Mantencin de las condiciones estriles

Equipamiento necesario
Preparacin del Medio de Cultivo
Sembrando a partir de cpsulas verdes
Sembrando a partir de semillas secas
Replantando protocormos
Desenfrascando almcigos y sus cuidados
Contaminacin por manipulacin

La verdad es que yo tambin estoy esperando semillas , es decir una de mis Phal y un
Dendrobium, las cuales estarn listas para dar a luz en Octubre y Noviembre .

Sobre lo concerniente a Germinacin In-Vitro, me pego el bichito hace ya harto tiempo,

nuestro comn amigo robert, el cual gentilmente en su oportunidad no solo me envi los
archivos necesarios para llevarla a cabo, sin que tambin me regal semillas de una bletilla
striata.

Bueno, yo inici el proceso ayer lunes, emple la frmula del pltano y esterilic por medio del
Horno.

Los tubos de ensayo y los frascos de cultivo estn actualmente con el Medio de Cultivo (Agar-
Agar) formado y me encuentro en espera de una semana antes de iniciar el proceso de
sembrado de las semillas, a fin de verificar que no existan contaminaciones. Maana subir
fotos de como quedaron.

Ahora les dejo como lo estoy llevando a efecto, creo que es la forma ms segura y fcil de
hacer germinar semillas de orquidea en forma casera.

Esto constituye parte de los archivos que me paso robert y una traduccin al espaol realizada
por el suscrito, de archivos de la pgina web de Lotte & Tomas Orchids.

Germinacin Asimbitica de Semillas

Mantener las condiciones estriles

En la germinacin simbitica y asimbiotica es esencial que todas las semillas, matraces,

instrumentos y medios se mantengan estriles en cada etapa del procedimiento de
germinacin. Si cualquier hongo o bacteria consiguen entrar a los matraces, crecer mucho
ms rpido que nuestras semillas o plantas de semilla y las matarn pronto.

Para prevenir estas contaminaciones, los matraces (incluyendo el medio) tienen que ser
esterilizados en un autoclave o ser puestos durante 30 minutos en el horno (150 C ).
Las semillas o plantulas (nodos,....) Debe ser esterilizados (por ejemplo con agua oxigenada) y
transferidos a los matraces sin introducir en ellos bacterias u hongos.

Formas de como se pueden mantener las condiciones esteriles:

Cmara de flujo de Laminar:

La cmara de flujo de laminar consta de un gabinete y una unidad de flujo de aire. La unidad
de flujo incluye un filtro muy fino (filtro hepa) que elimina todas bacterias y hongos. El aire
(estril) filtrado fluye fuera del gabinete y produciendo un rea estril dentro del mismo.
Antes de usar la cmara de flujo de laminar usted tiene que esterilizar la superficie interior del
gabinete con alcohol de 70 - 90 %.

Caja con Guantes:

Una caja con guantes consta de una caja de vidrio en que (por ejemplo un acuario) que es
cerrado, tiene un lado que se abre y que incluye dos aberturas para pasar las manos a travs
de el. Antes de que se empiece a trabajar se tiene que poner todo el equipo necesario,
matraces, semillas y productos qumicos dentro de la caja de guantes. Entonces/luego cerrar la
caja y rociar la zona dentro de la caja con una solucin desinfectante (por ejemplo alcohol)
para esterilizar el rea de trabajo.
Trabajar sobre agua hirviendo

sta es la manera ms barata y fcil de propagar orqudeas in vitro. En esta tcnica se usa el
hecho de que el rea donde hay vapor es estril. El tamao del rea estril depende del
dimetro de la olla usada.

Equipamiento necesario

Preparacin del Medio de Cultivo

Herramientas necesarias:
Vaso de laboratorio de 250 ml
Olla de vidrio, esmaltada o revestida de tefln Balanza
Embudo de vidrio (tipo laboratorio)
Horno
Algo para mover los medios que se cocinan (por ej una cuchara)

Artculos de consumo necesarios:

Frascos (potes, tubos de ensallo, ...)

Toallas de papel
Agua destilada
Etiquetas
Medio de cultivo
Papel aluminio

Vasos de cultivo para siembra de semillas (frascos madres)

Se de prever el empleo de tubos de ensayo para la siembra de semillas, estos debido a su

longitud no se calientan mientras se encuentran en el rea estril (vapor).

Vasos de cultivo para el replantio

Para el replantio se debe elegir frascos de aproximadamente 10-15 cm de alto con una
apertura ms pequea que 10 cm. Si el tamao de la apertura es ms grande que 10 cm., el
riesgo de contaminaciones aumenta muy rpido. Los frascos de comida de nios estn muy
bien.

Preparacin de los frascos:

Antes de usar los frascos de alimento para en el cultivo in vitro se debe quitar todos los restos
de alimento y etiquetas. Se debe comprobar si los frascos se pueden poner a 150 C, ya que
estarn bajo esta temperatura por 30 minutos, para matar todos los hongos y bacterias. A las
tapas de los frascos se les debe hacer un agujero pequeo, el cual debe ser taponado con
algodn.

Medios de cultivo.

El medio de cultivo es una gelatina qumica (o natural) que tiene la capacidad de hacer
germinar las semillas de orqudeas dentro de un frasco cerrado. La ventaja de usar medio de
cultivo es que todas las semillas frtiles pueden a germinar y transformarse en plantas. Claro
que existe una seleccin, mucho mas controlada que la seleccin natural que ocurre al aire
libre.

Los medios de cultivo fueron descubiertos hace varios aos y a medida que el tiempo fue
pasando fueron siendo mejorados, adaptados transformados y cambiados. Al cabo de muchos
aos cada laboratorio descubri su propia frmula (y cada profesional tambin) pero
analizando cada una de ellas llegamos a la conclusin de que todas tienen partes comunes y
son semejantes a las del Professor Knudson.

Veremos varias formulas, ya que todas funcionan, algunas son mejores que otras, y dentro de
un tiempo cada uno de ustedes habr optado por trabajar con una sola frmula especifica.
Todas las frmulas llevan un producto llamado agar agar, (gelatina vegetal sacada de una
especie de algas marinas). Se encuentra fcilmente en farmacias homeopticas, en
restaurantes o casas de comidas chinas. Tambin puede ser conseguido en laboratorios que
trabajen con bacteriologa o en centros que trabajen con "drosfilas" (moscas de la fruta).

Todas funcionan perfectamente siempre que el pH se encuentre dentro de la franja cida de

4.8 a 5, Hay que medirlo siempre con la mezcla caliente. En la frmula de tomates el pH ya es
el indicado. Una frmula muy usada es la del tomate con banana. (Ver tabla de frmulas)

Tabla de frmulas para Medios de Cultivo

1 Frmula de Knudson "C"

1.0 g de Nitrato de Calcio

0.250 g de Fosfato monopotsico
0.250 g de Sulfato de Magnesio
0.500 g de Sulfato de Amonio
0.025 g de Sulfato de Hierro
0.0075 g de Sulfato de Manganeso
20.0 g de azcar
10.0 g de agar agar
1000 ml de agua destilada

2 Frmula del pltano

100.0 g de pltano maduro hecho pur o licuado

10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina *
900 ml de agua destilada

3 Frmula del Tomate

250.0 g de tomate maduro y sanos, hacer una pasta y colar en colador muy fino.
10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina *
900 ml de agua destilada
4 Frmula de la Pia

200 ml de jugo de pia, dulce y madura

10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina *
800 ml de agua destilada

5 Frmula de Tomate con Zanahoria

100.0 ml de jugo de zanahoria

100.0 ml de jugo de tomate
10.0 g de agar agar
15.0 g de azcar
1.2 g Tiamina *
800 ml de agua destilada

6 Frmula de Tomate con pltano

40 g de pltano hecho pur o licuada

100.0 ml de jugo de tomate
10.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
1.2 g de Tiamina *
900 ml de agua destilada

7 Frmula del Profesor Burgeff

1.0 g de Nitrato de Calcio

0.250 g de Sulfato de Amonio
0.250 g de Sulfato de Magnesio
0.020 g de Sulfato de Hierro
0.250 g de Fosfato bipotsico
0.250 g de Fosfato monopotsico
20.0 g de azcar o miel de abejas
12.0 g de agar agar
1 litro de agua destilada

8 Frmula de La Garde

1.0 g de Sulfato de magnesio

1.0 g de Nitrato de Calcio
1.0 g de Fosfato monopotsico
1.0 g de Clorato de Calcio
0.500 g de Nitrato de Amonio
0.500 g de Carbonato de Amonio
0.050 g de Fosfato de Hierro
20.0 g de azcar
12.0 g de agar-agar
1 litro de agua destilada

9 Frmula usada en Hawai

1.5 cucharada de t de emulsin de pescado

1.0 cucharada de t de peptona
12.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
1 litro de agua destilada

10 Frmula ms Casera

3 cc de abono DynaGro 7-9-5 o 10-5-5

12.0 g de agar agar
20.0 g de azcar
2.0 g de carbn vegetal o carbn activado
5 tomates perita sin semillas (aquellos bien chiquitos)
150.0 ml de agua de coco
40.0 g de banana (mas o menos media banana)
800 ml de agua destilada

* 4 comprimidos de algn remedio compuesto de Tiamina (vitamina B1) de 300 mg. Puede ser
substituido por complejos polivitamnicos (Teragram M o Supradyn).

Preparacin del Medio de Cultivo

1. Preparar las cantidades correctas de compuestos del medio de cultivo por separado.

2. Poner el agua destilda a calentar en una olla de vidrio, esmaltada o revestida de tefln.

3. Encienda el horno a 150 C.

4. Cuando est a punto de hervir el agua se apaga el fuego y se virten en la olla los
componentes

5. Mezclar usando una cuchara de madera o de plstico hasta disolver todos los componentes

6. Mida el pH y ajustelo (use HCL para disminuirlo y NaOH para incrementarlo).

7. Distribuya el medio de cultivo en los tubos de ensallo y frascos. Tenga cuidado que el medio
de cultivo no entre en contacto con la apertura de los frascos, ya que esto puede ayudar a la
contaminacin por hongos y bacterias. El embudo de vidrio es sumamente til.

8. Cada frasco debe recibir en el fondo una cantidad de preparado de ms o menos 1

centmetro (50 ml) lo que nos permite hacer con cada litro de preparado mas o menos 20
frascos.

9. Terminado el fraccionamiento, tapamos bien los frascos. En los tubos de ensayo se debe
poner un tapn de algodn y pasamos a la otra etapa que ser la esterilizacin de los frascos y
del medio de cultivo

10. Ahora se debe cubrir los frascos con papel aluminio. En los tubos de ensayo se recomienda
cubrirlos con doble papel aluminio para asegurar que los tapones de algodn permanezcan en
su lugar. Por ltimo ponga todos los frascos en el Horno previamente encendido.

11. Despus de 30 minutos apague el horno pero no lo abra an. Permita que los frascos se
enfrien en el horno cerrado. Se recomienda preparar el medio de cultivo despus de la comida
de la noche, as los frascos pueden permanecer en el horno hasta la maana siguiente.
12. Saque los frascos del horno y djelos descansar al menos por 5 das para asegurarse que
estn estriles.

Esterilizando agua destilada

Cuando ocupe semillas secas, necesitar agua destilada estril para enjuagarlas despus que
hayan sido esterilizadas. Es muy fcil hacer agua destilada estril. Ponga agua destilada en un
frasco o jarra que se pueda tapar atornillandola, tpela sueltamente y cubra la tapa con papel
aluminio. Ahora puede esterilizar el agua junto con los frascos con el medio de cultivo en el
horno.

Sembrando a partir de semillas verdes

El interior de una cpsula de semillas de orquideas, si esta intacta, se encuentra naturalmente

estril. Si usted esteriliza el exterior de la cpsula y la abre bajo condiciones de esterilidad, las
semillas permanecern estriles. Este mtodo tiene la ventaja que las semillas mismas, no
necesitan ser esterilizadas (lo cual a veces les puede ocasionar dao). Adems, algunas
semillas, al ser tomadas de cpsulas que estan casi maduras, germinan ms rpido que
aquellas tomados de cpsulas maduras.

Herramientas necesarias:

Parrilla
Herramienta de replanto (Esptula)
Olla
Pinzas
Mechero de alcohol
Escalpelo
Guantes

Artculos de consumo necesarios:

Frascos o tubos de ensayo con medio de cultivo

Cloro (solucin blanqueadora)
Papel toalla
Frasco atornillable (de comida para bebes)
Ethanol al 70%
Bandas elsticas

Ventajas de las cpsulas verdes:

Fcil de esterilizar
No hay que esperar que la cpsula suelte sus semilla

Desventajas:

No hay seguridad al 100% de que las semillas de la cpsula se encuentren maduras y frtiles.
Muy a menudo las semillas en la cpsula no estn completamente secas, por lo tanto el
excedente de semillas no se puede guardar en el frigider (nevera) para un uso posterior.

Preparando el area de enfrascado:

Ocuparemos el vapor que se forma encima de una olla con agua hirviendo, para producir
condiciones estriles. Para minimizar el riesgo de contaminaciones se deben eliminar las
corrientes de aire tanto como sea posible. Cierre todas las ventanas y puertas mientras usted
esta enfrascando. En la imagen siguiente se puede ver un arreglo de instrumentos para
persona diestra.

Prximos pasos:

Abra el frasco con Ethanol al 70% y ponga en el sus pinzas y esptula. Ponga cerca de 3 cms. de
agua en la olla y encienda el quemador de la cocina. La temperatura del agua hirviendo debe
ser lo suficientemente alta como para producir un caudal constante de vapor. Tan pronto
como el agua comience a hervir, tome un poco de toalla de papel, emppela con Ethanol al
70% y sela para limpiar y desinfectar la parrilla. Cuando termine de limpiarla, pngala sobre la
olla.

Esterilizacin de la cpsula verde:

Cuidadosamente retire los restos de flor en la cpsula, a fin de reducir los riesgos de
contaminacin

Cpsula lista para esterilizacin

Enjuague su frasco atornillable con ethanol al 70% y luego llnelo con Cloro. Ponga la cpsula
dentro del frasco y asegrese de que quede completamente inmersa.

Sembrando las semillas:

Los siguientes pasos deben ser realizados en el rea estril (vapor). El tubo de ensayo abierto
y su tapn debe permanecer en el vapor hasta que sea cerrado nuevamente.
Despus de esterilizar la cpsula por 15 minutos, usted puede iniciar la apertura de la cpsula
en el rea estril. Pngase los guantes, empape una pieza de papel toalla con ethanol y djela
sobre la parrilla. Tome el frasco que contiene la cpsula y bralo sobre el vapor. Deje la tapa en
cualquier parte de la mesa y con las pinzas previamente flameadas transfiera la cpsula a la
pieza de papel que dejo en la parrilla. Mantenga sus pinzas por un corto momento en el agua
hirviendo y luego vuelva a dejarlas en el frasco con ethanol.

Abra la cpsula empleando las pinzas y el escalpelo previamente flameados. Despus

mantenga por un corto momento ambas herramientas en el agua hirviendo y vuelva a dejarlas
en el ethanol.
Tome un tubo de ensayo y remueva la tapa de aluminio. Deje la tapa de aluminio en la mesa
sobre un papel previamente empapado con ethanol.

Con las pinzas previamente flameadas, saque el tapn de algodn y djelo en la parrilla.

Flamee su esptula y tome algunas semillas con ella.

Transfieralas al interior del tubo dejndolas sobre el medio de cultivo. Despus mantenga la
esptula por un momento en el agua hirviendo y luego djela en el frasco con etanol.

Tome las pinzas que estan sujetando el tapn de algodn y vuelva a tapar el tubo. Mantenga
por un momento las pinzas en el agua hirviendo y vuelva a ponerlas en el etanol.
Flamee el tapn de algodn

Ponga la tapa de papel aluminio en el tubo de ensayo. Asegrese que el papel aluminio no se
mueva colocndole una banda elstica.

Tener presente:

Los frascos abiertos y sus tapas tienen que quedarse en el vapor hasta que sean cerrados otra
vez
No haga movimientos rpidos mientras los frascos esten abiertos en el vapor
No hable mientras los frascos esten abiertos sobre la parrilla (use mascarilla)

Cuidados posteriores:

Colocar los frascos en un alfizar como se muestra en la siguiente imagen. La temperatura

aproximada es de 20 C. Es muy importante prevenir el sol directo porque las semillas en los
frascos se achicharrarn con el. Si no se dispone de un alfizar se puede usar tubos
fluorescentes de 20 Vatios. Se aconseja colocar los frascos en sitios diferentes, segn sean las
necesidades de cada especie para germinar.

Sembrando a partir de semillas secas

Si usted quiere ocupar semillas secas, tiene que esperar hasta que la cpsula se abra. Cuando
la cpsula comienza a abrirse espontneamente, corte la cpsula y vace sacudiendo las
semillas secas sobre una hoja de papel. Antes del proceso de esterilizar las semillas se debe
remover todas las contaminaciones (las partes de la cpsula, tubos de polen...)

Herramientas necesarias:

Parrilla
Herramienta de replanto (Esptula)
Olla
Pinzas
Mechero de alcohol
Escalpelo
Guantes

Artculos de consumo necesarios:

Frascos o tubos de ensayo con medio de cultivo

Agua oxigenada al 2%
Papel toalla
Frasco atornillable (de comida para bebes)
Ethanol al 70%
Frasco de Agua destilada estril
Bandas elsticas

Ventajas del empleo de semillas secas:

Usted puede guardar parte de las semillas en el frigider o nevera para uso posterior.
Desventajas:

Alto riesgo de contaminacin ya que no es tn facil de esterilizar como las vainas verdes
Se debe esperar hasta que las cpsulas se abran

Preparando el rea de enfrascado:

Ocuparemos el vapor que se forma encima de una olla con agua hirviendo, para producir
condiciones estriles. Para minimizar el riesgo de contaminaciones se deben eliminar las
corrientes de aire tanto como sea posible. Cierre todas las ventanas y puertas mientras usted
esta enfrascando. En la imagen de abajo se puede ver un arreglo de instrumentos para
persona diestra.

Solucin de Agua Oxigenada al 2%:

Para reducir la concentracin del Agua Oxigenada comprada (por ej. H2O2 al 35%) al 2%
requerido, se le debe agregar agua destilada. Con la formula de abajo se puede calcular como
obtener una solucin al 2%.

Ejemplo:

ml de Cantidad buscada de Agua Oxigenada al 2% : 50 ml

Concentracin de la solucin comprada : 35%
Porcentaje de dilucin buscada : 2%
ml de Concentracin a diluir : X

Formula:

ml de Concentracin a diluir = (ml de Cantidad buscada * dilucin buscada) / Concentracin

X = ( 50 * 2 ) / 35
X = 2,86

En este ejemplo usted tiene que poner 2,86 ml de Agua Oxigenada (H2O2) al 35% en su Vaso
de Laboratorio de 250 ml y agregarle agua destilada hasta completar los 50 ml, para obtener
Agua Oxigenada con una concentracin del 2%.

Prximos pasos:

Abra el frasco con Ethanol al 70% y ponga en el sus pinzas y esptula. Ponga cerca de 3 cms. de
agua en la olla y encienda el quemador de la cocina. La temperatura del agua hirviendo debe
ser lo suficientemente alta como para producir un flujo constante de vapor. Tan pronto como
el agua comience a hervir, tome un poco de toalla de papel, emppela con Ethanol al 70% y
sela para limpiar y desinfectar la parrilla. Cuando termine de limpiarla, pngala sobre la olla.

Esterilizacin de las semillas secas:

Empaque sus semillas en papel filtro como se muestra abajo.

Ponga unos 3 cm de Agua Oxigenada al 2% en un frasco con tapa atornillable y luego coloque
el sobre de papel filtro con las semillas en el. Cierre fuertemente la tapa y agite el frasco por 10
minutos, asegurndose que el sobre este en contacto con la solucin de esterilizacin tanto
como sea posible.

Otra forma de esterilizar las semillas:

Las semillas solamente pueden ser esterilizadas con productos qumicos, pues otro recurso las
matara. De los productos qumicos mas fciles de conseguir y que todos tienen en casa,
usaremos el "aguajane" comercialmente llamado Cloro, Clorox, Agua lavandina etc.
Normalmente, estos productos de limpieza estn preparados a una concentracin del 22%,
esta indicacin est en el rtulo y debe ser observada atentamente. Para desinfectar las
semillas usamos una solucin preparada con agua destilada y cloro, que al final tendr una
concentracin que puede variar entre 6% y 10%. Para hacer una concentracin del 7.5% se
mezclan 1 ml de cloro en 10 ml de agua destilada.
Tomaremos un pequeo frasco con tapa (que puede ser de penicilina inyectable, un tubo de
ensayo pequeo o otro con capacidad de 5ml) y colocaremos una pequea cantidad de
semillas en su interior, llevando las semillas restantes nuevamente al refrigerador o nevera.
Despus verter unos 2 ml de la solucin preparada sobre las semillas, tapar y agitar por 8
minutos aproximadamente. Dejar descansar el frasco por aproximadamente 1 minuto en
posicin vertical. Durante este reposo observaremos en el frasco que una parte de las semillas
se deposita en el fondo y una otra parte queda flotando. Estas semillas que flotan son semillas
infrtiles y sern eliminadas. Pasado el minuto de descanso, tendremos que retirar lo mximo
posible el cloro y las semillas flotantes, lo que haremos con auxilio de una jeringa sin aguja (la
aguja se tapa con las semillas), y cuidando de no mover demasiado el frasco para evitar que las
semillas del fondo se levanten. Retirado el cloro debemos colocar en el frasco 2 ml de agua
destilada para lavar las semillas y retirar el exceso de cloro restante. Colocada el agua agitar
por un minuto que es suficiente. En un embudo, colocar un papel de filtro (de los usados para
colar caf) y voltear las semillas y el agua y esperar la absorcin del lquido, quedando sobre el
papel las semillas.

Sembrando las semillas:

Los siguientes pasos deben ser realizados en el rea estril (vapor). El tubo de ensayo abierto
y su tapn debe permanecer en el vapor hasta que sea cerrado nuevamente.
Despus de esterilizar las semillas usted puede comenzar a transferirlas a los tubos de ensayo.
Pngase los guantes, tome el frasco que contiene el agua destilada esteril y abralo en el vapor,
luego pngalo sobre la parrilla.

Ahora tome el frasco de las semillas y abralo en el vapor. Flamee sus pinzas y transfiera el
sobre al agua destilada estril.
Tome una toalla de papel y emppela con ethanol dejndola en la parrilla, despus de
enjuagar el sobre por algunos segundos en el agua destilada estril, muevalo con las pinzas
previamente flameadas a la toalla de papel. Flamee el escalpelo y con la ayuda de las pinzas
abra el sobre.

Mantenga su escalpelo y pinzas por unos momentos en el agua hirviendo y luego vuelva a
ponerlos en el frasco de ethanol.

Tome un tubo de ensayo y saque la tapa de papel aluminio dejndola en la mesa sobre una
toalla de papel previamente empapada con ethanol.
Tome nuevamente las pinzas y flameelas, luego saque con ellas el tapn de algodn y dje
ambos (pinzas y tapn de algodn) sobre la parrilla.

Flamee su esptula y tome algunas semillas con ella.

Transfiera las semillas directamente dentro del tubo dejndolas sobre el medio de cultivo.
Despus mantenga por un momento la esptula en el agua hirviendo dejndola luego en el
frasco de ethanol.

Tome las pinzas con el tapn de algodn y tape el tubo de ensayo. Mantenga por un momento
las pinzas en el agua hirviendo y luego djelas en el frasco de ethanol.

Flamee el tapn de algodn.

Ponga la tapa de papel aluminio en el tubo de ensayo. Asegrese que el papel aluminio no se
mueva colocndole una banda elstica.
Tener presente:

Los frascos abiertos y sus tapas tienen que quedarse en el vapor hasta que sean cerrados otra
vez
No haga movimientos rpidos mientras los frascos esten abiertos en el vapor
No hable mientras los frascos esten abiertos sobre la parrilla (use mascarilla)

Cuidados posteriores:

Colocar los frascos en un alfizar como se muestra en la siguiente imagen. La temperatura

aproximada es de 20 C. Es muy importante prevenir el sol directo porque las semillas en los
frascos se achicharrarn con el. Si no se dispone de un alfizar se puede usar tubos
fluorescentes de 20 Vatios. Se aconseja colocar los frascos en sitios diferentes, segn sean las
necesidades de cada especie para germinar.

Replantando protocormos

Herramientas necesarias:

Parrilla
Olla
Guantes
Vela
Pinzas

Artculos de consumo necesarios:

Frascos con medio de cultivo

Ethanol al 70%
Papel toalla

Cundo tengo que replantar mis protocormos ?

Deje crecer a los protocormos en el medio de cultivo mientras no se daen a si mismos o hasta
antes de que comiencen a formar sus primeras races. Mientras ms grandes y ms sanos sean,
tanto mejor sobrevivirn el replantio. Sembramos pequeas cantidades de semillas en los
frascos, entonces podemos esperar un poquito ms para que los protocormos sean ms
fuertes cuando los replantemos.

Protocormo de Encyclia vespa listo para replantar

Tcnica de replanto:

Los siguientes pasos deben ser realizados en el rea estril (vapor). El tubo de ensayo y
frascos abiertos asi como su tapn o tapa deben permanecer en el vapor hasta que sean
cerrados nuevamente.
Pngase los guantes, tome un tubo de ensayo (frasco madre) y quite la tapa de papel aluminio.
Deje la tapa de papel aluminio en la mesa sobre un papel toalla previamente empapado con
ethanol. Tome las pinzas y flameelas, luego saque con ellas el tapn de algodn y deje ambos
sobre la parrilla.
Ahora tome un frasco de replanto y quite la proteccin de papel aluminio en el rea estril
(vapor).

Abra el frasco y deje la tapa y el frasco de replanto en la parrilla.

A continuacin tome la esptula y psela por la flama de su vela para esterilizarla. Antes de
que usted recoja algn protocormo, introduzca la esptula en el medio de cultivo donde estos
crecen, para enfriarla.

Despus tome algunos protocormos y transfiralos al nuevo frasco.

Ahora sumerja su esptula en el agua hirviendo para limpiarla y coloque la limpia en el etanol
hasta que la necesite para el prximo frasco. Cierre el frasco replantado y colquelo sobre la
mesa para su posterior etiquetado.
Con los otros frascos de replanto proceda de la misma forma.

Desenfrascando plantones (seedlings)

Herramientas necesarias:

Pinzas
Si tiene frascos de vidrio: Corta vidrios y martillo

Artculos de consumo necesarios:

Sustrato para plantones o grnulos de arcilla

Hojas plsticas
Papel toalla
Cajas transparentes
Solucin desinfectante

Cundo debo desenfrascar mis plantones?

Deje a sus plantones crecer en el medio de cultivo mientras ellos no se daen a si mismos y
crezcan bien. Tanto ms grande ellos sean ms fcil ellos sobreviviran el desenfrascado. No
obstante lo anterior, la mejor temporada para llevarlo a efecto es la primavera.
estos plantones estn lo suficiente grandes para desenfrascarlos

Importante de saber

El medio de cultivo en los frascos contiene altas concentraciones de azucar (cerca de 20g/litro)
para efectos de un rpido crecimiento. Las plantas in vitro pueden obtener estos componente
muy fcil, es as que ellas detienen la fotosintesis. Dentro del frasco la humedad es sumamente
alta luego las plantas mantienen sus stomatas (aperturas para cambio de gas y respiracin)
abiertas todo el tiempo.
Mientras las stomatas estan abiertas la planta pierde agua pero al estar dentro del frasco no
son afectadas. En la vida silvestre las plantas abren su stomatas para absorber CO2 para
producir el azcar y otros compuestos necesarios. En la noche las plantas cierran su stomatas
porque sin la luz ellas no son capaces de transformar el CO2 a otros compuestos. Debido a los
restos de medio de cultivo en las raices (que hace que las stomatas sigan abiertas) y otras
contaminaciones en los plantones, estos pueden morir luego del desenfrascado.
Cuando usted limpia acusiosamente los restos de medios de cultivo, enjuagando el plantn en
agua quitada de frio pero no tibia y luego lo sumerge en una solucin desinfectante (fungicida
sitmico) antes de replantarla, est reduciendo al mnimo el riesgo de prdida.

Procedimiento de desenfrascado

En primer lugar tenemos que humedecer una toalla de papel. Ahora se debe llenar con 5 cm
de sustrato de plantones o grnulos de arcilla, una caja plstica y humedecerla. En el siguiente
paso se abre el frasco. Si el cuello de la botella o frasco es pequeo es mejor romper el fondo.
Retire las partes grandes de agar-agar y coloque los plantones en agua quitada de frio para
sacar todo el agar-agar restante. Trate de separar los plantones sin romper sus races y
coloquelos separados sobre el papel toalla. Ahora sumerja sus plantones por 10 - 15 minutos
en una solucin suave desinfectante (Fungicida sistemico al 50% de lo indicado en la etiqueta).
Despus ponga los plantones en cajas comunitarias y rieguelos (rocio fino) con la solucin
desinfectante suave. La siguiente imagen muestra como colocar los plantones en el sustrato.
Para proporcionar a nuestros plantones un ambiente hmedo, envolvemos la caja plstica con
un pedazo de hoja plstica. Coloque la caja en un lugar brillante, pero no soleado. Compruebe
cada 3 o 4 das si los grnulos de arcilla estn an bastante mojados. Los grnulos no
proporcionan ninguna sustancia nutritiva, entonces tenemos que "alimentar" nuestros
plantones con fertilizante de orqudeas (mitad concentracin) un vez cada 4 semanas.

con papel plstico selle la caja de plantones

Tan pronto como los plantones esten grandes para quedarse en la caja plstica se debe
separarlos otra vez y colocarlos en pequeas macetas (1 o 2 plantas en cada una). Para estos
plantones recomendamos una mezcla de corteza de pino, turba, styrofoam, grnulos de arcilla
y carbn de lea (1:1:1:1:1). El tamao de los componentes depende del tamao de los
plantones.
Plantones separados

Muy provechoso para el cultivo de los plantones separados es un invernadero en miniatura

como el que se muestra en la siguiete imagen. Aqu tenemos la ventaja de poder ajustar el
cambio de aire. Este nos da la posibilidad de fortalecer las plantas de durante un largo perodo
de tiempo.

Invernadero miniatura

Contaminaciones

Qu son la contaminaciones?

Si los hongos o bacterias comienzan a crecer sobre medios de cultivo, le llamamos una
contaminacin porque crecern ms rpido que las semillas de las orqudea y las matarn
pronto.
Cules son las fuentes de la contaminacin?

Existen diferentes causas por las cuales puede aparecer la contaminacin.

- Esterilizacin fallada
- Problemas en la tcnica de esterilizacin
- Tapas agujereadas

Cmo aparecen las contaminaciones?

Muchas contaminaciones pueden ser encontradas 3 a 4 das despus de enfrascar las semillas,
planteletes (nodos) o protocormos. Aqu hay algunas seales de contaminaciones:
- Crecimiento rpido de discos en el medio de cultivo
- Crecimiento rpido de alfombra en el medio de cultivo (como pequeos pelos)
- El medio de cultivo cambia a blanco y se vuelve lquido

Qu se debe hacer con frascos contaminados?

Es muy importante detectar la contaminacin en forma temprana, ya que crece en forma muy
rpida. Si usted detecta el inicio de una contaminacin, puede tratar de replantar en otro
frasco, limpiando las semillas o protocormos. Cuando usted cultiva nodos, puede esterilizar el
nodo con una solucin de Agua Oxigenada al 3% por 15 minutos y luego ponerlo en un nuevo
medio de cultivo.
Si alguno de sus frascos est contaminado y no es capaz de rescatarlo en el mismo da, debe
poner el frasco en un lugar oscuro y frio, ya que en esas condiciones la contaminacin
disminuir su crecimiento.

Bueno distinguidos foreros y Orquidiotas tooodos, espero que lo anterior sea de vuestro
agrado y lo ms importante, que sea til para vuestro empeo de "dar a luz una Orquidea