes
en el vino y los azcares glucosa y fructosa no estarn presentes. La tcnica de la
induccin simultnea de la FA y la FML en mostos blancos con un pH bajo ha dado unos
resultados muy satisfactorios.

Recientemente, la literatura francesa ha mencionado la posibilidad de realizar una

inoculacin simultnea (12) de levaduras y bacterias en mostos. Se ha utilizado una
variante de esta tcnica en la regin de Champagne para la aclimatacin de los cultivos
de bacterias malolcticas estndar durante las fases iniciales del proceso de pie de
cuba. El procedimiento, tal y como se utiliza en esta regin, se produce en dos pasos e
implica la adicin de levaduras para evitar el crecimiento de contaminantes Lactobacillus
durante la aclimatacin de las bacterias malolcticas deseadas. Los cultivos bacterianos
empleados en la regin de Champagne no se aclimatan durante su fabricacin y, por
tanto, no resultan adecuados para su inoculacin directa en el vino. Durante el proceso de
aclimatacin en dos pasos, el paso 1 de reactivacin va seguido del paso 2 de pie de
cuba malolctico en el que las BML se aclimatan lentamente a las duras condiciones del
vino.

El procedimiento pie de cuba malolctico slo result difcil y largo, pero el primer paso
tuvo que realizarse en el laboratorio. En 1993, Michel Valade et al. (13) propusieron un
protocolo ms sencillo para la reactivacin bacteriana. Adaptaron las bacterias a
concentraciones crecientes de etanol hacindolas crecer en mosto diluido suplementado

7
con nutrientes de BML y levaduras secas activas, controlando al mismo tiempo el pH
entre 3,2 y 3,5. Este procedimiento fue una simplificacin muy bien acogida del paso de
pie de cuba malolctico. Los autores no detectaron una produccin excesiva de cidos
actico y lctico (picado lctico), pero advirtieron que este procedimiento de reactivacin
no era comparable a la coinoculacin del vino. En la actualidad, los investigadores
franceses reconocen las ventajas de la inoculacin simultnea de bacterias y levaduras
para la produccin de vinos Primeur, diseados para su consumo dos meses despus
de la vendimia. Este proceso permite que las BML adquieran tolerancia al alcohol durante
la fermentacin alcohlica, permitiendo al mismo tiempo que comience la FML durante el
ltimo tercio de la FA (14) y que termine rpidamente al final de la FA. El uso de este
mtodo promueve la temprana estabilizacin de los vinos, hace que puedan venderse
antes y minimiza la posibilidad de que se desarrollen organismos dainos como bacterias
lcticas y levaduras Brettanomyces. Esta tcnica, combinada con una satisfactoria
nutricin de las levaduras, asegurar una saludable fermentacin de las levaduras con
una buena cintica y permitir utilizar una cepa de levadura que soportar la FML. Es
esencial controlar el pH del mosto hasta aproximadamente 3,5 ya que, por encima de este
valor, los azcares se degradan ms fcilmente. Sin embargo, debe recordarse que
Oenococcus oeni no degradar los azcares hasta que no se haya consumido todo el
cido mlico.

INOCULACIN DE LOS CULTIVOS BACTERIANOS MALOLCTICOS DURANTE LA

FERMENTACIN ALCOHLICA

La ventaja de inocular las bacterias durante la FA puede explicarse por el hecho de que,
en esta fase, la mayor parte del SO2 est combinado por compuestos de carbonilo
producidos durante el crecimiento de las levaduras y la concentracin de alcohol todava
no ha alcanzado niveles txicos. Sin embargo, en esta fase pueden encontrarse los
niveles ms intensos de antagonismo inducido por levaduras por metabolitos como el
cido decanoico (15). Rosi et al (16) demostraron una reduccin de la viabilidad
bacteriana cuando la inoculacin se realiz en el punto medio de la fermentacin
alcohlica. Atribuyeron este descenso a factores como el agotamiento de los nutrientes, la
produccin de etanol y una bajada de pH provocada por la produccin de cido. Sus
resultados indican adems que la inoculacin en este punto de la fermentacin someter
a las bacterias a un fuerte antagonismo bacteriano que puede resultar insuperable. Las
investigaciones de Lallemand confirmaron estas conclusiones, y reforzaron el hecho de
que la inoculacin en el punto medio de la FA siempre dar lugar a una marcada
reduccin de la viabilidad y actividad bacteriana (Figura 5).

8
 Figura 5. Supervivencia del cultivo de iniciacin Lalvin 31 tras la inoculacin en
distintas fases de la FA

1,00E+08

1,00E+07

1,00E+06
cel. viables (ufc/ml)

1,00E+05
Inoc. simultanea
1 g/hl
1,00E+04 Inoc. 1/2 FA 1
g/hl
1,00E+03 Inoc. despus FA
1 g/hl

1,00E+02

1,00E+01

1,00E+00
0 20 40 60 80 100 120 140 160
Das

1999 Rieslaner blanco de vendimia tarda. pH 3,3, alcohol 12.5% v/v, 130C

INOCULACIN DE LOS CULTIVOS BACTERIANOS MALOLCTICOS DESPUS DE

LA FERMENTACIN ALCOHLICA

La inoculacin al final de la fermentacin alcohlica no plantea el riesgo de metabolismo

bacteriano heterofermentativo de los azcares y el consiguiente aumento de la acidez
voltil. Este tipo de inoculacin retardada evita gran parte de la toxicidad de los cidos
carboxlicos producidos, ya que su concentracin se reduce tras la FA (17). Las ventajas
de la inoculacin al final de la FA tambin pueden estar vinculadas a la disponibilidad de
nutrientes bacterianos que se han producido por la muerte de las levaduras y la posterior

9
autlisis (18). Sin embargo, la exposicin a los elevados niveles de etanol presentes en el
momento de la inoculacin tarda puede dar lugar a un retraso en la FML, especialmente
en los vinos producidos en climas clidos. Normalmente, las bacterias que se aaden
despus de la FML pueden alcanzar unas concentraciones de clulas comparables a
aquellas alcanzadas cuando se inoculan en el mosto si las condiciones del vino no son
limitadoras. En los casos en que existe una limitacin de nutrientes (vanse los requisitos
nutricionales) o cuando los parmetros qumicos del vino son limitantes, la adicin de un
sistema de nutrientes bacterianos ayudar a la FML. En los casos en los que los niveles
de alcohol superan los 15,5% v/v, los cultivo de inoculacin bacteriana deben aclimatarse
antes de la inoculacin en el vino. Pueden encontrarse protocolos de aclimatacin
especializados en la seccin prctica de esta publicacin.

INDUCCIN RETARDADA DE LA FML

En los ltimos 15 aos, la calidad de los cultivos bacterianos ha mejorado mucho. Los
cultivos de iniciacin disponibles para su inoculacin directa en el vino son fciles de
manipular y permiten un mejor control a lo largo de la FML. El uso de esta nueva
generacin de cultivos de iniciacin ML permite un inicio ms temprano, adems de una
rpida finalizacin de la FML. En la regin francesa de Borgoa, o en otras regiones
vincolas que producen sobre todo vinos Pinot Noir, un desarrollo rpido de la FML es
contrario a sus tcnicas tradicionales de vinificacin que se basan en una FML
espontnea en la primavera. El creciente uso de cultivos de iniciacin de la FML activos
para su inoculacin directa ha generado una FML ms rpida, pero tambin una
importante reduccin de la pigmentacin. Gerbaux (19) demostr la influencia del inicio
rpido y la velocidad de la finalizacin de la FML en la intensidad del color y la tonalidad
de vinos Pinot Noir como se puede ver en la Figura 6.

10
Figura 6. Influencia de la cintica de la FML en el color de vinos Pinot Noir

30 3,5

_ _ _ _Ac. Mlico (g/l)

28
3
26
24 2,5
Tonalidad

22 2
20
1,5
18
16 1
14
0,5
12
10 0
0 30 60 90 120 150 180
Tiempo (das)

Gerbaux, Enoforum Piacenza, 2005

Se logr una mayor estabilizacin del color cuando se cumplan las siguientes
condiciones:

1. Aumento del tiempo entre el descube o la eliminacin de las las fermentativas ms

gruesas y el comienzo de la FML
2. Reduccin de la velocidad de la FML
3. Retraso en la adicin de SO2 hasta la finalizacin de la FML

Como generalidad, todas las tcnicas de vinificacin que inhiben o retrasan la FML, o sea,
mayores niveles de SO2, temperaturas inferiores a 10C o adicin de Lisozima en
cualquier fase de la produccin de vino, ayudarn a estabilizar la prdida de color en
vinos ligeramente pigmentados como el Pinot Noir o el Sangiovese.

Los consumidores de vino de todo el mundo demandan vinos con un color estable y esto
ha dado lugar a un creciente uso de la tcnica de microoxigenacin en la vinificacin. La
microoxigenacin provoca la formacin de pequeas cantidades de etanal (acetaldehdo)
que mejoran la polimerizacin de los polifenoles, lo que genera una estabilizacin del
color. As pues, una vez completada la microoxigenacin, el color del vino tinto se

11
estabiliza y esto minimiza la prdida de color atribuida a la FML. Se sabe que la
microoxigenacin retrasa el inicio de la FML, lo que implica que la inoculacin de
bacterias malolcticas debera intentarse nicamente una vez que haya finalizado la
microoxigenacin. La bacteria malolctica Oenococcus oeni consumir el acetaldehdo, lo
que hace posible la depuracin de cantidades residuales de este compuesto en el vino.
Por tanto, la induccin de la FML despus de la microoxigenacin tendr la ventaja
adicional de reducir los niveles de acetaldehdo.

Cuando se emplea la microoxigenacin en climas clidos para producir vinos tintos con
unos elevados niveles de pH, se recomienda una induccin retrasada de la FML. Para
lograrlo, se recomienda utilizar Lisozima (20) o una combinacin de Lisozima y SO2.

A modo de conclusin cabe decir que lo ms probable es que no exista un enfoque

universal para la induccin de la FML por inoculacin de bacterias. Como indicaron Silver
y Madej (21), el momento ms conveniente para la inoculacin depende de muchos
factores de vinificacin, siendo los ms importantes la composicin del mosto, la cepa de
levadura empleada para producir el vino y las tcnicas de vinificacin.

12
BIBLIOGRAFA

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