Nmero
Ingredientes gramos por litro de agua
1 3 4 6 10 16
Concentracin 1% 0.1 M 0.1 M 10 % 0.2 M 0.1 M
pH 6.0 0.05 8.0 0.1 4.5 0.05 6.0 0.05 10.5 0.1 7.0 0.2
K2HPO4 2 16.73 - 20 35 13.6
KH2PO4 8 0.523 13.61 80 - 4
KOH 10 N - - - - 2.0 (mL) -
6.6 0.1
6.6 0.1
7.9 0.1
5.9 0.1
7.2 0.1
7.2 0.1
8.3 0.1
5.6 0.1
6.1 0.1
6.6 0.1
7.0 0.1
7.0 0.1
7.3 0.1
7.9 0.1
6.7 0.2
6.8 0.1
pH despus de esterilizar
(1)
Utilizar peptona de carne o casena.
(2)
Agregar despus de hervir el medio de cultivo.
* Equivalente al medio de cultivo Antibitico Nm. 12.
Tabla 0100.5. Preparacin de la solucin madre y diluciones de prueba de la SRef (Mtodo cilindro - placa)
Solucin madre Dilucin de prueba
Conc. final
Disolvente inicial, (y Conc.
Antibitico de la
concentracin inicial donde se Duracin en Diluyente central(c)
solucin
especifique) diluyente posterior refrigeracin final (unidades o
madre
si es diferente g/mL)
(mL)
Ampicilina (1) Agua 0.1 mg 7 das B.3 0.100g
Amfotericina B (1) (2) Dimetil sulfxido 1 mg Mismo da B. 10 1.0 g
Bacitracina de zinc (3) cido clorhdrico 0.01 N 100 U Mismo da B. 1 1.0 U
Bleomicina B. 16 2U 14 das B. 16 0.04 U
Carbenicilina B. 1 1 mg 14 das B. 1 20 g
Cefalotina B. 1 1 mg 5 das B. 1 1.0 g
Cefapirina B. 1 1 mg 3 das B. 1 1.0 g
Cloxacilina B.1 1 mg 7 das B .1 5.0 g
Colistimetato sdico (1) Agua (10 mg/mL); [B. 6] 1 mg Mismo da B. 6 1.0 g
Colistina Agua (10 mg/mL); [B. 6] 1 mg 14 das B. 6 1.0 g
Dihidroestreptomicina B. 3 1 mg 30 das B.3 1.0 g
Eritromicina Metanol (10 mg/mL); [B. 3] 1 mg 14 das B. 3 1.0 g
Gentamicina B. 3 1 mg 30 das B. 3 0.1 g
Nafcilina B. 1 1 mg 2 das B. 1 2.0 g
Natamicina Dimetil sulfxido 1 mg Mismo da B. 10 5.0 g
Notas: B denota solucin amortiguadora y el nmero que sigue se refiere a las soluciones amortiguadoras de fosfato de potasio definidas en este captulo.
(1) Para amfotericina B, colismetato sdico y nistatina, preparar las diluciones de la sustancia de referencia y de la muestra simultneamente.
(2) Para amfotericina B, diluir nuevamente la solucin madre con dimetil sulfxido para obtener concentraciones de 12.8, 16, 20, 25 y 31.2 g/mL antes de
realizar las diluciones de prueba. La Dilucin de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetil sulfxido que las diluciones de la
sustancia de referencia.
(3) Para bacitracina zinc, cada una de las diluciones de prueba deben contener la misma cantidad de cido clorhdrico que la Dilucin de prueba de la muestra.
(4) Para la valoracin turbidimtrica de neomicina, diluir la solucin madre de 100 g/mL en forma cuantitativa con Solucin amortiguadora N 3 para obtener
una solucin con una concentracin equivalente a 25.0 g /mL de neomicina. A matraces volumtricos de 50 mL separados, agregar 1.39, 1.67, 2.00, 2.40 y
2.88 mL de esta solucin, agregar 5.0 mL de cido clorhdrico 0.01 N a cada matraz, diluir a volumen con Solucin amortiguadora N 3 y mezclar para
obtener soluciones con concentraciones de 0.69, 0.83, 1.0, 1.2 y 1.44 g/ mL de neomicina. Utilizar estas soluciones para preparar la lnea de respuesta de
la sustancia de referencia.
(5) Para la nistatina, diluir nuevamente la solucin madre con dimetilformamida para obtener concentraciones de 256, 320, 400, 500 y 624 Unidades/mL antes
de realizar las diluciones de prueba. Preparar las soluciones de lnea de respuesta de la sustancia de referencia simultneamente con las diluciones de la
muestra que se desea analizar. La Dilucin de prueba de la muestra debe contener la misma cantidad de dimetilformamida que las diluciones de prueba de
la sustancia de referencia. Utilizar recipientes de vidrio con proteccin actnica.
(6) Para la Polimixina B, preparar la solucin madre aadiendo 2 mL de agua por cada 5 mg de la sustancia de referencia.
a = [ (12.6-12.82)2+(13.0-12.82)2+(12.8-12.82)2+(13.0-12.82)2+(12.8-12.82)2+(12.6-12.82)2+(12.0-12.82)2+(13.8-12.82)2+(12.8-12.82)2] / 9 = 0.47
CVa = (0.47/ 12.82) X 100 = 3.7 %.
Para el criterio de aptitud de variabilidad, cada laboratorio deben desecharse. [El lmite sugerido para el coeficiente de
debe determinar un valor mximo aceptable para el coeficiente variacin (CV) es, no ms de 10%].
de variacin. Si alguno de los ocho valores del coeficiente de
variacin (cuatro para la SRef (c) y cuatro de las otras
diluciones SRef a,b, d y e ) sobrepasan este mximo
predeterminado, los datos de la valoracin no son adecuados y
Muestra
Soluciones Placa 1 (mm) Placa 2 (mm) Placa 3 (mm) X CV
(cm) 14.4 14.6 14.9 14.9 14.3 14.7 14.8 14.2 14.0 14.53 0.32 2.23
m 14.8 14.4 14.3 14.2 14.8 14.1 14.8 14.5 14.1 14.44 0.30 2.05
X: Promedio : Desviacin estndar CV: Coeficiente de variacin
Paso 3. Considerando la concentracin terica de cada una de las diluciones determinar con ayuda de un software la ecuacin
de la recta y el porcentaje de coeficiente de determinacin (%R2); donde el eje de las abscisas corresponde a la zona de
inhibicin y el eje de las ordenadas al logaritmo de la concentracin de las diluciones del SRef (a,b,c,d,e).
Valoracin Microbiolgica Antibitico 17.0
16.0
Halo de inhibicin (mm)
15.0
14.0
y = 7.6695x + 14.446
13.0 R = 0.9935
12.0
Log Dosis (g/ mL)
11.0
-0.25 -0.2 -0.15 -0.1 -0.05 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25
2 7.6695 14.446
%R = 99.3 Pendiente (b) = Ordenada al origen (a)=
Ejemplo: La Tabla 0100.9. Resume la porcin de la Tabla Determinacin de potencia de la muestra: Para estimar la
0.100.8 requerida para esta parte del clculo. potencia de la muestra desconocida, promediar las mediciones
de la zona de la sustancia de referencia y las mediciones de la
Tabla 0100.9 Datos para calcular la ecuacin de la recta. zona de la muestra en las tres placas usadas. Corregir por
Zona de variacin entre placas, usando el punto de correccin
Curva tipo Concentracin
inhibicin determinado anteriormente para obtener un promedio
de la SRef (g / mL)
Corregida (mm) corregido para la muestra desconocida m.
a 12.93 0.64 Nota: un mtodo alternativo aceptable al uso del punto de
b 13.71 0.80 correccin consiste en corregir usando el valor en la lnea de
regresin estimada correspondiente al logaritmo de la
c 14.56 1.00
concentracin de c.
d 15.04 1.25 Usar la medicin de zona promedio corregida en la ecuacin
e 15.98 1.56 de la lnea de la curva tipo para determinar el logaritmo de la
concentracin de la muestra, log(m), mediante:
Resultados de la regresin lineal log(m) = (m a ) / b
Lnea de la curva tipo: log(m) =Logaritmo de la concentracin de la muestra.
m = Muestra desconocida.
y = [7.6695 x log (x)] + 14.446 a = Ordenada al origen (Interseccin de la lnea de
regresin).
y= Medicin de zona corregida b = Pendiente de la lnea de regresin.
x= Concentracin
%R2= 99.3
Tabla 0100.10. Preparacin de la solucin madre y diluciones de prueba de la SRef (Mtodo Turbidimtrico) b
Solucin madre Dilucin de prueba
Disolvente inicial, (y Conc. final Conc.
Antibitico concentracin inicial donde de la Duracin en Diluyente Central (c)
se especifique) diluyente solucin refrigeracin final (unidades o
posterior si es diferente madre g/mL) a
Amikacina Agua 1 mg 14 das Agua 10 g
Candicidina Dimetil sulfxido 1 mg Mismo da Agua 0.06 g
Capreomicina Agua 1 mg 7 das Agua 100 g
Cloranfenicol Alcohol (10 mg/mL); [Agua] 1 mg 30 das Agua 2.5 g
Clortetraciclina cido clorhdrico 0.01 N 1 mg 4 das Agua 0.06 g
Cicloserina Agua 1 mg 30 das Agua 50 g
Demeclociclina cido clorhdrico 0.1 N 1 mg 4 das Agua 0.1 g
Dihidroestreptomicina Agua 1 mg 30 das Agua 30 g
Doxiciclina cido clorhdrico 0.1 N 1 mg 5 das Agua 0.1 g
Estreptomicina Agua 1 mg 30 das Agua 30 g
Alcohol
Gramicidina Alcohol 95% 1 mg 30 das 0.04 g
95%
Kanamicina Agua 1 mg 30 das Agua 10 g
Metaciclina Agua 1 mg 7 das Agua 0.06 g
Neomicina d B. 3c 100 g 14 das B. 3c 1.0 g
Oxitetraciclina cido clorhdrico 0.1 N 1 mg 4 das Agua 0.24 g
Rolitetraciclina Agua 1 mg 1 da Agua 0.24 g
Tetraciclina cido clorhdrico 0.1 N 1 mg 1 da Agua 0.24 g
Tiostreptn Tioestreptona Dimetil
Dimetil sulfxido 1U Mismo da 0.80 U
o tioestreptomicina sulfxido
a
Microgramos (g) en esta columna se refiere a microgramos de actividad.
b
Se puede usar la valoracin en cilindro placa como un procedimiento alternativo.
c
La letra B se refiere a la solucin amortiguadora. Ver Medios y Soluciones, Soluciones amortiguadoras para una descripcin de cada solucin amortiguadora
listada en esta tabla.
d
Diluir la solucin madre de 100 g/mL con Solucin amortiguadora B.3 para obtener una solucin con una concentracin equivalente a 25 g/mL de
Neomicina. Agregar 1.39; 1.67; 2.00; 2.40 y 2.88mL de esta solucin a sendos matraces volumtricos de 50 mL. Agregar 5.0 mL de cido clorhdrico 0,01 N
a cada matraz, diluir con Solucin amortiguadora B.3 a volumen y mezclar para obtener soluciones con concentraciones de 0.69; 0.83; 1.0; 1.2 y 1.44 g/mL
de neomicina. Usar estas soluciones para preparar la curva tipo de la sustancia de referencia.
70.0
%Transmitancia (%T)
60.0
50.0
y = 43.682x - 149.06
40.0
R = 0.9962
30.0
20.0
Para el criterio de aptitud de variabilidad, se debe determinar sobre estos valores usando software apropiado o las
una desviacin estndar combinada mxima aceptable. Si la indicaciones del captulo de Estadstica para ensayos
desviacin estndar excede este mximo predeterminado, los biolgicos.
datos de valoracin no son adecuados y se deben descartar. Nota: Usar el logaritmo natural o el logaritmo en base 10 para
Nota: el lmite sugerido para desviacin estndar combinada graficar la curva tipo y determinar la ecuacin de regresin;
es no ms de 10% del valor de absorbancia promedio a travs ambos proporcionan el mismo resultado de prueba final. Se
de las cinco concentraciones. Si el nmero de determinaciones debe determinar un valor mnimo del coeficiente porcentual de
repetidas por concentracin es al menos cinco, entonces se determinacin (%R2) para una regresin aceptable. La
puede calcular el coeficiente de variacin para cada regresin es aceptable nicamente si el valor %R2 obtenido
concentracin despus de verificar valores atpicos y comparar excede este valor predeterminado.
con un coeficiente de variacin mximo aceptable. Nota: El lmite sugerido para el coeficiente porcentual de
Nota: El lmite sugerido para el coeficiente de variacin es no determinacin es no menos de 90%.
ms de 10%. Ejemplo: La tabla 0100.13 resume la porcin de la tabla
Paso 2: Determinar la lnea de la curva tipo. 0100.12 requerida para esta parte del clculo.
Generar la lnea de la curva tipo, graficando los valores de Tabla 0100.13 Valores para obtener la lnea de la recta.
absorbancia promedio en funcin del logaritmo de los valores
de concentracin de la SRef. Calcular la ecuacin de la lnea
de la curva tipo, realizando una regresin lineal no ponderada