Renewable Energy 37 (2012) 259e265

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Renewable Energy
j o u r n a l h o m e p a g e : w w w . e l se v i e r . c o m / l o c a t e / r e n e n e

Fermentation medium and oxygen transfer conditions that maximize the xylose conversion to
ethanol by Pichia stipitis
a b, * a b
Joo Paulo A. Silva , Solange I. Mussatto , Ins C. Roberto , Jos A. Teixeira
a
Department of Biotechnology, Engineering College of Lorena, University of So Paulo, Estrada Municipal do Campinho s/n, Cep: 12602-810, Lorena/SP, Brazil
b
IBB - Institute for Biotechnology and Bioengineering, Centre of Biological Engineering, Universidade do Minho, Campus de Gualtar, 4710-057, Braga, Portugal

article info RESUMEN

Article history: Se estudi la conversin de xilosa en etanol por Pichia stipitis. En un primer paso, se evalu la necesidad de suplementar el
Received 8 November 2010 medio de fermentacin con urea, MgSO _ {4} 7H _ {2} O, y / o extracto de levadura mediante un diseo factorial completo.
Accepted 20 June 2011 Available La adicin simultnea de estas tres fuentes alimenticias al medio de fermentacin, en concentraciones de 2,3, 1,0 y 3,0 g / l,
online 23 July 2011 respectivamente, mostr ser importante para mejorar la produccin de etanol en detrimento de la conversin del sustrato en
clulas. En una segunda etapa, los ensayos de fermentacin realizados en un biorreactor bajo diferentes condiciones KLa
(coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno) hicieron posible la comprensin de la influencia de la transferencia de
Keywords:
oxgeno en el rendimiento de la levadura, as como definir el rango de valores ms adecuado para Una produccin eficiente de
Xylose
etanol. La regin ms prometedora para realizar este proceso de bioconversin se encontr entre 2.3 y 4.9 h 1, ya que
Ethanol
promovi los mayores resultados de produccin de etanol con prcticamente agotamiento de la xilosa del medio. Estos
Pichia stipitis
hallazgos contribuyen al desarrollo de una tecnologa econmica y eficiente para la produccin a gran escala de etanol de
Nutrient
segunda generacin.
Volumetric oxygen transfer coefficient

1. Introduccin La xilosa es el principal azcar obtenido por hidrlisis de esta fraccin y su

El comienzo de este siglo est marcado por el gran incentivo dado al uso de
biocombustibles en sustitucin de la gasolina, motivado por varias razones,
entre ellas la subida de los precios del petrleo y el reconocimiento de que las
reservas mundiales de petrleo agotan rpidamente; La preocupacin por las
emisiones de combustible; Los requisitos del Protocolo de Kioto y el Plan de
Accin de Bali sobre las emisiones de carbono, as como la oferta de puntos
de venta alternativos para los productores agrcolas [1]. Actualmente el etanol
es el principal biocombustible utilizado en el mundo y las perspectivas
mundiales son la expansin de la produccin y consumo de etanol.
bioconversin es un paso importante en el uso de materiales lignocelulsicos
para la produccin de etanol. Pichia stipitis es una cepa de levadura
prometedora para aplicaciones industriales en la produccin de etanol debido
a su capacidad para convertir rpidamente xilosa en etanol, con alto
rendimiento [3e5]. Adems, esta levadura tambin es capaz de fermentar
varios otros azcares adems de la xilosa, incluyendo la glucosa, la manosa, la
galactosa y la celobiosa, junto con los oligmeros de manano y xilano [6], lo
cual es una caracterstica importante considerando que los hidrolizados
hemicelulsicos contienen usualmente estos otros azcares en mezcla con
Xilosa.

Los polisacridos presentes en materiales lignocelulsicos, incluyendo
celulosa y hemicelulosa, son de gran inters como materia prima para la
produccin de etanol de segunda generacin debido a su gran disponibilidad,
riqueza en azcares y principalmente porque no afectan la provisin de
alimentos. Sin embargo, aunque las tecnologas para producir etanol a partir
de azcar o almidn estn bien establecidas, las tecnologas para producir
bioetanol a partir de biomasa lignocelulsica estn todava en desarrollo en
todo el mundo. La hemicelulosa es uno de los tres componentes principales de
la biomasa lignocelulsica junto con la celulosa y la lignina, y puede ser
fcilmente hidrolizada a azcares monomricos en condiciones suaves [2]
Como es bien sabido, la eficacia de un proceso de fermentacin se ve
afectada por la composicin del medio de cultivo y las condiciones operativas
utilizadas. Diferentes cepas de levadura requieren diferentes fuentes y
cantidades de nutrientes para convertir eficientemente los azcares en el
producto de inters. Es posible que se requieran nutrientes especficos como
nitrgeno, oligoelementos o vitaminas para obtener una fermentacin rpida y
altos niveles de etanol, lo que es conveniente para minimizar los costos de
capital y la energa de destilacin [7]. Entre las condiciones operativas, la
disponibilidad de oxgeno se considera el factor ms importante que afecta a
la fermentacin de los azcares por las levaduras, ya que determina la
particin del flujo de carbono entre el crecimiento y la formacin del producto
[8]. El establecimiento de un nivel de oxgeno adecuado es por lo tanto de
gran importancia para obtener un proceso eficiente con
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Valores de conversin y productividad. En este sentido, el coeficiente de Table 1

transferencia volumtrica de oxgeno (KLa) es un parmetro importante que Experimental conditions for evaluation of the fermentation medium supplemen-tation with
se debe observar en las fermentaciones realizadas en biorreactores. El valor nutrients, on ethanol production and xylose consumption by Pichia stipitis.
de KLa depende de varios factores, como la velocidad de agitacin y el
caudal de aireacin, la geometra del reactor, las propiedades reolgicas del Assay Variables Responses
medio (densidad y viscosidad) y las variables ambientales (temperatura y
presin) [9]. A travs del valor de KLa, la transferencia de oxgeno para Urea MgSO4 7H2O Yeast Total Maximum
g/l g/l extract consumed ethanol
diferentes procesos pueden ser comparados, y las operaciones de ampliacin
g/l xylose (%) production
para la geometra de los diferentes biorreactores se facilitan [10].
(g/l)
1 0.0 0.0 0.0 4.0 0.00
Aunque se han llevado a cabo varios estudios sobre la produccin de etanol a 2 2.3 0.0 0.0 5.8 0.00
partir de xilosa, queda mucho por hacer para lograr altos rendimientos y 3 0.0 1.0 0.0 4.8 0.00
productividades de etanol. Con el objetivo de contribuir al desarrollo de una 4 2.3 1.0 0.0 8.1 0.00
tecnologa eficiente para la produccin a gran escala de etanol de segunda 5 0.0 0.0 3.0 47.3 15.70
generacin, el presente estudio evalu la influencia de la composicin del 6 2.3 0.0 3.0 60.3 19.83
7 0.0 1.0 3.0 45.5 15.17
medio y el coeficiente volumtrico de transferencia de oxgeno sobre la
8 2.3 1.0 3.0 74.0 24.17
produccin de etanol de P. stipitis. Inicialmente, los ensayos en frascos de 9 1.15 0.5 1.5 41.0 12.25
Erlenmeyer revelaron la necesidad de complementar el medio con urea, 10 1.15 0.5 1.5 40.5 12.21
MgSO _ {4} 7H _ {2} O, y / o extracto de levadura. En un segundo paso, los 11 1.15 0.5 1.5 42.2 12.20
ensayos en biorreactor bajo diferentes condiciones de KLa hicieron posible la
comprensin de la influencia de la transferencia de oxgeno en el rendimiento
de la levadura, as como definir el intervalo ms adecuado de valores para una 2.3. Determinacin de KLa
produccin eficiente de etanol por esta cepa de levadura. Para la determinacin de KLa, inicialmente se calibr la sonda de oxgeno
polarogrfico a presin atmosfrica ajustando cero y 100% de saturacin bajo
2. Materiales y mtodos nitrgeno y burbujeo de aire, respectivamente. A continuacin, el biorreactor
2.1. Microorganismo e inculo se llen con el medio de cultivo no inoculado con clulas, y el oxgeno se
P. Stipitis NRRL Y-7124 fue el microorganismo utilizado en los experimentos. separ del medio por burbujeo con nitrgeno. En la secuencia, se monitoriz
Los cultivos de esta levadura se mantuvieron en agar de agar de extracto de el curso del tiempo de saturacin de oxgeno a medida que se reanudaban las
malta a 4C. Para la preparacin de inculo, las clulas de la levadura en el condiciones de flujo de aire y agitacin elegidas para uso durante la
medio de mantenimiento se transfirieron a matraces Erlenmeyer de 500 ml fermentacin. El valor de KLa se calcul mediante la forma integrada de la
que contenan 100 ml del medio compuesto por ecuacin propuesta por Stanbury et al. [11], donde el valor de KLa es igual a
la pendiente de la recta resultante que representa el ln (C * CL) en funcin del
(G / l): xilosa (30,0), glucosa (5,0); Arabinosa (5,0); Urea (2,3), MgSO _ {4} tiempo.
7H _ {2} O (1,0), y extracto de levadura (3,0). Los matraces inoculados se
incubaron a 30C, 200 rpm, durante 24 h. Despus de este tiempo, las clulas 2.4. Mtodos analticos y determinacin de parmetros de fermentacin
se recuperaron por centrifugacin (2000 g, 20 min) y se resuspendieron en el El crecimiento celular se estim midiendo la absorbancia del caldo de
medio de fermentacin para obtener una concentracin inicial de 1 g / l. fermentacin a 600 nm, que se correlacion con una curva de calibracin
(densidad ptica en peso seco). Las concentraciones de glucosa, xilosa,
arabinosa y etanol se determinaron mediante cromatografa lquida de alta
2.1. Medio de fermentacin y condiciones resolucin (HPLC) en un cromatgrafo Jasco equipado con un detector de
Para evaluar la influencia de la composicin del medio en la produccin de ndice de refraccin y una columna Bio-Rad Aminex HPX-87H (300 7,8 mm)
etanol, se realizaron ensayos en matraces Erlenmeyer de 125 ml que a 60C, usando 0,005 M como eluyente en un caudal de 0,7 ml / min.
contenan 50 ml de una solucin de xilosa de 90 g / l suplementada o no con
nutrientes (urea, MgSO4 7H2O o extracto de levadura) Los matraces se El factor de rendimiento de etanol (YP / S, g / g) se calcul mediante la
inocularon con una concentracin inicial de clulas de 1 g / l y se mantuvieron relacin entre la concentracin de etanol (g / l) y el sustrato (glucosa xilosa)
en un agitador rotatorio a 30C, 150 rpm, durante 48 h. Los ciclos de consumida (g / l), mientras que el factor de rendimiento celular (Yx / S, G / g)
fermentacin se controlaron mediante muestreo peridico para determinar el se determin mediante la relacin entre la concentracin celular (g / l) y el
crecimiento celular, el consumo de xilosa y la produccin de etanol. sustrato consumido (G / l). La productividad volumtrica de etanol (QP, g / lh)
se defini por la relacin entre la concentracin mxima de etanol (g / l) y el
tiempo de fermentacin respectivo (h).
Para evaluar la influencia del coeficiente volumtrico de transferencia de
oxgeno (KLa) sobre la produccin de etanol, los ensayos se realizaron en un Table 2
biorreactor de tanque agitado de 1,6 l (Fermentador Benchtop Autoclavable Fermentation parameters obtained during the ethanol production from xylose by Pichia stipitis,
Tipo R'ALF, Bioengineering AG, Wald, Suiza), que contena 1,2 L de los under different KLa values.
siguientes Medio de fermentacin (g / l): xilosa (90,0), glucosa (15,0), KLa (h )
1
YP/S(g/g) Yx/S(g/g) QP(g/l h)
arabinosa (15,0); Urea (2,3), MgSO4 7H2O (1,0), y extracto de levadura 0.7 0.33 0.15 0.24
(3,0). Despus de inocular con 1 g / l de clulas, las operaciones de 2.3 0.26 0.13 0.27
4.9 0.32 0.15 0.32
fermentacin se mantuvieron a 30C durante 96 h. Los valores de KLa usados
11.7 0.30 0.19 0.33
en cada ensayo se muestran en la Tabla 2. Durante los experimentos, se 12.1 0.31 0.18 0.34
tomaron muestras cada 12 h para determinaciones de azcares, etanol y 18.7 0.23 0.21 0.38
crecimiento celular. 58.0 0.13 0.51 0.17
65.8 0.00 0.54 0.00

YP/S: ethanol yield factor; Yx/S: cell yield factor; QP: ethanol volumetric productivity.
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2.5. Anlisis estadstico
Los ensayos de fermentacin para evaluar la influencia de la composicin del
medio sobre la produccin de etanol se realizaron de acuerdo con un diseo
factorial completo (Tabla 1), variando las cantidades de urea, MgSO 4 7H2O y
extracto de levadura aadido al medio de fermentacin. Los parmetros, YP /
S, Yx / S, y QP se tomaron como respuestas de este diseo experimental. El
anlisis estadstico de los datos se llev a cabo utilizando los softwares
Design-Expert 5.0 y Statistica 6.0.
3. Resultados y discusin
3.1. Influencia de la composicin del medio sobre la conversin de
xilosa a etanol por P. stipitis.
La definicin de la composicin de un medio de fermentacin se considera
una forma importante de aumentar la productividad de los procesos de
bioconversin y, por tanto, este fue el primer objetivo de nuestro estudio.
Adems, se sabe que la conversin de xilosa en etanol est influenciada por
factores nutricionales, incluyendo vitaminas y fuentes de nitrgeno, pero que
esta dependencia vara dramticamente segn el gnero y la especie de
microorganismos utilizados, e incluso por la cepa dentro del mismo gnero y
especie [ 12]. Dicha diversidad de requerimientos de nutrientes implica que la
optimizacin de cada cepa individual es necesaria para disear un medio
apropiado definido para aplicaciones experimentales, o para buscar un medio
econmico complejo para consideracin comercial [13]. Por otra parte, el
conocimiento sobre la influencia de las fuentes de nutrientes en la produccin
de etanol por P. stipitis har posible entender los requerimientos de esta cepa
de levadura para un buen rendimiento de bioconversin y ser til para el
desarrollo de una tecnologa eficiente para la produccin De etanol de
segunda generacin.
Tres fuentes nutricionales diferentes, a saber, urea, MgSO4 7H2O y extracto
de levadura, se eligen para complementar el medio de xilosa para la
produccin de etanol por P. stipitis, ya que se utilizan comnmente para
componer medios de fermentacin para diferentes microorganismos y han
demostrado ser de gran importancia Para un buen desarrollo de diferentes
cepas de levadura. La Tabla 1 muestra las condiciones experimentales
evaluadas en este estudio y los resultados obtenidos. Como se puede observar,
se encontraron variaciones significativas en la produccin de etanol y
consumo de sustrato segn la fuente de nutrientes aadida al medio de
fermentacin. La produccin de etanol no ocurri cuando el medio no fue
suplementado con nutrientes (ensayo 1), lo que revela que P. stipitis necesita
asimilar nutrientes para producir etanol. En ausencia de estas fuentes, la
levadura slo consuma alguna fuente de carbono para el crecimiento celular.
Entre los tres nutrientes evaluados, el extracto de levadura fue probablemente
el ms importante para la produccin de etanol por P. stipitis, ya que no hubo
produccin de etanol en los ensayos no suplementados con este nutriente
(ensayos 1 a 4) y el consumo de sustrato Era demasiado baja (<10%).
Adems, el medio de fermentacin suplementado slo con extracto de
levadura tuvo 47,3% de consumo de sustrato despus de 48 h de
fermentacin, con una produccin de etanol de 15,7 g / l. El extracto de
levadura es una mezcla de aminocidos, vitaminas y magnesio [14], que
tambin ha sido considerada una fuente nutricional importante para la
produccin de etanol por otras cepas de levadura incluyendo Saccharomyces
cerevisiae [15] y Kloeckera africana [16]. Segn algunos autores, el extracto
de levadura tiene efectos protectores sobre el crecimiento, la viabilidad y la
fermentacin, que estimulan la tasa de fermentacin y la produccin de etanol
[17, 18]. La suplementacin del medio slo con urea o MgSO 4 7H2O, no se
har posible la produccin de etanol por P. stiptis. Sin embargo, la adicin de
urea en presencia de extracto de levadura tuvo una influencia positiva en la
produccin de etanol y el consumo de sustrato, como se puede observar
fcilmente comparando los ensayos 5 y 6 y 7 y 8 (Tabla 1). La urea tambin
se ha informado como un nutriente de gran influencia en la produccin de
etanol de S.Cerevisae.
261
Un anlisis comparativo entre los ensayos 6 y 8 (no completados y
suplementados con MgSO _ {4} 7H _ {2} O, respectivamente) revel
tambin un aumento de aproximadamente 20% en la produccin de etanol
debido a la adicin de MgSO _ {4} 7H _ {2} O al medio de fermentacin.
Este resultado sugiere un posible efecto de interaccin positivo entre la urea y
MgSO4 7H2O, ya que la adicin de sulfato de magnesio en presencia de
extracto de levadura solamente, no tuvo el mismo efecto positivo en la
produccin de etanol (ver ensayos 5 y 7, Tabla 1). Otros autores tambin han
informado de mejoras en la produccin de etanol por otras cepas de levadura,
al complementar el medio de fermentacin con iones de magnesio [7, 19e21].
El magnesio parece proteger las clulas de levadura durante la fermentacin
por un mecanismo que resulta en la disminucin de la permeabilidad de la
membrana plasmtica bajo etanol condiciones de estrs [20, 21].
El medio de fermentacin suplementado con las tres fuentes nutricionales en
las concentraciones mximas evaluadas (ensayo 8, Tabla 1) dio la mejor
produccin de etanol, que fue 2 veces superior a la obtenida en los ensayos de
punto central (9e11) que contena tambin los tres Pero con valores de
concentracin iguales a la mitad de los del ensayo 8. Estos resultados
permiten concluir que no slo la presencia de los nutrientes sino tambin su
concentracin en el medio de fermentacin influyeron en la produccin de
etanol por P. stipitis. Esta conclusin es vlida para el rango de
concentraciones utilizadas en el presente estudio, ya que la suplementacin de
nutrientes en exceso se informa que causan inhibicin osmtica en el
metabolismo de la xilosa [13].
Fig. 1 Muestra los valores de parmetros de fermentacin obtenidos para
cada ensayo experimental. Obsrvese que algunos experimentos (1e4) dieron
valores nulos de factor de rendimiento de etanol (YP / S) y productividad
volumtrica (QP), ya que no hubo produccin de etanol en estos medios. Los
valores ms altos de YP / S de aproximadamente 0,40 g / g se obtuvieron para
los ensayos 5e8 (Figura 1a). La pequea variacin en los valores YP / S en
estos ensayos indica que la adicin de extracto de levadura fue posiblemente
el factor con mayor influencia en esta respuesta. Por otra parte, slo el ensayo
8 dio el mayor valor de QP (0,50 g / lh, Fig. 1c), que fue significativamente
diferente de los obtenidos en los otros ensayos de fermentacin. En este
experimento, el medio de fermentacin se suplement con todas las fuentes de
nutrientes en sus valores mximos de concentracin, lo que sugiere que la
adicin de todos los nutrientes (urea, MgSO4 7H2O y extracto de levadura)
en su concentracin ms elevada, positivamente E influy significativamente
en una formacin ms rpida de etanol.
En contraposicin a los resultados YP / S, se obtuvieron los valores ms altos
del factor de rendimiento celular (Yx / S, Fig. 1b) en los ensayos 1e3, donde
no se produjo la produccin de etanol y el medio no contena fuentes de
nitrgeno. Sin embargo, la elevada conversin del sustrato en clulas en estos
ensayos puede atribuirse al bajo consumo de sustrato (menos del 5%, Tabla
1), y no a un alto crecimiento celular. Para los ensayos con produccin de
etanol (5e11), los valores Yx / S presentaron pocas variaciones, con valores
entre 0,10 y 0,13 g / g.
Para una mejor comprensin de la influencia de cada nutriente en la
produccin de etanol de xilosa por P. stipitis, se realiz un anlisis estadstico
de las respuestas YP / S, Yx / S y QP. Las grficas de Pareto para la
estimacin de efectos revelaron que slo la variable C (extracto de levadura)
present un efecto positivo y significativo al 95% de confianza para la
respuesta YP / S (Figura 2a). Para las otras respuestas, Yx / S (Figura 2b) y
QP (Figura 2c], todas las variables independientes, as como sus interacciones
mostraron una influencia significativa en p <0,05.
262 J.P.A. Silva et al. / Renewable Energy 37 (2012) 259e265
Higo. 1. Valores de los parmetros de fermentacin: (a) factor de rendimiento de
etanol, YP / S, (b) factor de rendimiento celular, Yx / S, y (c) productividad volumtrica
de etanol, QP, obtenida durante la produccin de etanol a partir de xilosa por Pichia
stipitis , De diferentes medios de cultivo segn un diseo experimental.
Sin embargo, las variables A (urea), B (MgSO4 7H2O) y C (extracto de
levadura) y la interaccin AB mostraron efectos negativos para Yx / S,
mientras que todas las variables e interacciones mostraron efectos positivos
para QP. Esto significa que la adicin de urea (2,3 g / l), MgSO4 7H2O (1,0
g / l) y extracto de levadura (3,0 g / l) favoreci la produccin de etanol,
mejorando el rendimiento y la productividad del etanol en detrimento de la
conversin del sustrato en clulas .
3.2. Influencia de KLa sobre la conversin de xilosa a etanol por P. stipitis
Despus de definir la mejor composicin del medio de fermentacin para la
produccin de etanol por P. stipitis, los ensayos se realizaron en biorreactor
para definir un nivel adecuado de transferencia de oxgeno para maximizar los
resultados de este proceso de bioconversin. Estos experimentos se realizaron
en un medio de fermentacin que contena glucosa y arabinosa en mezcla con
xilosa, ya que estos azcares estn usualmente presentes en los hidrolizados
hemicelulsicos usados para la segunda generacin de produccin de etanol.
El comportamiento cintico del crecimiento celular, el consumo de azcares
(glucosa y xilosa, ya que la arabinosa no fue consumida por la levadura
durante el tiempo de fermentacin considerado), y la produccin de etanol
para estos ensayos se muestran en la Fig. 3. Es evidente que en el rango de
valores estudiado, las variaciones de KLa (0.7e65.8 h 1) afectaron
fuertemente al bioproceso. Los azcares
Higo. 2. Los grficos de Pareto para los efectos de las variables (A) urea, (B) MgSO4
7H2O y (C) extracto de levadura, as como sus interacciones, sobre los parmetros de
fermentacin: (a) factor de rendimiento de etanol, YP / S, (B) factor de rendimiento
celular, Yx / S, y (c) productividad volumtrica de etanol, QP, obtenida durante la
fermentacin de xilosa por Pichia stipitis. La longitud de cada barra es proporcional al
efecto estandarizado. Las barras que se extienden ms all de la lnea vertical
corresponden a efectos estadsticamente significativos a un nivel de confianza del
95%.
El consumo fue similar para varias condiciones KLa (Fig. 3a, def), pero la
cintica de la formacin del producto y el crecimiento celular presentaron
perfiles muy diferentes.
En conjunto, el crecimiento celular fue favorecido a mayor el valor de KLa
utilizado, mientras que la produccin de etanol tuvo el comportamiento
opuesto. Los ensayos con valores de KLa de 11,7 y 12,1 h 1 (Fig. 3d y e,
respectivamente), que pueden considerarse repeticiones, revelaron un
interesante comportamiento de conversin de xilosa por la levadura. Estos
ensayos alcanzaron valores mximos similares de concentracin de etanol y
clulas (aproximadamente 16 g / l) al final de la fermentacin (96 h), y
cuando se compararon con los otros experimentos, este valor de KLa cercano
a 12 h1 pareca ser Un punto de inflexin entre las concentraciones de clulas
y etanol, ya que para valores inferiores a 12 h 1 (Fig. 3aec) la concentracin
de etanol resultante fue mayor que la concentracin de clulas a 96 h;
Mientras que para valores superiores a 12 h 1 (figura 3feh), La concentracin
celular final fue ms elevada que la concentracin final de etanol.
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Higo. 3. Comportamiento cintico del crecimiento celular (- -), azcares (xilosa glucosa)
consumo (-B-) y produccin de etanol (-, -) por Pichia stipitis en un biorreactor de tanque
agitado bajo Diferentes valores de KLa: (a) 0,7 h 1; (B) 2,3 h ^ {1}; (C) 4,9 h 1; (D) 11,7 h ^
{1}; (E) 12,1 h ^ {1}; (F) 18,7 h ^ {1}; (G) 58,0 h ^ {1}, y (h) 65,8 h ^ {1}.
De hecho, la conversin de xilosa a etanol por P. stipitis se vio fuertemente
afectada por los valores de KLa superiores a 18,7 h 1, observndose pocos
(2,1 g / l, KLa 58 h 1) o ninguna formacin de etanol (KLa 65,8 h 1)
bajo estas condiciones. De forma opuesta, se obtuvieron concentraciones
celulares elevadas en estos experimentos, lo que indica que para estas
condiciones de transferencia de oxgeno, prcticamente todos los azcares
consumidos fueron metabolizados por la va oxidativa, reduciendo la
produccin de etanol y proporcionando un alto crecimiento celular. De
manera similar, Fiaux et al. [22] inform que P. stipitis no produce etanol a
partir de glucosa en condiciones aerbicas. Estos resultados sugieren que la
formacin de etanol por P. stipitis, tanto de xilosa como de glucosa como
fuente de carbono, depende de un suministro de oxgeno adecuado a las
clulas. El requisito previo de la oxigenacin para la formacin eficiente de
etanol a partir de glucosa o xilosa por P. stipitis debe atribuirse al transporte
del azcar, el crecimiento o una funcin mitocondrial intacta [23].
Adems de la baja formacin de etanol, los ensayos bajo los valores ms altos
de KLa (58 h 1 y 65,8 h 1) promovieron tambin azcares ms lentos
263
Consumo en comparacin con los otros experimentos, restando alrededor del
40% de los azcares en el medio despus de 96 h. Este hecho podra ser un
indicativo de la inhibicin en el transporte de azcares por oxgeno, similar al
efecto Pasteur. Las levaduras que presentan este efecto presentan una
reduccin en la tasa de consumo de azcares, siendo este efecto ms
pronunciado cuando la respiracin es la va predominante en el catabolismo
de los carbohidratos [24e26].
Un hecho interesante se observ durante la fermentacin formada con un
valor KLa de 18,7 h 1 (figura 3f). La produccin mxima de etanol en este
experimento (13,5 g / l) ocurri a las 36 h, y despus de este tiempo, parte del
etanol producido fue asimilado por las clulas, incluso en presencia de xilosa
en el medio de fermentacin. Al final de la fermentacin (96 h) la
concentracin de etanol se haba reducido a la mitad del valor mximo
alcanzado. La asimilacin de etanol por la levadura sugiere que el oxgeno fue
suministrado en exceso en este medio ya que las condiciones de alta
disponibilidad de oxgeno han sido reportados para favorecer la asimilacin
de etanol por P. stipitis [27]. La mayor produccin de etanol
(aproximadamente 26,5 g / l) se obtuvo utilizando valores de KLa de 2,3 o 4,9
h 1 (Fig. 3b yc, respectivamente). Estos ensayos presentaron tambin el
mayor consumo de sustrato, permaneciendo menos del 4% de los azcares
totales despus de 96 h de fermentacin, y alcanzaron una concentracin
celular de aproximadamente 15 g / l, que es prcticamente la mitad del valor
obtenido bajo condiciones de mayor transferencia de oxgeno .
La Tabla 2 muestra los valores de parmetros de fermentacin obtenidos para
cada condicin KLa. Obsrvese que los YP / S ms altos fueron encontrados
para valores bajos de KLa (entre 0,7 y 12,1 h 1), mientras que el mayor Yx / S
fue encontrado para valores altos de KLa (0,58 y 65,8 h 1). Diferentemente de
YP / S y Yx / S, los valores ms altos de QP no se encontraron en los
extremos de transferencia de oxgeno ms baja y ms alta, pero para los
valores de KLa intermedios (4.9e18.7 h 1).
Higo. 4 muestra las variaciones en las concentraciones de clulas y etanol, el
porcentaje de azcares consumidos y los valores de los parmetros de
fermentacin en funcin de la KLa utilizada. Para una mejor visualizacin del
comportamiento de estas respuestas, los datos se ajustaron a polinomios de
segundo orden, los cuales se ajustaron bien, presentando correlaciones entre el
88 y el 99%. Esta cifra muestra claramente que el aumento de KLa provoc
una reduccin en la concentracin mxima de etanol, as como en el
porcentaje de azcares consumidos, con estas dos curvas presentando
comportamientos similares, opuesto al observado para el crecimiento celular
(Figura 4a). Similar comportamiento se observ tambin durante la
conversin de xilosa a etanol por Candida shehatae [28] y durante la
conversin de glucosa a etanol por P. stipitis CBS 5774 [29] y P. stipitis CBS
6054 [23], donde las condiciones de oxgeno limitado Produccin de etanol.
Con respecto a los parmetros de fermentacin (Figura 4b), el incremento de
KLa provoc una reduccin en YP / S con incremento simultneo en Yx / S,
siendo la suma de estos dos parmetros mantenida cerca de 0,50 g / g. Por
otro lado, el valor mximo de QP descrito por el modelo ajustado (alrededor
de 0,40 g / lh) debera ocurrir para un valor de KLa cercano a 25 h 1 y, de
hecho, para los resultados obtenidos experimentalmente, se alcanz la
mxima productividad de etanol para Una KLa prxima a 19 h1 (Tabla 2). Sin
embargo, este valor de productividad no se puede atribuir a una alta
concentracin de etanol, sino al hecho de que, debido a la disponibilidad de
oxgeno, el etanol producido se asimil rpidamente reduciendo el tiempo en
que se obtuvo la concentracin mxima, lo que influy directamente en la
productividad valor.
Considerando los valores de KLa evaluados en el presente estudio, se
encontr que la regin ms prometedora para realizar la conversin de xilosa
en etanol por P. stipitis estaba entre 2,3 y 4,9 h 1, ya que promovi los
mayores resultados de produccin de etanol con prcticamente agotamiento
de la xilosa Desde el medio. Si se utilizan valores de KLa inferiores, se
obtienen valores de productividad ms bajos; Mientras que si se usan valores
de KLa ms altos, se alcanza un menor rendimiento de etanol.
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Higo. 4. Polinomios de segundo orden que representan las variaciones de: (a) produccin
mxima de etanol (-O-), azcares (xilosa glucosa) consumo (-, -) y concentracin celular (- -)
y (b) parmetros de fermentacin etanol Factor de rendimiento, YP / S (-O-), factor de
rendimiento celular, Yx / S (-, -) y la productividad volumtrica de etanol, QP (- -) durante la
conversin de xilosa a etanol por Pichia stipitis en funcin de KLa valor.
4. Conclusiones
Este trabajo permiti comprender los requerimientos nutricionales y de
oxgeno para maximizar la conversin de xilosa en etanol por P. stipitis. La
produccin de etanol fue fuertemente dependiente de la asimilacin de
fuentes nutricionales por la levadura. El extracto de levadura, como fuente de
aminocidos, vitaminas y magnesio fue el nutriente ms importante evaluado;
Sin embargo, la adicin de urea y MgSO _ {4} 7H _ {2} O tambin fue
necesaria para mejorar el rendimiento de la levadura. Dado que el etanol es un
producto de bajo valor, los nutrientes complejos como el extracto de levadura
no deben agregarse al medio de fermentacin debido a su alto costo. Sin
embargo, el conocimiento sobre estos requisitos de levadura permite evaluar,
en un paso siguiente, otras fuentes de nutrientes ms baratas para que el
proceso pueda ser eficiente y ms econmicamente realizado. La
disponibilidad de oxgeno al medio fue esencial para garantizar la produccin
elevada de etanol por P. stipitis, pero esta variable debe ser cuidadosamente
controlada ya que el exceso de oxgeno afecta el metabolismo de la fuente de
carbono, favoreciendo el crecimiento celular en detrimento de la formacin de
etanol. El uso de una transferencia de oxgeno adecuada durante la
fermentacin es fundamental para el crecimiento de las clulas y la
produccin eficiente de etanol. Los resultados aqu encontrados contribuyen
as a una mejor comprensin de la relacin entre los nutrientes, la respiracin,
el crecimiento y la produccin de etanol por P. stipitis de la xilosa como
principal fuente de carbono. Basado en estos
Se pueden proponer estrategias para promover una produccin eficiente y
econmica del etanol a partir de recursos lignocelulsicos, lo cual es de gran
inters para la produccin de segunda generacin de etanol a nivel industrial.
Acknowledgments
The authors gratefully acknowledge Santander, Fapesp, Capes, and CNPq
(Brazil).
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