Construction gntique et
prparation enzymatique
SOMMAIRE
1. Introduction ...................................................................................................................... 2
2. Les auxiliaires technologiques ......................................................................................... 2
2.1. Dfinition ....................................................................................................................... 2
2.2. Lapha-amylase : intrt et domaine d'application ........................................................ 3
3. Les arrts ....................................................................................................................... 4
4. Les cartes didentits des bactries ................................................................................. 5
5. Obtention de la souche productrice ................................................................................. 7
5.1. Extraction de lADN de Geobacillus stearothermophilus ............................................... 7
5.2. Amplification du gne par PCR (Raction de Polymrisation en Chane) .................... 7
5.3. Insertion des amplicons dans le plasmide .................................................................. 10
5.5. Extraction (miniprep) et digestion ................................................................................ 13
5.6. Electrophorse ............................................................................................................ 14
5.7 .Insertion des plasmides dans B. licheniformis ............................................................ 15
5.8 .Vrification de la prsence du gne dans B. licheniformis .......................................... 15
6. Obtention de la prparation enzymatique ...................................................................... 16
7. Conclusion ..................................................................................................................... 17
8. Rfrences bibliographiques ......................................................................................... 18
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1. Introduction
Ainsi, nous obtiendrons une nouvelle souche de B. licheniformis sous forme dOrganisme
Gntiquement Modifi (OGM).
Un OGM est dfini comme tant un organisme (animal, vgtal, bactrie) dont le matriel
gntique a t modifi par une technique nouvelle, afin dobtenir une caractristique
nouvelle.
Ainsi, aprs avoir expos lintrt de lalpha-amylase, notamment dans lindustrie agro-
alimentaire, nous expliquerons la dmarche qui a conduit lobtention de la souche
productrice de lenzyme et de la prparation enzymatique. Il est trs important de se
renseigner au niveau des rglements et des autorisations demploi concernant cette enzyme.
2.1. Dfinition
Les alpha-amylases sont utilises dans l'industrie de l'amidon, afin de lhydrolyser dans le
procd de liqufaction de lamidon. Celui-ci convertit l'amidon en sirop de fructose et de
glucose. La conversion enzymatique de l'amidon comprend :
La glatinisation, qui est une dissolution de granules d'amidon, formant ainsi une
suspension visqueuse ;
La liqufaction, qui hydrolyse partielle et perte de viscosit ;
Et la saccharification, qui consiste en une production de glucose et de maltose par
hydrolyse supplmentaire.
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Lindustrie du th, la prparation d'aides digestives, la biscuiterie ou encore lindustrie de jus
de fruits utilisent aussi des alpha-amylases. En dehors de lindustrie des aliments, ces
enzymes prsentent des intrts dans les industries du textile, du papier ou encore des
dtergents.
3. Les arrts
La mise sur le march des OGM et des produits issus d'OGM est soumise une autorisation
accorde au cas par cas au niveau europen.
Lorsqu'il s'agit d'aliments ou d'ingrdients alimentaires composs d'OGM ou issus d'un
OGM, l'autorisation de mettre sur le march ces produits ou de les utiliser en vue de leur
transformation industrielle pour la consommation humaine est accorde sur la mise en place
d'un dossier technique permettant d'valuer les risques pour la sant publique, en se basant
sur le rglement (CE) n258/97.
Ce rglement impose que des contrles soient effectus par lAutorit europenne de
scurit des aliments (AESA) pour dmontrer linnocuit de ces produits pour la sant
(humaine et animale) et pour lenvironnement.
Dans notre cas, on se rfrera 3 trois rglements fondamentaux dont :
Le rglement (CE) n1829/2003 du Parlement europen et du Conseil du 22
septembre 2003 qui sapplique, entre autres, aux denres alimentaires et aliments pour
animaux labors partir dOGM, ou contenant des ingrdients produits partir
dOGM. (modifi en 2006 et 2008; en rvision 2011).
Rglement (CE) n1830/2003 du Parlement europen et du Conseil, du 22 septembre
2003, concernant la traabilit et ltiquetage des organismes gntiquement modifis
et la traabilit des produits destins lalimentation humaine ou animale produits
partir dorganismes gntiquement modifis et modifiant la directive 2001/18/CE
Directive 2001/18/CE du Parlement europen et du Conseil du 12 mars 2001 relative
la dissmination volontaire d'organismes gntiquement modifis dans
l'environnement et abrogeant la directive 90/220/CEE du Conseil (modifi en 2008)
Les producteurs de ce type de produits doivent appliquer une demande unique auprs de
lautorit comptente du pays concern (membre de lUE). Celui-ci, aprs deux semaines,
accuse rception du dossier et en informe lAESA, qui a 6 mois pour traiter la demande.
Si le dossier est approuv, les denres alimentaires et les aliments pour animaux contenant
des OGM doivent tre clairement tiquets. Cependant, si la proportion de cet ingrdient est
infrieure 0,9%, ils ne doivent pas tre tiquets, condition que la prsence de cet OGM
soit techniquement invitable (ce qui correspond la dose rsiduelle maximale).
Famille Bacillaceae
Genre Bacillus
Type Msophile
Aw minimum 0,95
Gram +
[1] Bacillus lichenformis, Missouri University of Science and Technology, Erin Pringle, 2005
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Tableau 2 : Carte didentit de Bacillus stearothermophilus.
Famille Bacillaceae
Genre Geobacillus
Type Thermophile
pH extrmes de croissance 2 11
Oxygne Arobie
Catalase +
Oxydase +
Spores +
Toxines -
Gram +
[2] Bacillus lichenformis, Missouri University of Science and Technology, Erin Pringle, 2005
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5. Obtention de la souche productrice
Le clonage molculaire permet linsertion dun fragment dADN exogne dans un plasmide,
son transfert dans une bactrie et sa multiplication. Dans ce cas, nous allons voir les
diffrentes tapes menant linsertion du gne codant pour lapha-amylase provenant de G.
stearothermophilus dans B. licheniformis.
La PCR est une mthode rapide de biologie molculaire d'amplification gnique qui permet
de dupliquer en grand nombre une squence d'ADN ou d'ARN connue partir d'acide
nuclique et d'amorces spcifiques.
La spcialit de la PCR dpend de faon critique des amorces. Le choix dun couple
damorces repose sur quelques principes gnraux dont :
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La taille doit tre comprise entre 15 et 30 nuclotides. Infrieure 15 nuclotides, les
amorces sont non spcifiques du fragment amplifier et suprieure 30 nuclotides,
la temprature de fusion sera trop leve.
Il doit y avoir une complmentarit totale avec les rgions flanquantes du fragment
amplifier, pour viter les msappariements.
Il ne doit pas y avoir dauto-complmentarit et de complmentarit entre les
amorces: pas de dimres damorces.
Il ne doit pas y avoir de structures secondaires : pas de boucles ou hairpin.
Il ne doit pas y avoir de rptition en tandem de nuclotides suprieurs 4 : viter le
risque de msappariement.
Le des amorces doit tre suffisamment lev, soit entre 52C et 58C si possible
car plus le est lev moins le risque dhybridation non spcifique est important.
La diffrence de entre les amorces doit tre infrieur 5C
Les amorces ont t choisies grce au site NCBI et nous avons vrifi quelles respectent bien
les conditions cites ci-dessus.
Nous avons ajouts des sites de restrictions aux amorces, de sorte ce que les enzymes de
restrictions puissent couper le plasmide au niveau du site de polyclonage, mais pas
lamplicon. En effet, ces enzymes (endonuclases) sont des molcules dorigine bactrienne
ayant la particularit de couper les molcules dADN bicatnaires des sites spcifiques de la
squence appele site de restriction. Chaque enzyme reconnat et coupe une squence
nuclotidique donne.
Ainsi, nous avons choisi deux enzymes de restrictions de sorte ce que linsert soriente
dune seule faon dans le vecteur.
Celles-ci aboutissent des coupures dcales, autrement dit, ils gnrent des extrmits
monocatnaires protubrantes ayant des squences complmentaires appeles extrmits ou
bouts collants.
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Afin damliorer la reconnaissance du site de restriction par son enzyme, quelques
nuclotides (2 pb) devront tre ajouts aux extrmits 5. Ainsi nous obtenons les amorces
suivantes dont les Tm ont t recalculs sur le site IDT :
Il faut savoir que les sites de restriction ont t placs sur les amorces en fonction de la
configuration du plasmide choisi en 5.3. En effet, au sein de lADN exogne, le codon
initiateur (ATG) du gne est en position 2004 pb et est suivi de lamorce reverse. Il est donc
judicieux de placer le site de restriction XbaI (5TCTAGA) prs de lamorce reverse. Par
consquent, le site de restriction AatII (5GACGTC) sera du ct de lamorce forward.
Pour pouvoir effectuer une PCR, nous utilisons un master mix de thermo scientifique qui est
une solution compose de Taq polymerase 0,05 U/L, de dNTP 0,4 mM chacun, de
ractif buffer et de MgCl2 4 mM. Il faut savoir quil faut ajouter au mix lADN amplifier
et les amorces. Ce pr-mlange permet d'conomiser du temps et rduire les contaminations
dues aux nombreuses tapes de pipetage.
Protocole :
- Vortexer le PCR Master Mix (2X) aprs dconglation;
- Dans un tube de PCR ajouter 25 L PCR Master Mix (2X), 0,1 1,0 M damorce
forward et Reverse, 10 pg 1 g dchantillon dADN et 50 L deau ne contenant
pas de nuclase;
- Vortexer les chantillons;
- Placer les chantillons dans le thermocycleur et le programmer avec les paramtres ci-
dessous.
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Tableau 6 : Paramtres de la PCR.
Temprature Nombre
Etapes Temps Explication
(C) de cycle
Elongation
72 5-15min 1
finale
A lissue de la PCR, le nombre total de copies gnres est 2n, o n est le nombre de cycles
d'amplification, ce qui gnre 230 copies d'ADN.
5.3. Insertion des amplicons dans le plasmide
Principe : Le vecteur de clonage est coup par une enzyme de restriction qui reconnat un
site unique plac au site de polyclonage. Ce site tant unique, le vecteur est donc linaris et
possde chaque extrmit une partie de la squence dADN reconnue par lenzyme de
restriction.
LADN exogne est digr par la mme enzyme de restriction que celle utilise pour la
linarisation du vecteur. Les fragments obtenus possdent donc galement leurs extrmits
une partie de la squence dADN reconnue par lenzyme de restriction.
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Lorsque le plasmide ouvert linaris et les fragments dADN donneur sont confronts, il y a
hybridation (formation de liaisons hydrogne) des extrmits cohsives complmentaires,
suivants la loi de complmentarits A/T, G/C.
Une enzyme appele ligase, permettant la formation dune liaison covalente entre ces
fragments dADN hybrids, est alors ajoute pour ligaturer le fragment dADN exogne au
plasmide. Laction de la ligase est de crer des liaisons phosphodiester entre les extrmits
5-P et 3-OH rendues adjacentes par lhybridation des extrmits cohsives du fragment et
du plasmide.
Choix du plasmide : Le plasmide pHT01, dune taille de 7954 pbs, a t choisi pour
linsertion de lamplicon. En effet, il possde une origine de rplication de E. coli qui
permettra par la suite daugmenter le nombre de plasmide lors du dveloppement de E. coli
mais il permet aussi lexpression des protines chez Bacillus une fois intgre dans la
bactrie. Dautre part, il possde des gnes de rsistance lampicilline et au
chloramphnicol qui seront ncessaire pour la suite du clonage, et le gne lacI qui sera
ncessaire pour la production de lenzyme.
Digestion enzymatique : Dans notre cas lADN plasmidique et linsert sont digrs par deux
enzymes de restriction (XbaI et AatII), ainsi linsert pourra sintgrer dans une seule
orientation. Dans le plasmide pHT01, ces sites de restrictions sont spars par 3 pbs, ainsi, le
plasmide linaris aura une taille de 7951 pbs car la digestion aura libr ce triplet de
nuclotides.
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5.4. La transformation de E. coli
Avant que la bactrie subisse une transformation il faut la rendre comptente, c'est dire
s'assurer que son tat physiologique garantit une efficacit maximum de transformation.
Pour cela il faudra obtenir des cellules venant de se diviser plusieurs fois au cours de la phase
exponentielle : ce moment les membranes sont tires au maximum et la paroi cellulaire est
plus permable contrario dune vieille paroi qui est plus rticule.
D'autre part la cellule est dans un tat nergtique lui permettant de rsister au mieux aux
traitements de la transformation.
Ainsi, les tapes suivre pour rendre comptente les souches dEscherichia coli sont les
suivantes:
1. Prlever des souches dE.coli en phase exponentielle.
Pour cela, il faut prlever une culture de E. coli, et la diluer dans du milieu LB. Aprs 3
heures, effectuer une mesure dabsorbance sachant que la densit optique doit tre comprise
entre 0,5 et 0,6.
2. Les refroidir et les mettre en contact dune solution concentre de chlorure de calcium
pour les rendre comptentes.
Cela consiste transfrer 1 mL de la culture dans un eppendorf marqu + ainsi quun 1mL de
la culture dans un second eppendorf marqu -. LADN sera ajout dans leppendorf + et le -
servira de tmoin pour lexprience. Centrifuger pendant environ 30 secondes, liminer
ensuite le surnageant, ajouter 100 microlitres de chlorure de calcium une concentration de
0,05 M au culot et le remettre en suspension dlicatement. Rpter cette tape une seconde
fois. Enfin, les garder au froid jusqu leur emploi.
Aprs avoir rendu comptentes nos souches E.coli, il est possible de procder leur
transformation. Pour ce faire il faut:
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2. Slectionner les bactries transformes.
Pour pouvoir slectionner les bactries dites transformes il faut les mettre en culture sur des
milieux adquats pour leur dveloppement.
Tubes Milieux
Tube marqu + Milieu LB + Amp
Tube marqu + Milieu LB
Tube marqu - Milieu LB + Amp
Tube marqu - Milieu LB
Remarque: La mise en culture dans des milieux avec et sans ampicilline permet de mesurer
l'efficacit de la transformation en comparant le nombre de colonies dans les deux botes.
Les botes sont ensuite mises incuber 37C pendant une nuit pour ainsi permettre leur
lecture et dnombrement. Dans les botes contenant de l'ampicilline, seules les bactries ayant
intgr le plasmide portant le gne de rsistance l'ampicilline sont capables de pousser. Ce
sont donc ces colonies qui seront slectionnes, celles-ci ayant bien intgr le plasmide.
5.5. Extraction (miniprep) et digestion
Afin de slectionner les E. coli qui possdent le plasmide recombin, nous allons extraire les
plasmides de 10 colonies ayant pouss sur le milieu avec ampicilline provenant des botes
contenant le milieu LB et lampicilline et procder une miniprep.
Une miniprparation ou miniprep est une technique permettant dextraire une petite quantit
dADN sous forme de plasmide provenant de bactrie ayant subi une transformation, le plus
souvent E. coli comme nous allons le prsenter ci-aprs.
Ci-aprs un tableau rcapitulatif des solutions utiliser avec leurs quantits et leurs
compositions selon les diffrentes tapes de la mini prp.
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Tableau 8 : Description des tapes de la mini prp en fonction des diffrents tampons.
50 mM glucose
Remise en suspension des
Buffer P1 10 mM EDTA 250L
cellules bactriennes
25 mM Tris ( pH 8)
0,2 M NaOH
Lyse cellulaire Buffer P2 250L
1% SDS
3 M KOAc ( pH 6)
Neutralisation de lADN
Buffer N3 Pour 100 mL de solution : 60 mL 350L
plasmidique
5 M de potassium dactate
Remettre en suspension le
Buffer EB 10 mM Tris-HCl ( pH 8) 50L
culot dADN plasmidique
5.6. Electrophorse
Pour chaque colonie prleve, nous avons ralis une digestion enzymatique des plasmides
par XbaI et AatII. Nous allons effectuer une lectrophorse sur gel dagarose pour dterminer
la taille des fragments des gnes et ainsi confirmer ou infirmer la prsence du gne chez les
colonies prleves.
Les souches seront cultives sur des milieux de culture ddis la croissance de Bacillus1
auquel on aura additionn du chloramphnicol. Ce dernier est un antibiotique qui permettra
de slectionner uniquement les bactries qui ont bien intgr le plasmide. Ce plasmide
contient en effet un gne de rsistance au chloramphnicol.
1
http://www.himedialabs.com/TD/M1383.pdf
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Les seules colonies qui se dvelopperont sur la glose auront donc forcment intgr le
plasmide et ce sont ces colonies que lon slectionne pour produire lenzyme.
La prsence du plasmide contenant le gne dintrt a bien t vrifie. il est donc possible de
cultiver B. licheniformis modifi pour permettre la scrtion de lenzyme souhaite : lalpha-
amylase. Le mode de culture pour lobtention de la prparation enzymatique prsent ci-
aprs a t propos par Bashir et al alpha-amylase from Banana waste. (2014).
Nous avons choisi cette mthode car la production dalpha-amylase se fait par fermenteur
batch. En effet, ce type de conduite de fermentation permet de mieux matriser les paramtres
physicochimiques, notamment, laration. Ainsi, nous pourrons faire pousser la bactrie
faire de la respiration et produire de la biomasse en couplage avec lalpha-amylase.
Il faut savoir que comme la production de biomasse est couple avec celle de lenzyme, il est
possible daugmenter la quantit de biomasse en ayant recours limmobilisation des
cellules. De plus, les caractristiques principales de B.licheniformis (Temprature de
croissance, gram, oxygne etc.) sont en adquation avec les diffrents paramtres prsents
dans la publication.
1. Prparation de linoculum
Il est tout dabord ncessaire dobtenir une suspension dinoculum homogne de la souche B.
licheniformis modifie. Un erlenmeyer contenant 30 ml de bouillon nutritif doit tre strilis
121C et 103 kPa pendant 15 min. Une souche pure de B. licheniformis modifi y sera
ensuite cultive 30C +/- 1C pendant 48 h. Pour rendre la suspension homogne, il faut
ensuite placer lerlenmeyer dans un incubateur permettant une agitation 120 tr/min et une
temprature contrle de 37C pendant 12h.
2. Fermentation en batch
La production dalpha-amylase est ralise par fermentation. Plusieurs milieux de
fermentation ont t proposs, mais nous avons choisi le milieu ayant le meilleur rendement
selon Bashir et al. (2014). Celui-ci contiendra :
Dchets de banane 3g/L, source de carbone (facultatif tant donn que lIPTG
permet linduction du promoteur mais permet la croissance des bactries)
Extraits de levure 2 g/L, source de carbone et dazote
K2HPO4 1g/L, source de phosphore
MgSO4.7H2O 0,5g/L, complment de substrat
CaCl2 2 g/L, complment de substrat
IPTG 1 mM, induction du promoteur groE du plasmide pHT01
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vitesse dagitation de 1000 1200 tr/min une temprature de 30C. Un agent antimousse
pourra tre ajout manuellement grce un capteur. Le pH sera maintenu 7.
3. Extraction de lalpha-amylase
Lalpha-amylase est extraite du milieu ferment par centrifugation 10 000 g pendant 15
minutes temprature ambiante. Le surnageant doit ensuite tre purifi pour obtenir lextrait
purifi dalpha-amylase.
4. Purification de lalpha-amylase
Plusieurs tapes sont suivre pour la purification de lalpha-amylase. On procde tout
dabord une prcipitation avec le sulfate dammonium solide de lalpha-amylase brute pour
obtenir une saturation de 80% 0C. Cette tape se fait sous agitation 100 tr/min. Les
prcipits forms sont ensuite lyophiliss et dissous dans du tampon phosphate pH 7. Ils
sont ensuite dialyss contre du tampon phosphate de sodium 0,05 mM. Lchantillon est
charg sur une colonne changeuse danions constituant la chromatographie liquide
protine rapide (FPLC). Lquilibrage pralable de la colonne est ralise par du tampon
phosphate de sodium 50mM un dbit de 1mL/min. Lalpha-amylase sera lue avec un
gradient de NaCl dans le tampon. Cest cette chromatographie qui permettra, par change
dions, dobtenir une alpha-amylase pure.
7. Conclusion
Lalpha-amylase est une enzyme d'intrt majeur dans diffrentes industries notamment dans
lindustrie agro-alimentaire. Grce aux outils de la biotechnologie nous avons pu mettre en
place une dmarche permettant lobtention de B.licheniformis modifie, autrement dit un
OGM, produisant de lalpha-amylase.
Il faut savoir quen France, lutilisation dOGM en agro-alimentaire ( destination de
lalimentation humaine ou animale) est rglemente.
Le mode de culture et les paramtres associs tels que la vitesse daration, le pourcentage de
saturation en oxygne, lagitation, la temprature et le pH doivent tre dfinis pour que
lOGM produise de lalpha-amylase de faon optimale.
En dfinitive, lobtention de la prparation enzymatique ncessitera des mthodes
dextraction et de purification de lalpha amylase qui devront tre matrises pour obtenir les
meilleurs taux de rendement et de purification.
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8. Rfrences bibliographiques
Bibliographie
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industry A review. Brazilian Journal of Microbiology. 2010;41(4):850-861.
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- RACHINGER, Michael, VOLLAND, Sonja, MEINHARDT, Friedhelm, DANIEL,
Rolf et LIESEGANG, Heiko, 2013. First Insights into the Completely Annotated
Genome Sequence of Bacillus licheniformis Strain 9945A. Genome Announcements
[en ligne]. 1 aot 2013. Vol. 1, n 4. [Consult le 14 fvrier 2017]. DOI
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http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3731831/
- THORNE, C. B. et STULL, H. B., 1966. Factors affecting transformation of Bacillus
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Sitographie
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http://www.brenda-enzymes.org/
http://www.himedialabs.com/TD/M1383.pdf
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