Anda di halaman 1dari 13

LAPORAN PRAKTIKUM

LABORATORY METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY

PEMBIMBING: Prof. DR. Dwi Suryanto, M.Sc

Oleh:
Juwita Sahputri
(157027003)

Magister Kedokteran Tropis


Fakultas Kedokteran
Universitas Sumatera Utara
2016
PCR (Polymerase Chain Reaction)

1. Tujuan Praktikum
Mengamplifikasi atau memperbanyak fragmen DNA hasil isolasi
2. Landasan Teori
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan suatu teknik perbanyakan
(amplifikasi) potongan DNA secara in vitro pada daerah spesifik yang dibatasi oleh
dua buah primer oligonukleotida. PCR memungkinkan adanya perbanyakan DNA
antara dua primer, hanya di dalam tabung reaksi, tanpa perlu memasukkannya ke
dalam sel (in vivo). Pada proses PCR dibutuhkan DNA untai ganda yang berfungsi
sebagai cetakan (template) yang mengandung DNA-target untuk pembentukan
molekul DNA baru, enzim DNA polimerase, deoksinukleosida trifosfat (dNTP), dan
sepasang primer oligonukleotida. Pada kondisi tertentu, kedua primer akan mengenali
dan berikatan dengan untaian DNA komplemennya yang terletak pada awal dan akhir
fragmen DNA target, sehingga kedua primer tersebut akan menyediakan gugus
hidroksil bebas pada karbon 3. Setelah kedua primer menempel pada DNA templat,
DNA polimerase mengkatalisis proses pemanjangan kedua primer.
Bahan-bahan yang dibutuhkan pada proses reaksi PCR adalah sebagai berikut:
1. DNA template
DNA template berfungsi sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA
baru yang sama.
2. Primer
Primer adalah suatu polimer asam nukleat pendek (oligonukleotida) yang
mempunyai urutan nukelotida yang komplementer dengan urutan nukleotida
DNA template, dNTPs, Buffer, dan enzim DNA polimerase. Primer berfungsi
sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi dan sekaligus
menyediakan gugus hidroksi (OH) pada ujung 3 yang diperlukan untuk proses
ekstensi DNA.
3. DNA Polimerase
DNA Polimerase (Taq polimerase) merupakan enzim yang stabil dalam
pemanasan dan berfungsi sebagai katalis untuk reaksi polimerasi DNA dan
ekstensi DNA.
4. Bufer
Buffer berfungsi untuk menjaga keseimbangan pH medium. Umumnya
mengandung senyawa MgCl2 yang bertindak sebagai kofaktor yang berfungsi
menstimulasi aktivitas DNA polimerase serta meningkatkan interaksi primer
dengan template yang membentuk kompleks larut dengan dNTP.
5. dNTPs
dNTPs (deoksinucleotide trifosfat) merupakan campuran dari dATP (
deoksiadenosin trifosfat), dTTP (deoksitimidin trifosfat), dCTP (deoksisistidin
trifosfat), dan dGTP (deoksiguanosin trifosfat). dNTPs ini bertindak sebagai
building block DNA yang diperlukan dalam proses ekstensi DNA.
Teknik PCR didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik di mana
terjadi penggandaan jumlah molekul DNA pada setiap siklusnya secara eksponensial
Proses ini dapat dikelompokkan dalam tiga tahap berurutan yaitu:
a. Denaturasi
Selama proses denaturasi, DNA untai ganda akan membuka menjadi dua untai
tunggal. Hal ini disebabkan karena suhu denaturasiyang tinggi menyebabkan
putusnya ikatan hidrogen antara basa-basa yang komplemen. Denaturasi
dilakukan pada suhu 900C-950C.
b. Annealing (penempelan) pasangan primer pada untai DNA target
Pada tahap ini primer akan menuju daerah yang spesifik yang komplemen
dengan urutan primer, pada proses anneling, ikatan hidrogen akan terbentuk
antara primer dengan urutan komplemen pada template. Prfoses ini biasanya
dilakukan pada suhu 500C-600C. selanjutnya, DNA polymerase akan berikatan
sehingga ikatan hidrogen tersebut akan menjadi sangat kuat dan tidak akan putus
kembali.
c. Extension (pemanjangan atau polimerisasi), sehingga diperoleh amplifikasi
DNA
Tahap ini dilakukan pada suhu 720C. Primer yang telah menempel tadi akan
mengalami perpanjangan pada sisi 3nya dengan penambahan dNTP yang
komplemen dengan template oleh DNA polimerase. Jika siklus ini dilakukan
berulang-ulang maka daerah yang dibatasi oleh dua primer akan diamplifikasi
secara eksponensial. Tahap elongasi akhir selama 5 - 15 menit (tergantung panjang
cetakan DNA) setelah siklus terakhir dapat digunakan untuk menjamin DNA rantai
tunggal sisa diperpanjang seluruhnya.

Gambar 1 amplifikasi eksponensial gen oleh PCR


Gambar tahap-tahap PCR

3. Praktikum PCR
Waktu dan tempat : Praktikum Isolasi DNA dilakukan tanggal 11 November 2016
pukul 10.00-13.30 WIB di Laboratorium Terpadu
Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan.
a. Alat dan bahan:
Alat:
Mesin thermal cycler
tabung PCR 0.2 ml
sarung tangan
mikopipet eppendorf dan tips.

Bahan:
PCR Master Miix Kit Promega
DNA template
Primer Reverse
Primer Forward
Nuclease free water

Gambar 1 Mesin Thermal Cycler

b. Cara Kerja:
1. Siapkan larutan Mix Solution untuk 5 sampel + 1 kontrol yaitu:

Tabel 1. Campuran Larutan PCR (cocktail)


Bahan 1 sampel (L) 5 sampel (L)
Master mix 2x 12,5 12,5
Primer F (Forward) 0.25 1.75
Primer R (Reverse) 0.25 1.75
N. F. Water 8.5 8.5
Template DNA 2 (ditambahkan
kemudian)
2. Siapkan 5 tabung PCR dipipetkan sebanyak 12.5 l Mix Solution dan masukkan
ke masing-masing tabung PCR.
3. Tambahkan 2 l DNA sampel, lalu vortex
4. Sertakan kontrol negatif dalam setiap menjalankan PCR (kontrol negatif = tabung
PCR hanya berisi Mix Solution, tanpa penambahan larutan DNA sampel).
5. Kemudian disentrifuse selama 3 menit dengan kecepatan 13.000 rpm
6. Kemudian masukkan ke mesin thermo cycler dengan ketentuan:

Tabel 3. PCR Protokol untuk Amplifikasi Gen Fibrinogen

Langkah Suhu (C) Waktu Siklus (kali)


Hot start 95 7 menit 1
Denaturasi 95 15 detik
Annealing 60 45 detik 35
Extensi 72 30 detik

Extensi 72 7 menit 1
Soaking 4 7 menit 1

c. Hasil dan Pembahasan


Dari hasil PCR yang melalui 3 tahapan penting yaitu denaturasi, annealing,
dan extension, serta bantuan enzim Taq Polimerase, didapatkan perbanyakan segmen
DNA yang spesifik dengan jumlah perbanyakan 2n, dimana n adalah jumlah siklus
yang dilakukan. Jadi setelah dilakukan PCR dengan 38 siklus didapatkan perbanyakan
segmen DNA dengan jumlah 2n.Diperoleh sampel PCR yang berupa cairan
bening.Hasil sampel PCR tersebut dapat disimpan pada suhu 4OC untuk digunakan
pada praktikum selanjutnya.Hasil sampel PCR dideteksi dengan elektroforesis. Pada
praktikum ini akan dideteksi DNA Fibrinogen pada darah dengan panjang DNA 660
bp.
ELEKTROFORESIS

1. Tujuan Praktikum
1. Mengetahui DNA yang terbentuk dari hasil isolasi DNA dan hasil PCR.
2. Memahami prinsip dasar PCR dan Elektroforesis Agarose.
3. Menggunakan alat Elektroforesis dengan benar untuk membaca nilai base
pair fragmentDNA.
2. Landasan Teori
Elektroforesis adalah teknik yang digunakan untuk memisahkan dan
memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan
perbedaan ukuran. Elektroforesis gel agarosa adalah teknik paling baik yang
dilakukan untuk menganalisis protein dan DNA pada berbagai cairan biologis (serum,
urin, CSF, dll). Teknik ini merupakan teknik yang menggunakan prinsip
elektroforesis zona. Molekul protein bermigrasi pada medium padat/ gel yang
direndam dengan suatu larutan penyangga dibawah pengaruh medan listrik. Migrasi
ini tergantung pada muatan listrik, titik isoelektrik bersih dan massa molekul protein.
Prinsip kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan
listrik ditempatkan pada medium berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut akan
bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif berdasarkan muatan yang
terkandung didalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan negatif akan bergerak
menuju kutub positif, sedangkan molekul-molekul bermuatan positif akan bergerak
menuju kutub negatif.
Elektroforesis digunakan untuk menyediakan informasi mengenai ukuran,
konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Elektroforesis dalam skala
besar memungkinkan untuk digunakan sebagai metode pemisahan yang dapat
digunakan untuk menentukan komponen dari protein atau asam nukleat setiap
individu. Elektroforesis gel memisahkan makromolekul berdasarkan laju
perpindahannya melewati suatu gel dibahwah pengaruh medan listrik. Elektroforesis
memisahkan suatu campuran molekul DNA menjadi pita-pita yang masing-masing
terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama.
Elektroforesis DNA merupakan teknik untuk memisahkan sampel DNA
berdasarkan atas ukuran (berat molekul) dan struktur fisik molekulnya.Molekul DNA
yang lebih kecil, akan lebih cepat keluar dari pada molekul DNA yang besar. Sehingga
akhir dari proses elektroforesis ini akan didapatkan molekul DNA yang berurutan dari
yang paling kecil sampai yang terbesar. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di
dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif. Makin
besar ukuran molekulnya, makin rendah laju migrasinya.
Visualisasi DNA selanjutnya dilakukan dibawah paparan sinar ultraviolet setelah
terlebih dahulu gel dalam pembuatannya ditambahkan larutan etidium bromid. Cara lain
untuk melihat visualisasi DNA adalah gel direndam di dalam larutan etidium bromid
sebelum dipaparkan di atas sinar ultraviolet. Ethidium Bromida merupakan bahan
mutagenik dan karsinogenik.

3. Praktikum Elektroforesis

Waktu dan Tempat : Praktikum Isolasi DNA dilakukan tanggal 11 November 2016

pukul 10.00-13.30 WIB di Laboratorium Terpadu

Fakultas Kedokteran Universitas Sumatera Utara, Medan.

a. Alat dan Bahan :


Alat:
- Satu set alat elektroforesis chamber kecil
- Lampu UV
- Erlemeyer
- Tabung ukur
Bahan:
- Larutan TAE (buffer TAE)
- Loading dye
- Ethidium Bromida
- Agarosa bubuk 2 %
- Larutan hasil isolasi DNA dan hasil PCR
b. Cara kerja:
Pembuatan gel agarose
1. Membuat stok TAE 1x dari TAE 50x
2. Untuk tiap 1000 ml stok TAE 1x
V1x N1 = V2x N2

V1 50x = (1/50)X1000ml

V150x = 20 ml

DDW( double distilled water) yang diperlukan adalah

V DDW = 1000 -20 ml

= 980 ml Siapkan 1x TAE (disiapkan dari 50X stok)

3. Membuat gel agarosa 2% dengan cara menyiapkan erlenmeyer, menimbang


0,7 gram agarosa dan memasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian menambahkan
35 ml TAE Buffer ( menggunakan chamber kecil)
4. Panaskan dalam microvawe sampai mendidih dan larutan jernih
5. Dinginkan agarose kira kira 60o C dan tambahkan 5 uL etidium bromide (10ml/mg)
dan camour hingga merata
6. Tuang larutan dalam tray dan pasang well forming combs tunggu kurang lebih 30
menit aau sampai gel mengeras.
7. Lepas well foeming combs secara perlahan lahan dan gel siap digunakan untuk
elektroforesis.
Proses Elektroforesis
1. Pasang tray ke dalam chamber elektroforesis, kemudian tuang larutan 1 x buffer
TAE ke dalam chamber tersebut hingga 1 mm diatas permukaan gel tersebut
2. Masukkan loading dye (1uL) + DNA (5 uL) ke dalam sumur
3. Tutup tray dan hubungkan alat elektroforesis dengan power supply, 100 mV selama
1 jam.
4. Amati pita-pita DNA yang terbentuk dengan menggunakan UV, kemudian
foto dengan kamera polaroid

c. Hasil Pengamatan dan Pembahasan

Gambar Tray berisi agarose

Gambar proses elektroforeksis berlangsung


Keterangan :

1 Marker
2 Kontrol negative

3-7 Produk PCR untuk gen fibrinogen

Pada sumur 1 terlihat adanya marker dimana band yang terbentuk dari
hasil elektroforesis adalah marker yang panjangnya 100 bp hingga 1000 bp
Pada sumur 2 yaitu kontrol negative terlihat tidak terbentuk band dari DNA, ini
menunjukkan kontrol negative tidak terkontaminasi (pada kontrol negative ini tidak
terdapat DNA didalamnya)
Pada sumur 3 s/d 7 merupakan produk PCR yang berada diantara 600-700 bp,
ini menujukkna gen yang didekteksi benar adanya gen fibrinogen.
Pada sumur 3 dan 5 band yang terlihat sangat halus dan kabur, sumur 4 dan 6 band
terlihat sangat jelas sedangkan pada sumur 7 terlihat pita yang yang tidak lurus (ada
bercak).
Kesimpulan
Terdapat beberapa kemungkinan penyebab DNA tidak terdeteksi setelah
dilakukan proses PCR. Kemungkinan penyebab antara lain berkaitan dengan
temperature dan lamanya siklus PCR serta kerusakan/kontaminasi pada komponen
PCR. Untuk itu diperlukan ketelitian dalam mengerjakan PCR, mulai dari
menyiapkan sample DNA hingga selesai.