Anda di halaman 1dari 9

D.

HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN ACARA 2


1. Hasil Pengamatan

Menghaluskan sampel daun Memindahkan sampel yang


dengan mortal dan pastel telah halus ke dalam tabung
dengan menambahkan buffer steril

+ 400l + 4 l + 130l
AP1 RNAse A P3

Menginkubasi pada suhu 65oC Menambahkan 130l buffer P3,


selama 10 menit. Balik tube 2-3 kemudian diinkubasi di kulkas
kali selama inkubasi selama 5 menit

Kemudian lisat disentrifugasi Mengambil lisat dengan pipet


pada kecepatan 14.000 RPM masukkan ke dalam
selama 5 menit QIAshredder spin column yang
ada dalam 2 ml tube collection.
Lalu disentrifugasi pada Pindah flow-through ke tube
kecepatan 14.000 RPM selama baru tanpa mengganggu pellet
2 menit

sampel Dnasy mini spin column

Pindahkan 650 l dari Centrifugasi selama 1 menit


campuran ke dalam Dnasy mini pada 8.000 rpm. Buang flow-
spin column yang ada di 2 ml through. Ulangi langkah ini
tube collection dengan sampel sisanya

+ 500 l
AW2

Menempatkan spin column ke


Sentrifugasi dengan kecepatan
dalam 2 ml tube collection baru.
8.000 RPM selama 1 menit
Tambahkan 500 l buffer AW2
+ 500 l
buffer
AW2

Memindahkan spin column ke 2 Menambahkan 500 l buffer


ml microcentrifuge tube baru AW2 yang lain. Sentrifugasi
selama 2 menit dengan
kecepatan 14.000 rpm

+ 100 l + TE 150
buffer AE l
elusi Gambar 1.8 Tahap Isolasi DNA
Menambahkan 100 l buffer Ulangi langkah sebelumnya.
AE elusi. Inkubasi selama 5 Tambahkan TE 150 l, simpan
menit pada suhu ruang (15- pada kulkas
25C). Sentrifugasi selama 1
menit pada kecepatan 8.000
rpm

2. Pembahasan
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan untuk memisahkan DNA dari
bahan lain seperti protein, lemak, dan karbohidrat. Prinsip dasar isolasi
DNA /RNA dari jaringan adalah dengan memecah dan mengekstrasi jaringan
tersebut sehingga akan terbentuk ekstrak sel yang terdiri DNA, RNA dan
substansi dasar lainnya. DNA yang diperoleh nantinya dapat digunakan untuk
tahap replikasi atau penggandaan DNA.
Isolasi DNA dapat dilakukan melalui tahapan-tahapan antara lain:
preparasi esktrak sel, pemurnian DNA dari ekstrak sel dan presipitasi DNA.
Meskipun isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi
pada setiap jenis atau bagian tanaman dapat memberikan hasil yang berbeda,
hal ini karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi
tinggi yang dapat menghambat pemurnian DNA.
Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Proses isolasi
ini bertujuan untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak
diinginkan. Menurut Irawan (2014) pada tahap preparasi ekstrak DNA ini
terjadi proses perusakan atau penghancuran membran dan dinding sel.
Pemecahan sel (lisis) merupakan tahapan yang bertujuan untuk mengeluarkan
isi sel. Tahap penghancuran sel atau jaringan ini dapat dilakukan dengan
dengan cara fisik (menggerus sampel dengan mortar dan pestle dalam
nitrogen cair atau dengan menggunakan metode freezing-thawing dan
iradiasi ), kimiawi (penggunaan detergen yang dapat melarutkan lipid pada
membran sel), dan enzimatik (menggunakan proteinase K seperti untuk
melisiskan membran pada sel darah).
Tahapan kedua yaitu pemurnian atau purifikasi DNA. Dikamigi (2010)
menjelaskan bahwa tahapan purifikasi pada isolasi DNA bertujuan untuk
membersihkan sel tanaman dari zat-zat lainnya. Tahapan purifikasi pada
isolasi DNA tanaman dilakukan dengan pemberian etanol absolut dingin dan
RNAse. Fungsi pemberian etanol absolut dingin adalah agar DNA terpisah
dari zat lainnya dan tidak menghancurkan DNA. RNAse berfungsi untuk
mendegradasi RNA, sehingga hanya DNA yang terlihat. Tahap selanjutnya
pada isolasi DNA darah yaitu tahap presipitasi.
Tahapan yang ketiga yaitu presipitasi atau pengendapan DNA.
Dikamigi (2010) menambahkan, presipitasi merupakan langkah yang
dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen dari campuran. Tahap
presipitasi yang dilakukan dengan cara meneteskan larutan presipitasi
protein dan kemudian divorteks. Larutan presipitasi protein terdiri atas
amonium asetat yang jika berikatan dengan protein mengakibatkan
terbentuknya senyawa baru yang memiliki kelarutan yang lebih rendah,
sehingga menyebabkan protein mengendap. Larutan tersebut kemudian
disentrifugasi kembali. Supernatant yang berisi DNA kemudian dituangkan
ke dalam tabung berisi isopropanol dingin. Pemberian isopropanol bertujuan
untuk visualisasi DNA. Selanjutnya tabung disentrifugasi kembali. Hasil dari
sentrifugasi adalah terdapatnya pellet DNA pada dasar tabung yang
kemudian ditambahkan etanol 70% dan dibolak-balik kembali. Pemberian
etanol bertujuan untuk membersihkan DNA dari pengotor-pengotornya.
Langkah terakhir adalah dengan pemberian Tris-EDTA yang bertujuan untuk
melarutkan kembali DNA untuk dipreservasi.
Proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti
merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga
menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol
terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi
RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan
protein. Proses pemanasan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan
mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk
memdegradasi protein dan dinding sel.
Kirsman (2010) berpendapat, meskipun isolasi DNA dapat dilakukan
dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap jenis atau bagian tanaman
dapat memberikan hasil yang berbeda, hal ini dikarenakan adanya senyawa
polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang dapat menghambat
pemurnian DNA. Jika isolasi DNA dilakukan dengan sample buah, maka
kadar air pada masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang
berbeda-beda pula. Semakin tinggi kadar air, maka sel yang terlarut di dalam
ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan
sedikit (Kirsman, 2010).

CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide menurut Tohib (2012)


merupakan sejenis deterjen yang dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi
protein, memisahkan karbohidrat, merusak membran sel dan melarutkan
DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi sel dapat keluar
termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi.Dalam proses
isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti
merchaptoetanol dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga
menghambat aktivitas radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol
terhadap asam nukleat. Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi
RNA dari senyawa quinon, disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan
protein. Proses pemansan pertama bertujuan untuk melarutkan CTAB dan
mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang kedua bertujuan untuk
memdegradasi protein dan dinding sel.

Fungsi Chloroform dan isoamilalkohol (CIAA) menurut Asris (2010)


yaitu untuk mengekstrak dan dan mengendapkan komponen polisakarida di
dalam buffer ektraksi yang mengkontaminasi larutan DNA.Pemberian
isopropanol dan etanol dilakukan agar terjadi dehidrasi DNA sehingga
terjadi presipitasi.Setelah pemberian etanol, pellet yang dipeoleh
dikeringanginkan. Hal ini bertujuan untuk mengeringkan pellet dari sisa-sisa
buffer maupun etanol.Tahapan terakhir dari ektraksi ini adalah penambahan
buffer TE. Buffer TE tris electrophoresisberfungsi untuk melarutkan DNA
yangdihasilkan dan menjagaDNA agar tidak mudah rusak.Dalam buffer TE
mengandung EDTA atau Ethylene Diamine Tetra Acid yang berfungsi
sebagai senyawa pengkelat yang mengikat ion Magnesium, yaitu kofaktor
yang diperlukan untuk altivtas berbagai enzim nuclease. Metode ekstraksi
DNA dengan CTAB akan menghasilkan pita DNA yang berukuran tebal dan
dapat memisahkan DNA dari polisakarida karena adanya perbedaan
karakteristik kelarutan (differensial of solubility). Disamping deperoleh
fragmen DNA, dengan metode CTAB juga akan diperoleh RNA dengan pita
tipis yang terletak jauh berada di bawah pita DNA. Keberadaan pita RNA
tergantung bahan yang diekstraksi.

Metode yang digunakan pada isolasi DNA adalah metode Doyle and
Doyle dan metode Nandariyah (2007). Metode ini dimulai dengan
menghaluskan daun salak yang akan diisolai DNAnya menggunakan mortal
dan pestle. Setelah itu dimasukkan dalam mikrotube dan menambahkan 400
l buffer AP1 dan 4 l RNAse A, kemudian menghomogenkan lalu
dimasukkan kedalam water bath selama 10 menit pada suhu 65C dengan
membalik tube 2-3 kali selama inkubasi berlangsung. Setelah inkubasi,
menambahkan 130 l buffer P3 kemudian diinkubasi di kulkas selama 5
menit. Setelah inkubasi, lisat disentrifugasi selama 5 menit dengan
kecepatan 14.000 rpm. Lisat diambil menggunakan pipet dan dimasukkan
dalam QIAshredder spin column yang ada di dalam 2 ml tube collection, lalu
disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 14.000 rpm. Setelah
disentrifugasi, flow-through dipindah ke tube baru tanpa menggangu pellet.
Langkah selanjutnya yaitu memindahkan 650 l dari campuran ke dalam
DNasy mini spin column yang ada di 2 ml tube collection, kemudian
disentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 8.000 rpm dan membuang
flow-through. Spin column dipindahkan ke dalam 2 ml microcentrifuge tube
baru. Langkah selanjutnya yaitu menambahkan 500 l buffer AW2 dan
larutan disentrifugasi selama 2 menit dengan kecepatan 14.000 rpm.
Menambahkan 100 l buffer AE elusi kemudian larutan diinkubasi selama 5
menit pada suhu ruang (15C-25C). Larutan disentrifugasi selama 1 menit
pada kecepatan 8.000 rpm. Langkah selanjutnya yaitu menambahkan TE 150
l dan menyimpan larutan pada kulkas. Maka jadilah isolat DNA yang
selanjutnya dapat digunakan untuk analisis DNA. Sampel yang digunakan
adalah salak, yang merupakan tanaman tahunan. Sampel diambil dari bagian
daun tanaman ini. Menurut Ogunkanmi et al (2008) ekstraksi DNA menjadi
semakin sulit ketika menggunakan tanaman tahunan dan perennials.
Beberapa faktor yang menjadi penghambat isolasi DNA murni pada sejenis
tanaman tersebut antara lain: terpenes, polyfenol, dan polisakarida.
Salah satu cara yang dapat dilakukan untuk mendapatkan DNA
berkualitas baik menurut Mulyani (2011) yaitu dengan metode isolasi CTAB
dengan phenol merupakan metode yang menggunakan CTAB sebagai buffer
lisis yang berperan untuk memecah membran sel inang untuk mengeluarkan
DNA genom. Pada tahap pemurnian DNA dilakukan penambahan phenol :
kloroform : isoamil alkohol yang berfungsi untuk menghilangkan senyawa-
senyawa yang dapat mengkontaminasi DNA. Hasil isolasi DNA
menggunakan metode CTAB dengan phenol dapat menghasilkan DNA yang
berkualitas baik yang ditunjukkan dengan adanya pita DNA genom.
DAFTAR PUSTAKA

Asris 2010. Definisi Isolasi DNA dan Manfaat Isolasi DNA.http://asris07.


Student.ipb.ac.id. Diakses pada tanggal 2 April 2017
Dikamigi 2010. Isolasi DNA dari sampel darah, tanaman dan khamir.
http://dikamigi.blogspot.co.id/. Diakses 26 Maret 2017.
Irawan H 2014. Analisis DNA. http://hery-irawan-fpk11.web.unair.ac.id/. Diakses 26
Maret 2017.
Kirsman, 2010.Isolasi DNA Buah.http://kirsman83.weebl..com. Diakses pada tanggal
26 Maret 2017
Mulyani Y, Purwanto A, Nurruhwati I 2011. Perbandingan beberapa metode isolasi
DNA untuk deteksi dini Koi Herpes Virus (KHV) pada ikan mas
(Cyprinus carpio L.). J Akuatika 2(1):1-16.
Ogunkanmi AL, Oboh B, Onifade B, et al. 2008. An improved method of extracting
genomic DNA from preserved tissues of Capsicum annuum for PCR
amplification. EurAsian Journal of BioSciences Vol 2: 115-119.
Tohib, 2012. Macam Metode Isolasi DNA. http://www.tohib.web.id. Diakses pada
tanggal 26 Maret 2017