Anda di halaman 1dari 9

LAPORAN PRAKTIKUM KI3261

METABOLISME DAN INFORMASI GENETIK


PERCOBAAN 07
ISOLASI DAN AMPLIFIKASI DNA
DENGAN TEKNIK PCR (POLYMERASE CHAIN REACTION)

Nama : Aviv Sigit Cahyono


NIM : 10513035
Kelompok : Kelompok I
Tanggal Percobaan : 12 April 2017
Tanggal Pengumpulan : 19 April 2017
Asisten : Yessy

LABORATORIUM BIOKIMIA
PROGRAM STUDI KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
2017
Isolasi dan Amplifikasi DNA
Dengan Teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)

Aviv Sigit Cahyono


NIM : 10513035
Kelompok : 01
Asisten : Yessy
avivsigitcahyono@gmail.com

Abstrak

(Polymerase Chain Reaction, PCR) adalah suatu metode enzimatis untuk amplifikasi DNA dengan cara
in vitro. Pada proses PCR diperlukan beberapa komponen utama adalah DNA cetakan, Oligonukleotida
primer, Deoksiribonukelotida trifosfat (dNTP), Enzim DNA Polimerase, dan Komponen pendukung
lain adalah senyawa buffer. Pada proses PCR menggunakan menggunakan alat termosiklus. Sebuah
mesin yang memiliki kemampuan untuk memanaskan sekaligus mendinginkan tabung reaksi dan
mengatur temperatur untuk tiap tahapan reaksi. Ada tiga tahapan penting dalam proses PCR yang selalu
terulang dalam 30-40 siklus dan berlangsung dengn cepat yaitu denaturasi, anneling, dan pemanjangan
untai DNA. Produk PCR dapat diidentifikasi melalui ukurannya dengan menggunakan elektroforesis
gel agarosa. Teknik PCR dapat dimodifikasi ke dalam beberapa jenis diantaranya : PCR- RFLP, PCR
RAPD, nested- PCR,Quantitative PCR, RT- PCR dan inverse PCR. Keunggulan PCR dikatakan
sangat tinggi. Hal ini didasarkan atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya.

Kata kunci: PCR, In vitro, Elektroforesis, Teknik PCR


Abstract

(Polymerase Chain Reaction, PCR) is an enzymatic method for the amplification of DNA by
means of in vitro. In the PCR process takes several main components is DNA template,
oligonucleotide primers, Deoksiribonukelotida triphosphate (dNTP), DNA polymerase
enzymes, and other supporting components are buffer compounds. In using the PCR process
using termosiklus tool. A machine that has the ability to heat the reaction tube at once cool
and regulate the temperature for each stage of the reaction. There are three important stages
in the process of PCR which always recur in cycles and lasts 30-40 with less rapid namely
denaturation, anneling, and elongation of DNA strands. PCR products can be identified by its
size using agarose gel electrophoresis. The PCR technique can be modified into several types
including: PCR- RFLP, PCR - RAPD, PCR nested-, Quantitative- PCR, RT-PCR and inverse
- PCR. The advantages of PCR said to be very high. It is based on the specificity, efficiency
and accuracy.

Keywords: PCR, In vitro, Electrophoresis, PCR technique

1. PENDAHULUAN DNA polymerase dengan keberadaan


deoksinukleosida trifosfat (dNTPs). Proses ini akan
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu menghasilkan rantai DNA baru yang
teknik in vitro yang dapat mengamplifikasi bagian berkomplemen dengan rantai templat sehingga
DNA tertentu yang berada di anatra dua bagian menghasilkan rantai DNA untai ganda baru.
urutan DNA dan ditemukan oleh Kary Mullis pada Sintesis rantai DNA dapat diulang melalui proses
1985. Penemuan ini mengantarkan Kary Mullis denaturasi termal molekul DNA untai ganda,
menerima hadiah nobel kimia pada 1993 (Newton, penempelan primer pada DNA dan perpanjangan
1997). 16S rDNA adalah suatu gen yang mengkode primer oleh DNA polimerase pada temperatur yang
16 rRNA, yaitu: suatu komponen 30S dari ribosom. sesuai dengan kerja enzim. Pada prokaryota
Isolasi gen 16S rDNA dilakukan dengan terdapat tiga jenis RNA ribosomal, yaitu 5S, 16S,
mengamplifikasi urutan nukleotida gen dengan dan 23S rRNA. Di antara ketiganya, 16S rRNA
teknik PCR. Amplifikasi DNA dengan PCR dapat yang paling sering digunakan. Molekul 5S rRNA
dilakukan menggunakan primer oligonukleotida memiliki urutan basa terlalu pendek, sehingga tidak
atau disebut juga amplimer. Primer ini adalah suatu ideal dari segi analisis statistika, sementara molekul
molekul DNA untai tunggal pendek yang 23S rRNA memiliki struktur sekunder dan tersier
berkomplemen dengan ujung urutan DNA templat. yang cukup panjang sehingga menyulitkan analisis.
Primer akan diperpanjang pada DNA templat oleh Analisis gen penyandi 16S rRNA telah menjadi
prosedur baku untuk menentukan hubungan dalam tabung 3 sebagai kontrol positif. Lalu,
filogenetik dan menganalisis suatu ekosistem. 16S dimasukkan semua tabung ke dalam mesin PCR.
rRNA dapat digunakan sebagai penanda molekuler
karena molekul ini bersifat ubikuitus dengan fungsi C. Elektroforesis Agarosa
yang identik pada seluruh organisme. Molekul ini Elektroforesis agarosa dilakukan untuk
juga dapat berubah sesuai jarak evolusinya, menganalisis ukuran fragmen DNA. Gel agarosa
sehingga dapat digunakan sebagai kronometer
dibuat dengan melarutkan 0,75% agarosa ke dalam
evolusi yang baik. Dua molekul 16S rRNA
memiliki beberapa daerah yang memiliki urutan buffer TAE 1x (Tris-asetat 0,04 M; Na2EDTA 0,001
basa yang relatif konservatif dan beberapa daerah M pH 8) dengan cara pemanasan. Digunakan
urutan basanya variatif. Perbandingan urutan basa larutan hingga suhu -50C. kemudian ditambahkan
yang konservatif berguna untuk mengkonstruksi EtBr sebanyak 0,5 L. Larutan ditunangkan ke
pohon filogenetik universal karena mengalami dalam cetakan gel dan dibiarkan hingga membeku.
perubahan relatif lambat dan mencerminkan Setelah beku, gel diletakkan ke dalam alat
kronologi evolusi bumi. Sebaliknya, urutan basa
elektroforsis (Bio-Rad) kemudian diisi dengan
yang bersifat variatif dapat digunakan untuk
melacak keragaman dan menempatkan galur-galur buffer TAE 1x hingga tanda batas. Sampel yang
dalam satu spesies. Saat ini dikembangkan metode akan di elektroforesis disiapkan dengan
identifikasi berbasis molekuler yang lebih cepat mencampurkan larutan sampel dan larutan
dengan tingkat sensitivitas dan spesifisitas yang pemberat (bromfenol biru 0,1 (b/v) dan sukrosa
tinggi, yaitu dengan analisis sekuensing gen 16S 40% (b/v)) dengan poerbandingan volum 5:1.
rRNA (16S ribosomal Ribonucleic acid/Asam Pencampuran dilakukan di atas lembar parafilm.
ribonukleat pengkode ribosom 16S, S menyatakan
Elektroforesis dilakukan pada tegangan 80 V
Svedberg, yaitu satuan ukuran ribosom). Gen 16S
rRNA juga sering disebut sebagai 16S rDNA (16S selama 35 menit.
ribosomal deoxyribose nucleatic acid), namun
menurut konsensus dari American Society for 3. HASIL DAN PEMBAHASAN
Microbiology (ASM), istilah 16S rRNA dinilai
lebih tepat. Tujuan percobaan ini adalah Hasil Pengamatan
mengisolasi dan memperbanyak fragmen gen 16S
rDNA dari koloni tunggal dengan metode
Polymerase Chain Reaction (PCR) dan menentukan
massa molekul fragmen gen 16S rDNA dengan
metode elektroforesis gel agarosa.

2. METODE PERCOBAAN

A. Lisis sel bakteri


Sebanyak 40 L ddH2O steril dipipet ke dalam
tabung mikro 1,5 mL. Bakteri diinokulasi dari
cawan petri menggunakan tusuk gigi steril ke dalam
tabung yang telah berisi air trsebut. Lalu didihkan
campuran sampel selama 10 menit menggunakan Pembahasan
penangas air. Didiamkan sampel sampai suhunya Pada percobaan ini, dilakukan isolasi dan
sama dengan hingga suhu ruang. Dilakukan memperbanyak fragmen gen 16S rDNA dari koloni
sentrifuga sampel dengan kecepatan 12.000 x g tunggal dengan menggunakan teknik Polymerase
selama 1 menit. Diambil supernatannya dan Chain Reaction (PCR). 16S rDNA adalah subunit
dipisahkan ke alam tabung mikro yang steril. ribosom yang dapat digunakan sebagai pembeda,
penanda dan sebagai tanda evolusi pada bakteri.
B. Amplifikasi DNA dengan PCR
Molekul ini dapat berubah sesuai dengan waktu
Supernatan yang telah diperoleh digunakan
evolusinya sehingga dapat digunakan sebagai
sebagai DNA templat. Dipipet campuran reaksi 4x
kronometer evolusi yang baik. Molekul 16S rDNA
didalam tabung mikro 200 L kemudian disiapkan
memiliki susunan basa yang relatif konservatif dan
3 tabung mikro 200 L, aliquot 24,55 L ke dalam
juga variatif. Urutan basa yang variatif ini dapat
masing-masing tabung dari campuran reagen yang
digunakan untuk mengetahui keragaman galur-
tlah dibuat. Dimasukkan 0,5 L DNA tempalt ke
galur dalam satu spesies. Gen 16s rDNA yang
dalam tabung 1 (sampel), ddH2O dalam tabung 2
diisolasi berasal dari E. coli yang memiliki jumlah
sebagai kontrol negatif, dan DNA kromosom ke
pasang basa sekitar 1500. E. coli merupakan salah fosfat pada 5 DNTP yang ditambahkan. Oleh
satu bakteri yang termasuk bakteri gram negatif. karena itu, proses penambahan DNTP berlangsung
Gram negatif adalah bakteri yang akan berwarna dengan arah 5 ke 3. Dalam prosesnya PCR
merah atau merah muda ketika proses pewarnaan melibatkan beberapa teknik yaitu yaitu pre-
gram, sedangkan gram positif adalah bakteri yang denaturasi DNA templat, denaturasi DNA templat,
mempertahankan zat warna violet ketika proses penempelan primer, pemanjangan primer,
pewarnaan gram (Madigan, 2006). pemantapan (post extension). Tahap kedua hingga
Gen 16S rRNA adalah gen yang bersifat lestari keempat merupakan tahapan berulang (siklus).
(conserved) dan dijumpai pada setiap organisme. Denaturasi atau pemisahan ikatan untai ganda DNA
Struktur yang lestari ini menyebabkan gen 16S dilakukan dengan menaikkan suhu pada 95-98oC
rRNA dapat digunakan dalam PCR dan analisis sehingga dihasilkan dua untai tunggal DNA.
sekuensing. Dalam struktur gen ini terdapat Apabila dalam DNA target mengandung banyak
sejumlah basa yang disebut hypervariable region nukleotida G atau C, suhu denaturasi dapat
untuk merupakan ciri khas yang membedakan tiap ditingkatkan. Dua untai DNA yang dihasilkan ini
organisme. Gen pengkode rRNA adalah gen yang akan digunakan sebagai templat. Penempelan
mampu mempertahankan kelestariannya selama primer terjadi pada kondisi suhu yang diturunkan
jutaan tahun keanekaragaman evolusi. Sebagian menjadi 37-50oC tergantung dari DNA yang
besar prokariot memiliki 3 jenis rRNA, yaitu 5S, digunakan. Penurunan suhu ini berfungsi untuk
16S dan 23S. Penggunaan 5S rRNA juga sudah mengikatkan primer dengan untai tunggal DNA
dipelajari namun gen ini terlalu kecil untuk templat yang berkomplemen dengan primer
digunakan dalam penentuan filogenetik. Gen 16S tersebut. Perpanjangan primer dengan
dan 23S rRNA memiliki ukuran yang cukup untuk memanfaatkan DNA polimerase, enzim ini dapat
dianalisis. Gen 16S rRNA berukuran sekitar 1550 mensintesis komplemen dari untai tunggal DNA
pasang basa dan sekitar 500 basa di bagian ujung dari ujung 3 yang didahului dengan proses
sekuens merupakan daerah yang disebut dengan penempelan primer. Pada tahap ini suhu dinaikkan
hypervariable region. Daerah inimerupakan bagian hingga 72oC. Akhir dari siklus pertama ini adalah
yang membedakan antar organisme. Primer yang dihasilkan dua untai ganda DNA. Pada percobaan
digunakan dalam amplifikasi sekuens akan ini tahapan reaksi PCR digunakan suhu 95 oC
mengenali daerah yang lestari dan mengamplifikasi sebagai suhu predenaturasi untuk menyakinkan
hypervariable region, dengan demikian akan bahwa molekul DNA target yang ingin dilipat
diperoleh sekuens yang khas pada organisme gandakan jumlahnya benar-benar terdenaturasi.
tersebut. Kemudian 48oC untuk anneling dan 72oC untuk
PCR adalah teknik amplifikasi DNA secarain pemanjangan rantai primer. Sedangkan suhu 95 oC
vitro yang dikembangkan oleh Karry Mullis. yang kedua adalah suhu untuk memisahkan untai
Dengan menggunakan teknik ini dapat pula ganda DNA pada siklus-siklus selanjutnya dan 72 oC
dilakukan amplifikasi segmen DNA dalam juta- yang kedua adalah untuk mengecek kembali urutan
jutaan kali hanya dalam beberapa jam (Handoyo, basa DNA ketika polimerisasi berjalan. Jumlah kopi
2000). Daerah yang diperbanyak dibatasi oleh dua fragmen DNA (amplikon) yang dihasilkan dengan
buah primer oligonukleotida. Pada teknik ini menggunakan teknik PCR ini dapat ditentukan
dibutuhkan DNAuntai ganda yang berfungsi dengan perumusan: Y = ( 2n 2n), dimana XX =
sebagai cetakan yang mengandung DNA target jumlah molekul DNA templat awal; n = jumlah
untuk pembentukan molekul DNA baru, enzim siklus; Y = jumlah amplikon.
DNA polierase, deoksinukleosida trifosfat (dNTPs) Siklus PCR yang terjadi sebagai berikut:
dan sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi 1). Denaturasi, 2). Annealing dan 3). Elongasi,
tertentu, primer akan mengenali dan berikatan 4). Siklus pertama selesai
dengan untaian DNA komplemennya yang terletak
pada awal dan akhir fragmen DNA target. Setelah
kedua primer menempel pada DNA templat, DNA
polimerase akan mengkatalisis pemanjangan kedua
primer dengan menambahkan nukleotida yang
komplemen dengan urutan DNA templat. DNA
polimerase mengkatalisis pembentukan ikatan
fosfodiester antara OH pada karbon 3 dengan
dahulu, apabil urutan DNA yang dituju belum
diketahui maka dapat dilakukan analisis homologi
dari urutan DNAyang memiliki kekerabatan
terdekat. Perancangan primer harus memenuhi
beberapa kriteria yaitu panjang primer, komposisi
primer, titik leleh. Primer yang digunakan biasanya
berkisar 18-30 basa. Apabila digunakan primer
yang pendek maka kemungkinan terjadinya
mispriming (penempelan primer pada tempat yang
salah) akan tinggi yang akan mempengaruhi
efisiensi proses PCR, sedangkan bila digunakan
primer panjang (lebih dari 30 basa) tidak akan
meningkatkan spesifisitas primer.
Dalam percobaan ini digunakan ddH2O (aqua
bidestilasi atau ultra pure water) namun sebenarnya
Dalam melakukan percobaan dengan teknik juga dapat menggunakan buffer TAE yang
PCR ini digunakan beberapa reagen yaitu DNA merupakan campuran antara larutan Tris-HCl
templat, primer maju (primer forward), primer dengan EDTA pada konsentrasi tertentu. Keduanya
mundur (primer reverse), ddH2O, dream Taq dapat dilakukan untuk melarutkan DNA atau RNA.
polymerase, dNTP dan Buffer dream Taq DNA akan lebih stabil apabila dilarutkan dalam
polymerase. DNA templat sebagai cetakan dalam TAE buffer karena dijaga pada pH 8. Jika
pembentukan molekul DNA baru, DNA templat ini menggunakan ddH2O akan menimbulkan
dapat diperoleh dengan menggunakan metode lisis perubahan pH karena DNA memiliki sifat asam
sel adalah perusakan dinding sel namun tanpa lemah dan dapat menyebbakan degradasi DNA.
merusak DNA yang menjadi target. Dalam Namun, dalam kasus penggunaan PCR ddH2O
percobaan yang dilakukan lisis sel dilakukan lebih unggul karena tidak mengandung chelating
dengan penambahan air, pemanasan dan agent, sedangkan TAE buffer mengandung EDTA
pengadukan secara makanik. Namun tidak hanya yang dapat berkompleks dengan ion Mg2+ sehingga
itu, metode lisis juga dapat dilakukan dengan mengganggu kerja enzim Taq polymerase.
menggunakan buffer lisis, komposisi yang Pada enzim polimerase DNA yang digunakan
digunakan tergantung pada jenis sampel. Contoh dalam percobaan ini adalah dream Taq polymerase
buffer lisis adalah buffer K yang memiliki yang diisolasi dari bekteri Thermus aquaticus.
komposisi buffer PCR (50mM KCl, 10-20mM Tris- Enzim ini berfungsi sebagai katalis untuk reaksi
Cl dan 2,5mM MgCl2); 0,5 % Tween-20 dan 100 polimerisasi DNA. Enzim yang digunakan untuk
ug/mL Proteinase-K. Cara lain adalah isolasi DNA PCR berasal dari bakteri termofilik dan hiper
kromosom atau plasmid adalah dengan memecah termofilik sehingga bersifat termostabil sampai
dinding sel kemudian DNA kromosom atau plasmid temperature 95oC. Deoxynucleotide triphosphates
dipisahkan dari komponen lain sehingga memiliki (dNTPs) terdiri dari dATP, dTTP, dCTP dan dGTP
kemurnian yang tinggi. yang bertindak sebagai building block DNA dan
Primer yang digunakan dalam percobaan kali ini diperlukan dalam proses perpanjangan. dNTP akan
adalah primer maju (primer forward), primer menempel pada gugus OH pada ujung 3 dari
mundur (primer reverse). Primer mundur memiliki primer dan memebentuk untai baru yang
urutan 5'-GGTTAC(G/C)TTGTTACGACTT-3' dan berkomplemen dengan untai DNA templat
primer maju memiliki urutan 5'- (Handoyo, 2000). Buffer dream Taq polymerase
AGAGTTTGATC(A/C) TGGCTCAG-3' berfungsi untuk menjaga pH medium karena
(Nurachman, 2010). Primer ini akan menempel reaksidalam PCR hanya akan berlangsung pada
padaujung untai tunggal DNA templat. Setelah itu kondisi pH tertentu. Pada percobaan ini juga
primer akan mengalami polimerisasi dari tempat ditambahkan MgCl2 karena untuk menstimulasi
penempelannya pada 3 ke 5 DNA templat. aktivitas DNA polimerase membutuhkan Mg 2+
Sehingga pada akhirnya akan diperoleh dua pasang sebagai kofaktor yang berikatan dengan sisi aktif
untai ganda DNA apabila DNA templat sebelumnya dari enzim yaitu gugus karboksilat pada residu
berupa sepasang untai DNA. Untuk proses aspartat. Interaksi primer dengan templat akan
penempelan primer perlu ada perancangan terlebih
meningkat dan membentuk kompleks yang larut amplifikasi. Marker DNA yang berda pada
dengan dNTP. elektroforesis berfungsi sebagai penanda posisi
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan pasangan basa dari molekul. Metode elektroforesis
untuk memisahkan kemampuan atau molekul sebagai berikut:
bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat
migrasinya dalam sebuah medan listrik dialirkan
pada suatu medium yang mengandung sampel yang
akan dipisahkan. Teknik ini digunakan untuk
memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul. Prinsip gel elektroforesis agarosa
adalah suatu elektroforesis DNA dimana teknik
untuk memisahkan sampel dna berdasarkan berat
molekul ddan struktur fisik molekulnya. Molekul
DNA bermuatan negatif sehingga di dalam medan
listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju
kutub positif. Digunakan gel agaraosa karena
memiliki kemampuan untuk menampung fragmen
yang lebih besar dan bertindak sebagai medium
penyongkong dalam proses elektroforesis.
Kecepatan migrasi suatu molekul bergantung pada Pada percobaan ini digunakan EtBr, dimana
muatan listrik, massa DNA, dan titik isoelektrik. EtBr adalah senyawa mutagenik dan karsinogenik
Gel elektroforesis yang sering digunakan adalah gel sehingga harus berhati-hati di dalam
poliakrilamida berfungsi untuk memurnikan menggunakannya. EtBr berfungsi sebagai pewarna
penanda oligonukleotida dan menganalisis hasil fluoresensi digunakan untuk alat identifikasi dan
ekstensi primer. Pada percobaan ini digunakan, gel mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang
agarosa karena gel agarosa mampu untuk terseparasi dalam gel. EtBr ini akan terikat diantara
memisahkan fragmen DNA yang berukuran besar. dua untai ganda DNA sehingga band DNA dalam
Proses running elektroforesis DNA sampel gel agarosa akan berpedar karena pewarna ini
bersamaan dengan DNA yang telah diketahui mengandung zat fluresence. Intensitas fluoresence
ukurannya dapat berguna dalam analisis. Fungsi dapat diukur dengan menggunakan DNA marker
TAE adalah sebagai running buffer dan merupakan standard sehingga diperkirakan kuantitas DNA-
buffer umum digunakan sebagai buffer Nya.
Kontrol negatif berfungsi untuk mengetahui
elektroforesis karena memiliki kapasitas buffering
kondisi reagen sehingga pada hasil elektrolisis
yang tinggi pada titik isoelektriknya. Tae buffer
seharusnya tidak diperoleh suatu pita DNA. Kontrol
mengandung komposisi di dalam pembuatannya,
positif berfungsi untuk mengetahui pita yang
yakni: Tris-asetat, EDTA, pH 8. Tri-asetat berfungsi
merupakan pita DNA sampel karena DNA
untuk membuat DNA tetap berada dalam bentuk
kromosom yang digunakan sudah diisolasi
bermuatan negatif. Fungsi EDTA adalah sebagai
sebelumnya sehingga seharusnya pada hasil
pengikat-pengikat logam dan menonaktifkan
elektroforesis diperoleh suatu pita DNA. Didalam
DNAse, yakni enzim pemutus DNA. Loading
kontrol positif dimasukkan DNA komosom
buffer berfungsi untuk membantu proses sampel
sehingga sampel yang di analisis di PCR akan
DNA turun ke dalam well dan bromfenol berfungsi
teramplikasi dan muncum. Sedangkan kontrol
untuk melihat jalannya elektroforesis dan sebagai
negatif dimasukkan ddH2O, sampel yang diketahui
pewarna. Sukrosa berfungsi untuk pemberat agar
apabila di PCR harusnya tidak akan muncul.
sampel DNA tenggelam ke dasar gel dan tidak
Apabila kontrol positif tidak muncul maka ada yang
melayang keluar. DNA yang akan dielektroforesis
salah pada alat PCR, mungkin master mix kappa
pada umumnya dicampur dengan loading dye yang
yang dibuat ada yang salah, enzimnya tidak masuk
berfungsi untuk memonitor mobilitas elektroforesis.
atau enzim yang digunakan udah rusak dan
Loading dye bermigrasi bersama molekul DNA
sebagainya. Jika kontrol negatif yang muncul
selama proses runnning elektroforesiss. Marker
berarti sampelnya terkontaminasi.
adalah segmen DNA yang spesifik dan telah
Pada percobaan ini, digunakan EtBr. EtBr
diketahui ukurannya. Marker berfungsi sebagai
adalah senyawa mutagenik dan karsinogenik
acuan untuk mengetahui ukuran DNA hasil
sehingga harus berhati-hati di dalam tubuh manapun kemudian dilakukan analisa
menggunakannya. EtBr berfungsi sebagai pewarna PCR untuk mengamplifikasi bagian-bagian
fluoresensi digunakan untuk alat identifikasi dan tertentu DNA yang disebut fingerprints alias DNA
mengukur semi-kualitatif fragmen DNA yang sidik jari, yaitu bagian yang unik bagi setiap orang.
terseparasi dalam gel. EtBr ini akan terikat diantara Hasilnya dibandingkan dengan DNA sidikjari
dua untai ganda DNA sehingga band DNA dalam keluarganya yang memiliki pertalian darah,
gel agarosa akan berpedar karena pewarna ini misalnya ibu atau bapak kandung. Jika memiliki
mengandung zat fluresence. Intensitas fluoresence kecocokan yang sangat tinggi maka bisa
dapat diukur dengan menggunakan DNA marker dipastikan identitas orang yang dimaksud.
standard sehingga diperkirakan kuantitas DNA- Konon banyak kalangan tertentu yang
Nya. memanfaatkan pengujian ini untuk menelusuri
Dari hasil elektroforesis agarosa diperoleh pita orang tua sesungguhnya dari seorang anak jika
DNA untuk kontrol positif dan marker pita DNA sang orang tua merasa ragu.
yang tidak terlalu jelas. Untuk kontrol negatif pita Dengan adanya penemuan dan manfaat teknik
DNA tidak muncul sehingga kontrol negatif tidak PCR ini berdampak sangat luas terhadap kemajuan
terkontaminasi air pada saat ditambahkan. sains dan teknologi secara umum adalah untuk
Sedangkan untuk sampel 1 dan sampel 2 tidak di memperkuat gen spesifik sebelum diklon, membuat
peroleh pita DNA sehingga tidak dapat dilakukan fragmen gen DNA secara berlimpah, dapat
analisis. Hal tersebut dapat dikarenakan lisis sel mendeteksi DNA gen virus yang sulit untuk
yang dilakukan memberikan hasil yang tidak dideteksi, dapat mendeteksi/ mendiagnosis DNA
maksimal sehingga sampel tidak diperoleh dan sel embrionik yang mengalami kelainan sebelum
tidak dapat dihitung massa molekul DNA. dilahirkan, mengetahui hubungan kekerabatan antar
Sejak tahun 1985, PCR telah banyak digunakan spesies atau untuk mengetahui dari mana spesies
dalam penelitian biologis kedokteran, sosial, dan tersebut berasal dan melacak asal usul seseorang
hukum. PCR digunakan untuk mendeteksi pelaku dengan membandingkan finger print".
kejahatan dari sampel DNA air mani, darah, atau Kelebihan PCR adalah memiliki spesifisitas
jaringan tubuh pelaku lainnya atau PCR digunakan tinggi, sangat cepat, dapat memberikan hasil yang
untuk mendeteksi patogen yang sulit terdeteksi, sama pada hari yang sama, dapat membedakan
sperti DNA virus HIV (Ratnasari, 2007). varian mikroorganisme, mikroorganisme yang
Identifikasi Penyakit Genetika untuk dideteksi tidak harus hidup, mudah di set up dan
mengetahui segmen DNA dari pasien yang sebagainya. Sedangkan kelemahan PCR adalah
menderita penyakit mutasi genetika. Teknik ini sangat mudah terkontaminasi, biaya peralatan dan
dapat dilakukan dengan segmen dari DNA genom reagen mahal, interpretasi hasil PCR yang positif
yang tidak diketahui secara lengkap atau hanya belum tervalidasi untuk semua penyakit infeksi
untaian tunggal dari genom tersebut. PCR memiliki (misalnya infeksi pasif atau laten), Teknik prosedur
banyak cara untuk mrngkloning DNA secara yang kompleks dan bertahap membutuhkan
tradisonal. PCR dapat mengekstrak segmen untuk keahlian khusus untuk melakukannya.
menyisipkan sebuah vektor dari genom yang Jenis PCR, teknik PCR dapat dimodifikasi ke
memiliki ukuran besar yang hanya tersedia dalam dalam beberapa jenis diantaranya:
jumlah yang sedikit. 1. Restriction Fragment Length Polymorphism
Aplikasi yang menarik dari PCR adalah analisis (RFLP), metode ini digunakan untuk membedakan
DNA dari fosil, seperti fosil Gajah purba di organisme berdasarkan analisis model derifat dari
belanda. Aplikasi PCR digunakan dalam perbedaan DNA.
mempelajari susubab dari ekspresi gen. Jaringan 2. Inverse-PCR, metode ini digunakan ketika
(sel tunggal) dapat di analisa pada tahap berbeda hanya satu sekuen internal yang diketahui.
untuk melihat gen mana yang telah aktif atau yang Template didigesti dengan enzim restriksi yang
telah dimatikan. memotong bagian luar daerah yang akan
Identifikasi seseorang yang terlibat kejahatan diamplifikasi, fragmen restriksi yang dihasilkan
(baik pelaku maupun korban), atau korban ditempelkan dengan ligasi dan diamplifikasi dengan
kecelakaan/bencana kadang sulit dilakukan. Jika menggunakan sekuen primer yang memiliki titik
identifikasi secara fisik sulit atau tidak mungkin ujung yang memiliki jarak yang jauh satu sama lain
lagi dilakukan, maka pengujian DNA adalah pilihan dengan segmen eksternal yang telah tergabung.
yang tepat. DNA dapat diambil dari bagian
Metode ini khusus digunakan untuk Polymerase Chain Reaction (PCR) tidak berhasil
mengidentifikasi sekuen antara dari beragam gen. dilakukan karena tidak dihasilkan pita DNA secara
3. Nested-PCR, proses ini memungkinkan untuk jelas dan adanya kontrol negatif yang muncul,
mengurangi kontaminasi pada produk selama sehingga massa molekul dari DNA tersebut tidak
amplifikasi dari penyatuan primer yang tidak dapat ditentukan.
diperlukan. Dua set primer digunakan untuk
mendukung metode ini, set kedua mengamplifikasi DAFTAR PUSTAKA
target kedua selama proses pertama berlangsung.
Sekuens DNA target dari satu set primer yang Alaeddini, R., 2012. Forensic implications of PCR
inhibitiona review. Forensic Science
disebut primer inner disimpan di antara sekuens
International: Genetics, 6(3), pp.297-305.
target set kedua dari primer yang disebut sebagai Clarridge, J.E., 2004. Impact of 16S rRNA gene
outer primer. Pada prakteknya, reaksi pertama dari sequence analysis for identification of bacteria
PCR menggunakan outer primer, lalu reaksi PCR on clinical microbiology and infectious
kedua dilakukan dengan inner primer atau nested diseases. Clinical microbiology reviews, 17(4),
primer menggunakan hasil dari produk reaksi yang pp.840-862.
pertama sebagai target amplifikasi. Nested primer Gibson, N.J., Newton, C.R. and Little, S., 1997. A
colorimetric assay for phosphate to measure
akan menyatu dengan produk PCR yang pertama
amplicon accumulation in polymerase chain
dan menghasilkan produk yang lebih pendek reaction. Analytical biochemistry, 254(1),
daripada produk yang pertama. pp.18-22.
4. Quantitative-PCR digunakan untuk Giasuddin, A.S.M., 1995. Polymerase chain
pengukuran berulang dari hasil produk PCR. reaction technique: fundamental aspects and
Metode ini secara tidak langsung digunakan untuk applications in clinical diagnostics. Journal of
mengukur kuantitas, dimulai dari jumlah DNA, Islamic Academy of Sciences, 8(1), pp.29-32.
cDNA, atau RNA. Hasil dari metode ini juga Mayo, D.W., Pike, R.M. and Forbes, D.C.,
2010. Microscale organic laboratory: with
menampilkan copy dari sampel
multistep and multiscale syntheses. John Wiley
5. Reverse Transcriptase (RT-PCR), metode ini
& Sons.
digunakan untuk amplifikasi, isolasi atau Metzker, M.L. and Caskey, C.T., 2009. Polymerase
identifikasi sekuen dari sel atau jaringan RNA. chain reaction (PCR). eLS.
Metode ini dibantu oleh reverse transcriptase Nurachman, Z., Kono, A., Radjasa, O.K. and
(mengubah RNA menjadi cDNA), mencakup Natalia, D., 2010. Identification a novel raw-
pemetaan, menggambarkan kapan dan dimana gen starch-degrading--amylase from a tropical
diekspresikan. marine bacterium. American Journal of
6. Random Amplified Polymorphic DNA Biochemistry And Biotechnology, 6(4), pp.300-
306.
(RAPD) bertujuan untuk mendeteksi polimorfisme
Handoyo, D. and Rudiretna, A., 2000. Prinsip
pada tingkat DNA. Metode ini dikembangkan oleh umum dan pelaksanaan polymerase chain
Welsh and Mc Clelland (1990) dengan cara reaction (PCR) [general principles and
mengkombinasikan teknik PCR menggunakan implementation of polymerase chain
primer primer dengan sequens acak untuk reaction]. Unitas, 9(1), pp.17-29.
keperluan amplifikasi lokus acak dari genom. Jackson, C.R., Roden, E.E. and Churchill, P.F.,
PCR adalah teknologi canggih yang dapat 2000. Denaturing gradient gel electrophoresis
can fail to separate 16S rDNA fragments with
mendeteksi DNA dengan cara amplifikasi DNA.
multiple base differences. Mol Biol Today, 1(2),
Hasil pemeriksaan PCR dapat membantu untuk pp.49-51.
menegakkan diagnosa sepanjang pemeriksaan Madigan MT, Martinko JM, Brock TD. 2006.
tersebut dikerjakan dengan cara yang benar dan Brock Biology of Microorgnisms. NewJersey:
sesuai dengan standar internasional. Keunggulan Pearson Prentice Hall.
PCR dikatakan sangat tinggi. Hal ini didasarkan Rahayu, N., 2013. Perancangan Primer untuk
atas spesifitas, efisiensi dan keakuratannya. Pengembangan Sistem Deteksi Berbasis PCR
(Polymerase Chain Reaction) pada Ganoderma
Masalah yang berkenaan dengan PCR yaitu biaya
spp.
PCR yang masih tergolong tinggi. Ramakers, C., Ruijter, J.M., Deprez, R.H.L. and
Moorman, A.F., 2003. Assumption-free analysis
4. KESIMPULAN of quantitative real-time polymerase chain
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan reaction (PCR) data. Neuroscience
diperoleh isolasi dan perbanyakan fragmen gen 16S letters, 339(1), pp.62-66.
rDNA dari koloni tunggal dengan metode
Rinanda, T., 2011. ANALISIS SEKUENSING 16S
rRNA DI BIDANG MIKROBIOLOGI. Jurnal
Kedokteran Syiah Kuala, 11(3), pp.172-177.