Anda di halaman 1dari 23

A.

JUDUL PERCOBAAN
PENENTUAN KADAR ASAM AMINO DALAM SAMPEL
B. HARI, TANGGAL PERCOBAAN
SELASA, 18 OKTOBER 2016
C. TUJUAN PERCOBAAN
Menentukan asam amino yang terdapat dalam sampel dengan kromatografi kertas
D. DASAR TEORI

Protein yang ditemukan kadang-kadang berkonjugasi dengan makromolekul

atau mikromolekul seperti lipid, polisakarida dan mungkin fosfat. Protein terkonjugasi

yang dikenal antara lain nukleoprotein, fosfoprotein, metaloprotein, lipoprotein,

flavoprotein dan glikoprotein. Protein yang diperlukan organisme dapat diklasifikasikan

menjadi dua golongan utama, ialah pertama; protein sederhana, yaitu protein yang

apabila terhidrolisis hanya menghasilkan asam amino, dan kedua protein terkonjugasi,

yaitu protein yang dalam hidrolisis tidak hanya menghasilkan asam amino, tetapi

menghasilkan juga komponen organik ataupun komponen anorganik yang disebut gugus

prosthetic (Sumarno, dkk., 2002).

Pada umumnya asam amino diperoleh sebagai hasil hidrolisis protein, baik

menggunakan enzim maupun asam. Dengan cara ini diperoleh campuran bermacam-

macam asam amino dan untuk menentukan jenis asam amino maupun kuantitas masing-

masing asam amino perlu diadakan pemisahan antara asam-asam amino tersebut

(Poedjiadi, 1994).

Asam amino adalah sembarang senyawa organik yang memiliki gugus

fungsional karboksil (-COOH) dan amina (biasanya -NH2). Dalam biokimia seringkali

pengertiannya dipersempit: keduanya terikat pada satu atom karbon (C) yang sama

(disebut atom C "alfa" atau ). Gugus karboksil memberikan sifat asam dan gugus amina

memberikan sifat basa. Dalam bentuk larutan, asam amino bersifat amfoterik: cenderung

menjadi asam pada larutan basa dan menjadi basa pada larutan asam. Perilaku ini terjadi

karena asam amino mampu menjadi zwitter-ion.Asam amino termasuk golongan


senyawa yang paling banyak dipelajari karena salah satu fungsinya sangat penting dalam

organisme, yaitu sebagai penyusun protein.Struktur asam amino adalah sebagai berikut

(Poedijaji & Supryanti, 2009 ).

Ada beberapa metode analisis asam amino, misalnya metode gravimetric,

kalorimetri, mikrobiologi, kromatografi dan elektroforesis. Salah satu metode yang

banyak memperoleh pengembangan ialah metode kromatografi. Macam-macam

kromatografi ialah kromatografi kertas, krometografi lapis tipis dan kromatografi

penukar ion (Poedjiadi, 1994).

Kromatografi melibatkan pemisahan terhadap campuran berdasarkan

perbedaan-perbedaan tertentu yang dimiliki oleh senyawanya. Perbedaan yang dapat

dimanfaatkan meliputi kelarutan dalam berbagai pelarut serta sifat polar. Kromatografi

biasanya terdiri dari fase diam (fase stasioner) dan fase gerak (fase mobile). Fase gerak

membawa komponen suatu campuran melalui fase diam, dan fse diam akan berikatan

dengan komponen tersebut dengan afinitas yang berbeda-beda. Jenis kromatografi yang

berlainan bergantung pada perbedaan jenis fase, namun semua jenis kromatografi

tersebut berdasar pada asas yang sama (Bresnick, 2004).

Pemisahan asam amino dengan metode kromatografi ini didasari oleh

kemampuan suatu jenis asam amino terlarut dalam suatu campuran larutan tertentu pada

fase stasioner. Untuk memperoleh pemisahan asam amino yang baik dapat digunakan

dua fase pelarut, misalnya pasangan fenol- air, n-Butanol- air, atau dengan tiga fase

pelarut tersebut dimana setiap jenis asam amino mempunyai koefisien partisi, kertas

digunakan sebagai pendukung air. Campuran komponen yang akan dipisahkan

ditempatkan pada fasa stasioner (zat padat), kemudian dihubungkan dengan fase cair,

maka fasse cair akan melalui fase stasioner sambil membawa komponen tersebut,

dimana perbandingan kecepatan perpindahan komponen dengan kecepatan permukaan


fasa mobile(cair) merupakan dasar untuk mengidentifikasikan komponen yang

dipisahkan. Perbandingan kecepatan ini disingkat dengan Rf (Rate Of Front) (Tim Dosen,

2013).

Menurut Akbar (2011), Macam-macam kromatografi:

1 Kromatografi Lapis Tipis yaitu kromatografi yang menggunakan lempeng

gelas atau alumunium yang dilapisi dengan lapisan tipis alumina, silika gel,

atau bahan serbuk lainnya. Kromatografi lapis tipis pada umumnya dijadikan

metode pilihan pertama pada pemisahan dengan kromatografi.


2 Kromatografi Penukar Ionmerupakan bidang khusus kromatografi cairan-

cairan. Seperti namanya, system ini khusus digunakan untuk spesies ion.

Penemuan resin sintetik dengan sifat penukar ion sebelum perang Dunia II

telah dapat mengatasi pemisahan rumit dari logam tanah jarangdan asam

amino.
3 Kromatografi Penyaringan Gel merupakan proses pemisahan dengan gel yang

terdiri dari modifikasi dekstran-molekul polisakarida linier yang mempunyai

ikatan silang. Bahan ini dapat menyerap air dan membentuk susunan seperti

saringan yang dapat memisahkan molekul-molekul berdasarkan ukurannya.

Molekul dengan berat antara 100 sampai beberapa juta dapat dipekatkan dan

dipisahkan. Kromatografi permeasi gel merupakan teknik serupa yang

menggunakan polistirena yang berguna untuk pemisahan polimer.

Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika

atau alumina yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang

keras. Nilai Rf untuk setiap warna dihitung dengan rumus sebagai berikut (Akbar,

2011) :

Jarak noda dari tempat pentotolan


Rf =
jarak yang ditempuh pelarut
Pengukuran itu dilakukan dengan mengukur jarak dari titik pemberangkatan
(pusat zona campuran awal) ke garis depan pengembang dan pusat rapatan tiap zona.
Nilai Rf harus sama baik pada descending maupun ascending. Nilai Rf akan
menunjukkan identitas suatu zat yang dicari, contohnya asam amino dan intensitas zona
itu dapat digunakan sebagai ukuran konsentrasi dengan membandingkan dengan noda-
noda standar.
Proses pengeluaran asam mineral dari kertas desalting. Larutan ditempatkan
pada kertas dengan menggunakan mikropipet pada jarak 2-3 cm dari salah satu
ujungkertas dalam bentuk coretan garis horizontal. Setelah kertas dikeringkan, ia
diletakan didalam ruangan yang sudah dijenuhkan dengan air atau dengan pelarut yang
sesuai.
Distribusi dapat terjadi antara fase cair yang terserap secara stasioner dan zat
alir bergerak yang kontak secara karib dengan fase cair itu. Dalam kromatografi partisi
cairan, fase cair yang bergerak mengalir melewati fase cair stasioner yang diserapkan
pada suatu pendukung, sedangkan dalam kromatografi lapisan tipis adsorbennya
disalutkan pada lempeng kaca atau lembaran plastik.
Kromatografi kertas dapat dilakukan dengan satu dimensi atau dua dimensi.
Apabila macam komponen tidak terlalu banyak maka biasanya cara satu dimensi cukup
memuaskan. Tetapi, jika hasilnya meragukan dan ini biasanya disebabkan karena macam
komponennya terlalu banyak, maka cara 2 dimensi seringkali diperlukan. Untuk ini
diperlukan 2 macam larutan eluen, yang satu diperlukan untuk ke satu arah dan yang
kedua untuk ke arah lain yang tegak lurus pada satu elusi pertama, Setelah kertas
kromatografinya kering. Umumnya kertas kromatografi yang berukuran 35 x 35 cm
adalah yang memenuhi syarat
Harga-harga Rf untuk senyawa-senyawa murni dapat dibandingkan dengan
harga-harga standar. Senyawa standar biasanya memiliki sifat-sifat kimia yang mirip
dengan senyawa yang dipisahkan pada kromatogram. Adapun faktor-faktor yang
mempengaruhi harga Rf yaitu (Day dan Underwood, 2002):
1. Strukur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan.
2. Sifat dari penyerapan dan derajat aktifitasnya.
3. Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
4. Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase gerak.
5. Derajat kejenuhan dari uap dalam mana bejana pengembangan yang digunakan.
6. Teknik percobaan.
7. Jumlah cuplikan yang digunakan.
8. Suhu.
9. Kesetimbangan.
Kelebihan penggunaan kromatografi lapis tipis dibandingkan dengan

kromatografi kertas ialah karena dapat dihasilkannya pemisahan yang lebih sempurna,

kepekaan yang lebig tinggi, dan dapat dilaksanakan denga lebih cepat.Banyak pemisahan

yang memakan waktu berjam-jam bila dikerjakan dengan kromatografi kertas, tetapi

dapat dilaksanakan hanya beberapa menit saja bila dikerjakan dengan TLC (Adnan,

1997).

Kelebihan dari kromatografi lapis tipis yang lain ialah pemakaian pelarut dan

cuplikan yang jumlahnya sedikit, kemungkinan penotolan cuplikan berganda (saling

membandingkan langsung cuplikan praktis) dan tersedianya beberapa metode (Gritter,

1991).

Pemurnian FRY dan reaksinya, hasil ari FAOD diletakkan di RP-18 plat KLT

yang terdiri dari n-butanol, asam asetat dan air (4 : 1 : 5). Pemurnian FRY dideteksi oleh

ninhidrin (noda ungu).Dugaan bahwa FRY terdiri dari gula dan amina termasuk asam

amino. Pada substrat FAOD, valin menunjukkan karakter yang sama pada KLT. Ketika

permunian dalam inkubator dengan FAOD, noda ungu muncul (Akbar, 2011).

Pada percobaan ini penyemprotan dengan larutan ninhidrin dilakukan untuk

pewarnaan noda-noda asam amino pada kertas kromatografi yang telah kering. Asam-

asam amino yang bereaksi dengan ninhidrin membentuk suatu produk yang disebut ungu

Ruhmann. Reaksi ini biasanya digunakan seba gai uji bercak untuk mendeteksi adanya

asam amino pada kertas kromatografi.

Uji Ninhidrin terjadi apabila ninhidrin dipanaskan bersama asam amino maka

akan terbentuk kompleks berwarna. Asam amino dapat ditentukan secara kuntitatif

dengan jalan menggunakan intensitas warna yang terbentuk sebanding dengan

konsentrasi asam amino tersebut.Pada reaksi ini dilepaskan CO 2 dan NH4 sehingga asam

amino dapat ditentukan secara kuantitatif dengan mengukur jumlah CO2 dan NH3 yang
dilepaskan.Prolin dan hidroksi prolin menghasilkan warna kompleks yang berbeda

warnanya dengan asam amino lainnya.Kompleks berwarna yang terbentuk mengandung

dua molekul ninhidrin yang bereaksi dengan ammonia yang dilepaskan pada oksidasi

asam amino.Hasil uji positif pada uji ninhidrin diberikan pada asam amino yang

mengandung asam -amino dan peptida yang memiliki gugus -amino yang bebas

(Alimuddin, 2011).

Dengan ninhidrin, sebagai oksidator lunak, asam amino bereaksi sebagai berikut.

Ninhidrin asam amino hidrindantin + NH3 + CO2

Dan selanjutnya ninhidrin bereaksi dengan hidrindantin dan ammonia membentuk suatu
hasil reaksi yang berwarna biru.

+ NH3 +

Ninhidrin hidrindantin biru


(Poedjiadi,2009)

Reaksi ninhidrin yang digunakan untuk mendeteksi dan menduga asam amino

secara kuantitatif dalam jumlah kecil. Pemanasan dengan ninhidrin berlebih

menghasilkan produk berwarna ungu pada semua asam amino yang mempunyai gugus

amino bebas, sedangkan produk yang dihasilkan oleh protein berwarna kuning, karena

pada molekul ini terjadi substitusi gugus amino. Pada kondisi yang sesuai intensits
warna yang dihasilkan dapat dipergunakan untuk mengukur asam amino secara

kolorimetrik. Metode ini amat sensitif bagi pengukuran konsentrasi asam amino

(Lehninger, 1982).

Berikut adalah daftar Rf standar asam amino (Rediatning, 1987)

No Asam Amino Nilai Rf

1 Histidin 0.11

2 Glutamin 0.13

3 Lisin 0.14

4 Arginin 0.20

5 Asam aspartat 0.24

6 Glisin 0.26

7 Serin 0.27

8 Asam glutamat 0.30

9 Treonin 0.35

10 Alanin 0.38

11 Sistein 0.40

12 Prolin 0.43

13 Tirosin 0.45

14 Asparagin 0.50

15 Metionin 0.55

16 Valin 0.61

17 Triptofan 0.66

18 Fenilalanin 0.68

19 Isoleusin 0.72

20 Leusin 0.73
E. ALAT DAN BAHAN
a. Alat:
Kertas kromatografi 1 buah
Chamber 1 buah
Kaca kapiler 4 buah
Bejana/ gelas kimia besar 1 buah
Botol semprot 1 buah
Oven 1 buah
b. Bahan:
Asam asetat glasial 6 mL
n-Butanol 25 mL
Aquades secukupnya
Larutan asam amino standar 1 mL
Larutan sampel 1 mL
Ninhidrin
F. ALUR PERCOBAAN
1. Pembuatan larutan pengemulsi (Fasa Gerak)

G.
25 mL n-butanol 6 mL asam asetat glasial 25 mL aquades
H.

I.
dicampur sambil dikocok
ditempatkan dalam lemari kromatograf
J.
dijenuhkan dengan uapnya
K.
Eluen
L.

M.

2. Persiapan plat KLT


N.
O.
P.
Q. Kertas kromatogragi 4 x 10 cm
R. - digaris dari tepi atas 0,5 cm dan tepi
S. bawah 1 cm
T. - diberi tanda untuk penentuan noda A, B,
U. C dan D dengan jarak 1 cm dan 0,5 cm
V. dari di
tepi plat
W. Plat KLT siap
dioven
gunakan selama 5 menit

X.

Y.

Z.

AA.

AB.

AC.

3. Menentukan komposen asam amino


AD.
- ditotolkan 4 macam larutan (A, B, C dan
AE. Kertas kromatografi
D) pada tanda yang sudah ada di plat
4 x 10 KLT
cm
- setiap satu tetesan dikeringkan terlebih
dahulu sebelum tetesan berikutnya
diletakkan di atasnya
besar tetesan tidak boleh lebih dari 0,4
cm diameternya
AF.

AG.

AH.

AI.

AJ. Kertas
kromatografi
AK. - digantung dalam lemari kromatografi
selama beberapa jam untuk dijenuhkan
AL. dengan uap eluen
- dimulai elusi selama 1,5 jam
AM. - detelah elusi berjalan kertas kromatografi
dikeluarkan dan batas larutan ditandai
AN. dengan pensil
- dikeringkan pada suhi 105 - 110C
AO. selama 5 menit
- disemprot dengan ninhidrin
AP. dikeringkan

AQ. Noda noda asam


amino yang
AR. berwarna
- dihitung harga Rf tiap tiap noda
AS. - dicatat warnanya
ditetapkan komponen komponen asam
AT. amino dalam larutan sampel dengan
membandingkan harga Rfnya dengan
AU. harga Rf asam asam amino standar

Komponen asam
AV.
G. HASIL PENGAMATAN amino
AW. AY. Hasil Pengamatan
BD. Seb BE. Ses AZ.
N AX. Prosedur Percobaan
elum udah
BH. BI. Pembuatan larutan pengemulsi (Fasa 1n-butanol: larutan 1 n-butanol + - Eluen
25 mL n-butanol + 6 mL asam asetat glasial + 25 mL aquades
- Reaks
1 Gerak) tak berwarna asam Asetat
CC. C
2asam asetat glasial:
BJ. glasial + mL
larutan tak CH3C
BK. aquades: larutan
berwarna CH3C
Dicampur
BL. sambil dikocok tak berwarna
3aquades: cairan tak H2O (
Ditempatkan dalam lemari kromatograf
BM. digunakan
Dijenuhkan dengan uapnya

Eluen
BN. berwarna sebagai eluen.
BO.
BP.
BQ.
BR.
BS.
BT.
BU.
BV.
BW.
BX.
BY.
BZ.
CA.
CB.
CE. CF.Persiapan plat KLT 1Kertas 1 Kertas - Silica
2 CG. kromatografi kromatografi bersif
CH.
Kertas kromatograf 4x10 cm 4x10 cm: digaris dari tepi
CI. berwarna putih. atas 0,5 cm dan
2Larutan standar A:
CJ. dari tepi bawah
larutan tak
CK. 1 cm dan diberi
ari tepi atas 0,5 cm dan dari tepi bawah 1 cm berwarna
CL. tanda untuk
3Larutan
da untuk penotolan noda A, B, C, dan S dengan jarak 1 cm dan 0,5standar
cmB:dari tepi plat
lama 5 menit CM. penotolan
larutan tak
CN. sampel.
berwarna
CO. 4Larutan standar C: DD.
CP. larutan tak
Eluen
CQ. berwarna
5Larutan sampel 1:
CR.
larutan tak
CS.
berwarna
CT. A B C S
DB.
CU.
DC.
CV.
CW.
CX.
CY.
CZ.
DA.
DF. DG. Menentukan komponen asam amino 1Kertas 1 Kertas - Cara m
3 DH. kromatografi: kromatografi EG.
Kertas DI.
kromatograf 4x10 cm berwarna putih ditotoli standar
2Larutan standar A: Rf =
DJ. A, B, C, dan
larutan tak
DK. sampel 1
berwarna - Rf asa
DL. sebanyak 2
3Larutan
olkan 4 macam larutan (A, B, C, dan S) pada tanda yang sudah ada di plat KLT standar B: 1 Ala
DM.
p satu tetesan dikeringkan terlebih dahulu sebelum tetesan berikutnyalarutan
diletakkan totolan: plat 2 Sis
tak diatasnya
r tetesan tidak boleh DN.
lebih dari 0,4 cm diameternya KLT berwarna 3 Gli
berwarna
DO. 4Larutan standar C: putih. EH.
2 Plat KLT yang EI. R
DP. larutan tak
sudah ditotoli
DQ.
Kertas kromatigraf bernoda berwarna
5Larutan sampel 1: larutan A, B, C,
DR.
larutan tak dan sampel 1
DS.
berwarna digantung dalam
DT.
6Ninhidrin: larutan
chamber dan
DU.
ntung dalam lemari kromatograf selama beberapa jam untuk dijenuhkan dengan uap eluen
tak berwarna.
ulai elusi selama 1,5 jam eluen berjalan
DV.
lah elusi berjalan kertas kromatograf dikeluarkan dan batas larutan ditandai dengan pensil sampai tanda
ringkan pada suhu 105 DW. 1000C selama 1 menit
batas selama 1,5
DX.
jam
DY. EK.
3 Eluen sudah
DZ.
berjalan KLT
EA.
Noda-noda asam amino dikeluarkan dan
EB.
dioven pada
EO. Noda-noda
EP. asam amino FI.
suhu 105-1100C:
EQ.
KLT berwarna
ER.
putih
ES.
4 Disemprot
ET.
ninhidrin 2X
u 105 1000C selama EU. 1 menit
UV dan dikeringkan
EV.
l lagi: terbentuk
noda EW.
spot noda
asam amino dalam EX. sampel dengan dibandingkan harga Rf-nya dengan Rf asam amino standar
berwarna jingga

Komponen asam amino


EY.
EZ.
FA.
FB.
FC.
FD. 5 Harga Rf : EM.
EC. Standart A:
FE.
0,17
FF. ED. Standart B:
FG. 0,03
FH. EE. Standart C:
0,14
H. ANALISIS DAN PEMBAHASAN
1. Pembuatan Larutan Pengemulsi (Fasa Gerak)
FM. Pada tahap percobaan ini yakni membuat fasa gerak atau pengemulsi
atau biasa disebut juga sebagai eluen. Hal pertama yang dilakukan ialah menyiapkan 3
lautan yakni 25mL n-butanol, 6mL asam asetat glsial, dan 25mL aquades. Ketiga larutan
tersebut kemudian dicampurkan dan dimasukkan ke dalam chamber. Kemudian
dijenuhkan dengan cara menutup chamber. Selain bertujuan untuk memisahkan sampel
dari senyawa-senyawa lain, penjenuhan ini juga bertujuan agar pelarut tidak mudah
menguap. Digunakan campuran n-butanol, asam asetat, dan air sebagai eluen karena
ketiga bahan tersebut memiliki kepolaran, dan memiliki perbedaan titik dielektrik. Air
lebih polar dari pada n-butanol dan n-butanol lebih polar jika dibandingkan dengan
asam asetat. Prinsip percobaan KLT ini didasarkan pada sifat fisik dan kimia asam
amino. Sifat fisik ditunjukkan oleh kecepatan bergerak pada fase diam dari kertas
kromatografi. Reaksi yang terjadi yaitu reaksi esterifikasi dengan reaksi sebagai berikut.
FN.

FO. +

CH3 CH2 CH2 CH2 O C CH3


+ H2O

FP.
2. Persiapan Plat KLT
FQ. Pada tahap percobaan ini, yakni tahap persiapan plat KLT. Langkah
pertama yakni menyiapkan plat KLT dengan ukuran 4x10 cm. Kemudian diberi garis
tepi atas dengan jarak 0,5 cm dan garis tepi bawah dengan jarak 1 cm. Selanjutnya
diberi tanda untuk penotolan noda yaitu A (Alanin), B (L-cystein), C (glisin), dan D
(sampel 1) dengan jarak masing-masing 1 cm dan 0,5cm dari tepi. Pemberian garis
batas dan titik harus dibuat dengan menggunakan pensil, jika menggunakan tinta
bolpoin akan membuat noda sampel tidak terdeteksi, karena akan terjadi penumpukan
noda. Karena tinta terdiri atas banyak komposisi senyawa yang berbeda-beda. Plat
yang sudah disiapkan selanjutnya dioven selama 5 menit. Tujuan dari pengovenan ini
yaitu untuk pengeringan dan pengaktifan lapisan KLT agar kertas tersebut benar-benar
kering karena suspensi absorbannya terbuat dari air (fasa diam).
FR.
FS.
3. Menentukan Komponen
FT. Pada tahap percobaan ini, yani menentukan komponen asam amino
yang terkandung dalam sampel. Hal pertama yang dilakukan ialah menotolkan larutan
standar A (Alanin), B (L-cystein), dan C (glisin), kemudian diikuti denga menotokan
sampel 1 pada huruf D dengan jarak antar samper sebesar 1cm. Semua sampel yang
ditotolkan merupakan cairan tidak berwarna. Penotolan dilakukan sebanyak dua kali
dengan besar tetesan tidak lebih dari 0,4 cm. Plat yang telah ditotoli noda kemudian
digantung dalam chamber hingga dasar plat menyentuh dasar chamber dan dimulai
elusi selama beberapa jam hingga eluen naik hingga batas atas plat.
FU. Ketika kertas kromatografi yang telah ditotolkan sampel asam amino,
maka akan terjadi pemisahan, dimana pelarut organik merambat ke atas melalui
kapiler kertas mengangkut campuran asam amino yang ada ditotolkan pada kertas
kromatografi. Asam amino yang paling larut di dalam pelarut organik, akan diangkut
paling cepat dan asam amino yang paling kurang larut akan tertinggal paling bawah.
Pelarut yang digunakan adalah 1-butanol : asam asetat : air dan fenol : air bersifat
nonpolar, maka dari sampel asam amino yang digunakan dapat dilihat sifat
kepolarannya.
FV. Molekul-molekul nonpolar dalam campuran akan memiliki sedikit
interaksi dengan molekul-molekul air dan molekul-molekul yang melekat pada
selulosa, dan karena akan menghabisakan banyak waktunya untuk larut dalam pelarut
yang bergerak. Maka sampel yang paling atas merupakan sampel yang paling larut
dalam pelarut yang artinya bersifat paling non polar dibandingkan sampel asam amino
lainnya. Molekul-molekul seperti ini akan bergerak sepanjang kertas diangkut oleh
pelarut. Mereka akan memiliki nilai Rf yang relatif tinggi.
FW. Dengan kata lain, molekul-molekul polar akan memiliki atraksi yang
tinggi untuk molekul-molekul air dan kurang untuk pelarut yang non polar. Dan
karenanya, cenderung untuk larut dalam lapisan tipis air sekitar serat lebih besar
daripada pelarut yang bergerak. Karena molekul-molekul ini menghabiskan waktu
untuk larut dalam fase diam dan kurang dalam fase gerak, molekul-molekul tidak
akan bergerak sangat cepat pada kertas.
FX. Setelah emulsi berjalan mencapai tanda batas emulsi dihentikan
dengan cara mengeluarkan kertas kromatografi dari dalam chamber. Lalu dilakukan
pengeringan didalam oven selama 5 menit. Namun tidak ada noda yang tampak pada
kertas sehingga kertas kromatografi disemprot dengan larutan ninhidrin. Hal ini
bertujuan bahwa penyemprotan dengan larutan ninhidrin dilakukan untuk pewarnaan
noda-noda asam amino pada kertas kromatografi yang telah kering. Dan dimasukkan
kembali ke dalam oven hingga noda terlihat. Ninhidrin digunakan karena dapat
memberikan reaksi spesifik terhadap asam amino dengan membentuk warna tertentu
bagi asam amino tertentu. Reaksi secara umum ninhidrin:

FY.
FZ. Setelah noda terbentuk, noda ditandai menggunakan pensil dan diukur
untuk mengetahui nilai Rf nya. Pada plat KLT yang menunjukkan pada titik A
(Alanin), muncul noda berwarna jingga(-) dengan jarak noda 1,5 cm dari batas
bawah. Pada titik B (L-cystein) muncul noda berwarna jingga(-) dengan jarak noda
0,3cm. Sedangkan, pada titik C (glisin), muncul noda berwarna kuning(-) dengan
jarak 1,2 cm dan larutan sampel 1 muncul noda berwarna jinga(-) dengan jarak 1,3
cm dari garis batas bawah. Hal ini menunjukkan bahwa larutan sampel terdeteksi
komponen asam aminonya.
GA.
GB.
GC.
Reaksi ninhidrin dengan alanine

GD.

+ CH3CHO + CO2 + 3H2O + H+


GE.

GF.

GG.

GH.

Reaksi ninhidrin dengan glisin


GI.
GJ.

GK.
+
GL.

GM. + HCHO + CO2 + 3H2O + H+

GN.
GO.
GP.
Reaksi ninhidrin dengan sistein
GQ.

GR.

+
GS.
+ HSCH2CHO + CO2 + 3H2O + H+

GT.
GU.
GV.
GW. Perhitungan Rf menggunakan persamaan :
jarak tempuh noda
Rf =
GX. jarak tempuh eluen

GY. Sehingga diperoleh hasil sebagi berikut:

GZ. Nilai Rf larutan A (Alanin) = 0,17


HA. Nilai Rf larutan B (cystein) = 0,03
HB. Nilai Rf larutan C (glisin) = 0,14
HC. Nilai Rf sampel D (sampel 1) = 0,15
HD. Dari hasil tersebut dapat disimpulkan bahwa asam amino pada sampel
D (sampel 1) yakni berupa asam amino glisin dengan nilai Rf yang hampir mendekati
nilai Rf larutan standar C. Nilai Rf yang diperoleh pada percobaan ini berbeda dengan
nilai standar yang ada pada literatur. Hal ini karena harga Rf dipengaruhi oleh eluen,
sedangkan pada harga Rf standar tidak diketahui eluen yang digunakan, terdapat
kemungkinan eluen yang digunakan berbeda sehingga hasil daripada harga Rf juga
berbeda.
HE.

HF.
I. KESIMPULAN
HG. Berdasarkan percobaan Penentuan Kadar Asam Amino dalam Sampel dapat
disimpulkan bahwa:
1. Kromatografi kertas dapat digunakan untuk memisahkan atau mengidentifikasi
asam amino dalam suatu campuran.
2. Asam amino yang terkandung dalam sampel 1 (titik D) adalah glisin dengan nilai
Rf yang mendekati dengan larutan standar C (Glisin) yang telah diketahui yaitu,
0,15, namun berbeda dengan nilai Rf standar teori dikarenakan perbedaan eluen
yang digunakan.
HH. DAFTAR PUSTAKA
HI.
HJ. Adnan M., 1997, Teknik Kromatografi Untuk Analisis Bahan Makanan, Andi,
Yogyakarta.
HK.
HL. Akbar, Y., 2011, Pemisahan dan Identifikasi Asam Amino (online),
(http://akbarbanjar.wordpress.com/2011/03/17/laporan-biokimia/), diakses pada
tanggal 24 Oktober 2016 pukul 19.40 WIB.
HM. Bresnick, S., 2004, Intisari Kimia Organik, Hipokrates, Jakarta.
HN. Day, R.A., dan Underwood, A.L., 2001, Analisis Kimia Kuantitatif Edisi Keenam,
Penerbit Erlangga, Jakarta.
HO. Fessenden, R.J., dan Fessenden, J.S., 1997, Dasar- Dasar Kimia Organik, Erlangga,
Jakarta.
HP. Gritter, A., 1991, Biokimia 1, PT. Gramedia, Jakarta.
HQ. Hughes, A.B., 2009, Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry,
WILEY-VCH, Australia.
HR. Poedjiadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta.
HS. Rediatning, W., dan Kartini, N., 1987, Analisis Asam Amino Dengan Kromatografi
Cairan Kinerja Tinggi Secara Derivatisasi Prakolom dan Pascakolom,
Proceedings ITB, 20(1,2): 41-59.
HT. Sudjana, E., Abdurachman, M., dan Yuliasari, Y., 2002, KarakteriSasi Senyawa
Kompleks Logam Transisi Cr, Mn, dan Ag Dengan Glisin Melalui Spektrofotometri
Ultraungu dan Sinar Tampak, Jurnal Bonatura, 4(2): 69-86.
HU. Toha, A., dan Hamid, A., 2001, Biokimia : Metabolisme Biomolekul, Alfabeta,
Bandung.
HV.
HW.
HX. JAWABAN PERTANYAAN

1 Apa keuntungan dan kerugian metode pemisahan dengan kromatografi kertas ?


HY. Jawaban :
HZ. Satu keuntungan utama kromatografi kertas ialah kemudahan dan
kesederhanaannya pada pelaksanaan pemisahan, yaitu hanya pada lembaran kertas saring
yang berlaku sebagai medium pemisahan dan penyangga. Untuk kromatografi kertas
preparatif diperlukan kertas yang lebih besar dari pada untuk analisis. Keuntungan yaitu
beban langan bilangan Rf yang besar sehingga pengukuran Rf merupakan parameter
yang berharga dalam memaparkan senyawa tumbuhan baru. Sedangkan kerugian atau
kelemahan dari metode pemisahan dengan kromatografi kertas adalah tidak bisa
melakukan analisis kuantitatif pada komponen-komponen sampel hnaya terbatas pada
analisis kualitatif saja.

2 Apakah metode kromatografi kertas dapat digunakan untuk analisis kuantitatif?


IA. Jawaban :
IB. Dengan metode kromatografi kertas ini tidak dapat melakukan analisis yang
bersifat kuantittaif, tetapi hanya dapat digunakan untuk analisis kualitatif terhadap suatu
larutan yang berisi bermacam-macam komponen, misalnya seperti pada percobaan ini
yaitu analisi kualittaif terhadap suatu larutan yang berisi bermacam-macam asam amino,
dan hal ini semua ditandai dengan adanya warna ungu serta dari harga Rf sampel yang
diselidiki lalu dibandingkan dengan harga Rf standarnya.
IC.
3 Faktor apa saja yang mempengaruhi nilai Rf?
ID. Jawaban :
IE. Ada beberapa faktor yang menentukan harga Rf yaitu:
a. Pelarut, disebabkan pentingnya koefisien partisi, maka perubahan-perubahan yang sangat
kecil dalam komposisi pelarut dapat menyebabkan perubahan-perubahan harga Rf.
b. Suhu, perubahan dalam suhu merubah koefisien partisi dan juga kecepatan aliran.
c. Ukuran dari bejana, volume dari bejana mempengaruhi homogenitas dari atmosfer jadi
mempengaruhi kecepatan penguapan dari komponen-komponen pelarut dari kertas. Jika
bejana besar digunakan, ada tendensi perambatan lebih lama, seperti perubahan
komposisi pelarut sepanjang kertas, maka koefisien partisi akan berubah juga. Dua faktor
yaitu penguapan dan kompisisi mempengaruhi harga Rf.
d. Kertas, pengaruh utama kertas pada harga Rf timbul dari perubahan ion dan serapan,
yang berbeda untuk macam-macam kertas. Kertas mempengaruhi kecepatan aliran juga
mempengaruhi kesetimbangan partisi.
e. Sifat dari campuran, berbagai senyawa mengalami partisi diantara volume-volume yang
sama dari fasa tetap dan bergerak. Mereka hampir selalu mempengaruhi karakteristik
dari kelarutan satu terhadap lainnya hingga terhadap harga Rf mereka.
IF. LAMPIRAN PERHITUNGAN

IG. Penentuan Rf :

Jarak yang ditempuh senyawa


Rf =
IH. jarak yang ditempuh eluen

II. Larutan Standar A (Alanin)

1,5 cm
Rf Alanin= =0,17
IJ. 8,5 cm

IK. Larutan Standar B (L-cystein)

0,3 cm
Rf Glisin= =0,03
IL. 8,5 cm

IM.Larutan Standar C (Glisin)

1,2 cm
Rf Alanin= =0,14
IN. 8,5 cm

IO. Larutan Sampel (1)

1,3 cm
Rf Alanin= =0,15
IP. 8,5 cm

IQ.
IR.

Anda mungkin juga menyukai