Isolasi dan Amplifikasi DNA dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction)

Khairunnisa
NIM : 10514004
Kelompok :2
Tanggal percobaan : Rabu, 12 April 2017
Tanggal pengumpulan: Rabu, 19 April 2017
Asisten : Annisa Auliya Aksa

Abstrak
Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah suatu metode untuk mengamplifikasi suatu
fragmen DNA tertentu. Pada percobaan kali ini, dilakukan amplifikasi fragmen DNA
bakteri E coli. Gen yang digunakan adalah gen 16s rDNA yang memiliki bagian yang
khas untuk tiap organisme sehingga dapat digunakan untuk mengidentifikasi tiap
organisme. Pada percobaan ini, tidak berhasil dilakukan amplifikasi fragmen DNA
dengan metode PCR yang dilakukan sebanyak 25 siklus. Hal ini ditunjukkan dari
hasil elektroforesis yang tidak menunjukkan adanya pita yang muncul. Kegagalan
amplifikasi DNA ini mungkin disebabkan adanya gelembung pada saat pencampuran
larutan DNA template menggunakan pipet mikro.
Kata kunci: PCR, DNA, amplifikasi

1. PENDAHULUAN
PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan 2.2. Metodologi
suatu metode in vitro untuk mengamplifikasi Pertama sebanyak 40 L ddH2O steril
suatu fragmen DNA tertentu. PCR terdiri dari 3 dimasukkan ke dalam microtube 1.5 L.
tahap utama, yaitu denaturasi, annealing Kemudian bakteri yang sudah diinokulasi
(penempelan primer), dan extension dimasukkan ke dalam microtube menggunakan
(pemanjangan). Proses denaturasi dilakukan tusuk gigi yang steril. Lalu microtube
pada suhu 94 C, proses annealing dilakukan dipanaskan dalam penangas air mendidih selama
pada suhu 51 C, dan proses extension dilakukan 10 menit. Setelah 10 menit, micotube
pada suhu 72 C. Pemilihan suhu ini didinginkan dalam suhu ruang dan disentrifugasi
berdasarkan pada kondisi ideal masing-masing selama 1 menit. Lalu supernatan dari hasil
tahap agar tahap berjalan dengan optimal. sentrifugasi dipindahkan ke microtube steril.
Untuk proses PCR, kedalam 4 microtube steril,
2. METODOLOGI
2.1. Alat dan Bahan dimasukkan buffer Kappa mix sebanyak 24.5
Mesin PCR L. Lalu dimasukkan: 0.5 L supernatan ke
Pipet mikro microtube 1, 0.5 L ddH2O ke microtube 2
Microtube sebagai kontrol negatif, dan 0.5 L DNA
Cetakan gel agarose kromosom ke microtube 3. Setelah itu ketiga
Chamber elektroforesis agarosa microtube dimasukkan ke dalam PCR dengan
Agarosa bagan pengaturan kondisi terlampir. Lalu hasil
Buffer Kappa mix PCR dielektroforesis pada gel agarosa 0.75%
Loading buffer DNA dalam buffer TAE 1x dengan pewarna etidium
ddH2O steril bromida. Elektroforesis dilakukan pada 80 V
Bakteri selama 35 menit dengan penyiapan sampel yang
dicampur pemberat perbandingan 5:1 dan
hasilnya diamati dengan UV transilluminator.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Pada percobaan kali ini, dilakukan isolasi dan
amplifikasi fragmen DNA menggunakan metode
PCR. Sebelum proses PCR, dilakukan tahap lisis
sel bakteri terlebih dahulu. Metode lisis yang
digunakan pada percobaan ini adalah dengan
melakukan sentrifugasi dan pemanasan. Selain
itu juga ditambahkan ddH2O sebagai pelarut
DNA yang kita inginkan, sehingga DNA akan
terlarut dan molekul lainnya akan mengendap.
ddH2O dipilih sebagai pelarut karena tidak
mengandung agen pengkelat yang akan
mengganggu kerja enzim polimerase dalam
proses PCR. Supernatan hasil sentrifugasi akan
dipisahkan dan digunakan sebagai DNA
template.
Setelah tahap lisis selesai, kemudian dilakukan
tahap PCR. PCR (Polymerase Chain Reaction)
merupakan suatu metode in vitro untuk
mengamplifikasi suatu fragmen DNA tertentu.
DNA yang akan di amplifikasi berasal dari gen
16s rDNA. Gen jenis ini terdapat di semua jenis
organisme prokariotik. Gen 16s rDNA memiliki
2 daerah, yaitu daerah konservatif dan variatif.
Daerah konservatif adalah daerah yang sama di
semua prokariot, sedangkan daerah variatif
adalah daerah yang memiliki urutan basa
nukleotida yang khas sehingga tiap organisme
dapat dibedakan melalui DNA nya. Pada PCR di
percobaan ini, selain mengamplifikasi DNA
template, digunakan juga 2 campuran lain yang
berfungsi sebagai kontrol. Yang pertama adalah
campuran yang ditambahkan dengan DNA
kromosom. Campuran ini merupakan kontrol
positif karena sudah pasti mengandung DNA
sehingga saat dielektroforesis, akan nampak pita.
Campuran kedua adalah campuran yang
mengandung ddH2O, tanpa DNA sama sekali.
Campuran ini berfungsi sebagai kontrol negatif
karena dapat dipastikan tidak akan mengandung
DNA dan tidak akan muncul pita pada saat
elektroforesis.
Amplifikasi DNA dengan PCR dilakukan
dengan menggunakan primer oligonukleotida.
Primer ini merupakan DNA rantai tunggal
pendek yang berkomplemen dengan DNA
template. PCR terdiri dari 3 tahap utama, yaitu
denaturasi, annealing (penempelan primer), dan
extension (pemanjangan). Proses denaturasi
dilakukan pada suhu 94 C. Pada tahap ini,
terjadi pemutusan ikatan hidrogen yang
menghubungkan untai double helix DNA. Proses
selanjutnya adalah annealing atau penempelan
primer. Proses penempelan primer ini biasanya
dilakukan pada suhu 45-60 C, bergantung pada
suhu optimum enzim yang digunakan. tahap
terakhir adalah extension atau pemanjangan.
Pada tahap ini, masing-masing untai DNA
template akan memulai proses pemanjangan
setelah ditempeli oleh primer. Proses ini
biasanya dijalankan ada suhu 72 C. Banyaknya
fragmen DNA yang dihasilkan di proses PCR
dengan jumlah n siklus dapat dihitung dengan
rumus:
2n-2n
Agar amplifikasi fragmen DNA pada PCR
berhasil, dibutuhkan beberapa reagen yang
sudah tercampur dalam buffer Kappa mix.
Buffer Kappa mix terdiri dari campuran Dream
Taq polimerase, buffer Dream Taq polimerase,
primer maju dan primer mundur, MgCl 2 dan
dNTP. Dream Taq polimerase adalah enzim
polimerase yang digunakan untuk
memperbanyak fragmen DNA yang diinginkan,
sedangkan buffer Dream Taq polimerase adalah
buffer khusus untuk enzim ini untuk menjaga
kondisi reaksi agar enzim dapat bekerja secara
optimal. Reagen selanjutnya adalah dNTP.
dNTP, yang terdiri dari dATP, dTTP, dGTP,
dCTP, berfungsi sebagai sumber asam amino
dan juga sebagai building block pada saat proses
perpanjangan rantai DNA. MgCl2 berfungsi
sebagai kofaktor untuk enzim DNA polimerase.
Primer adalah bagian penting dari polimerisasi
fragmen DNA karena primer berfungsi untuk
menginisiasi proses pemanjangan rantai. Pada
PCR digunakan 2 jenis primer yaitu primer maju
dan primer mundur. Primer maju adalah primer
yang menginisiasi proses pemanjangan pada
bagian depan dari fragmen DNA yang kita ingin
amplifikasi, sedangkan primer mundur adalah
primer yang menginisiasi proses transkripsi
pemanjangan dari bagian belakang fragmen
DNA yang kita inginkan. Jika hanya digunakan
primer maju saja atau primer mundur saja, maka
proses pemanjangan akan terus berlanjut
sehingga kita tidak akan mendapatkan fragmen
DNA yang kita inginkan.
Berikut adalah hasil elektroforesis dari hasil
PCR yang didapatkan:
Pita yang terlihat di hasil elektroforesis hanyalah
pita dari kontrol positif. Pita dari hasil PCR
DNA template tidak muncul mungkin karena
disebabkan pada saat pencampuran larutan
menggunakan pipet mikro terlalu banyak
gelembung yang muncul. Adanya gelembung
dapat mengacaukan susunan protein yang
menyusun DNA sehingga DNA menjadi rusak
dan gagal diamplifikasi.
Aplikasi metode PCR sangat banyak. Salah
satunya adalah Restriction Fragment Length
Polymorphisms PCR (RLFP-PCR). Teknik ini
menggunakan enzim restriksi untuk mengetahui
adanya polimorfisme dan kemudian hasil
digestinya dapat diamplifikasi dengan PCR.
Contoh lainnya adalah Variable Number of
Tandem Repeat Sequence (VNTR-PCR) dan
Short Tandem Repeats (STR-PCR). Teknik ini
sering digunakan di bidang forensic. Dengan
menggunakan primer yang tepat, variasi
pengulangan sekuens basa nukleotida pada DNA
sampel dapat diketahui.
KESIMPULAN
Fragmen DNA belum berhasil diamplifikasi
menggunakan metode PCR. Ketidakberhasilan
ini dilihat dari tidak adanya pita di hasil
elektroforesis gel agarosa hasil PCR.
DAFTAR PUSTAKA
D. Handoyo and A. Rudiretna, Prinsip
umum dan pelaksanaan Polymerase Chain
Reaction (PCR), Unitas, vol. 9, no. 1, pp. 17
29, 2001.
T. Rinanda, ANALISIS SEKUENSING
16S rRNA DI BIDANG MIKROBIOLOGI,
Jks, vol. 3, pp. 172177, 2011.
M. Radji, A. Puspaningrum, and A.
Sumiati, Deteksi Cepat Bakteri Escherichia coli
dalam Sampel Air dengan Metode Polymerase
Chain Reaction menggunakan Primer 16E1 dan
16E2, J. Makara Sains, vol. 14, no. 1, pp. 39
43, 2010.
H. Bokhari, M. A. Shah, S. Asad, S. Akhtar,
M. Akram, and B. W. Wren, Escherichia coli
pathotypes in Pakistan from consecutive floods
in 2010 and 2011, Am. J. Trop. Med. Hyg., vol.
88, no. 3, pp. 519525, 2013.
S. Saxena, J. Verma, Shikha, and D. Raj
Modi, RAPD-PCR and 16S rDNA phylogenetic
analysis of alkaline protease producing bacteria
isolated from soil of India: Identification and
detection of genetic variability, J. Genet. Eng.
Biotechnol., vol. 12, no. 1, pp. 2735, 2014.
Ih engga salahhhhh.