DETERMINACION DE PROTEINAS

El contenido total de protenas en los alimentos est conformado por una mezcla
compleja de protenas. Estas existen en una combinacin con carbohidratos o
lpidos, que puede ser fsica o qumica. Actualmente todos los mtodos para
determinar el contenido protico total de los alimentos son de naturaleza emprica.
Un mtodo absoluto es el aislamiento y pesado directo de la protena pero dicho
mtodo se utiliza slo a veces en investigaciones bioqumicas debido a que es
dificultoso y poco prctico

En 1883 el investigador dans Johann Kjeldahl desarroll el mtodo ms usado en

la actualidad para el anlisis de protenas (mtodo Kjeldahl) mediante la
determinacin del nitrgeno orgnico. En esta tcnica se digieren las protenas y
otros componentes orgnicos de los alimentos en una mezcla con cido sulfrico
en presencia de catalizadores. El nitrgeno orgnico total se convierte mediante
esta digestin en sulfato de amonio. La mezcla digerida se neutraliza con una
base y se destila posteriormente. El destilado se recoge en una solucin de cido
brico. Los aniones del borato as formado se titulan con HCl (o
H2SO4) estandarizado para determinar el nitrgeno contenido en la muestra.
El resultado del anlisis es una buena aproximacin del contenido de protena
cruda del alimento ya que el nitrgeno tambin proviene de componentes no
proteicos.

El mtodo Kjeldahl ha sufrido varias modificaciones. Originalmente se utiliz

permanganato de potasio para llevar a cabo el proceso de oxidacin (digestin),
sin embargo, los resultados no fueron satisfactorios, de manera que este reactivo
se descart. En 1885 Wilforth encontr que se poda acelerar la digestin
utilizando cido sulfrico y aadiendo un catalizador. Gunning en 1889 propuso
aadir sulfato de potasio que eleva el punto de ebullicin del cido sulfrico
utilizado en la digestin para disminuir el tiempo de la reaccin.
En la actualidad se utiliza principalmente Sulfato de Cobre penta hidratrado
CuSO4.5H2O como catalizador.
REACCIONES LLEVADAS A CABO EN EL MTODO DE KJELDAHL

DIGESTIN

catalizadores

(1) n - C -NH2 + mH2SO4 CO2 + (NH4)2 SO4 + SO2

protena calor

NEUTRALIZACIN Y DESTILACIN

(2) (NH2)SO4 + 2 NaOH 2NH3 + Na2SO4+ 2H2O

(3) NH3 + H3BO3 (cido brico) NH4 + H2BO3- (in borato)

TITULACIN

El anin borato (proporcional a la cantidad de nitrgeno) es titulado con HCl (o

H2SO4) estandarizado:
(4) H2BO3- + H+
H3BO3
MATERIAL
J.P SELECTA suministra los equipos necesarios para la realizacin del
procedimiento por el mtodo Kjeldahl.
-1 bureta electrnica Digitrate -Pro 50 resolucin 0.01 ml.
Cdigo 0182026

-1 balanza analtica de precisin FA-

2204B resolucin 0,1mg.
Cdigo 5830039

-1 Unidad de digestin (Bloc Digest) para 6, 12 y

20 plazas.
Cdigos 4000629, 4000630, 4000631
-1 Unidad Scrubber.
Cdigo 4001611
-1 Bomba de circulacin de agua.
Cdigo 4001612

-1 Aparato destilador Kjeldahl (Pro Nitro M, S o

A).
Cdigos 4002627, 4002851, 4002430

- Material diverso de laboratorio

REACTIVOS

Reactivos preparados:
Es aconsejable la utilizacin de
reactivos ya preparados,
especialmente el HCl (o H2SO4)
de valoracin. Cualquier error en
su preparacin puede afectar
directamente al resultado de la determinacin.

Utilizar los siguientes, o sus equivalentes en otras marcas:

cido Brico (en polvo) 99.5% PANREAC 141015

Indicador mixto 4.8 ( 5) RV PANREAC 283303
(Rojo metilo + Verde de Bromocresol)

Indicador mixto 4.4 RV PANREAC 282430

(Rojo metilo + Azul de Metileno)

HCl 0.1N SV PANREAC 171023

HCl 0.25N SV PANREAC 182318
H2SO4 0.1N SV PANREAC 181061
 H2SO4 0.2N SV PANREAC 182011
Sodio Hidrxido 40% RE PANREAC 171220
(Para determinacin de N)

Acetanilida 99% (Patrn para validacin) PANREAC 151005

Amonio sulfato (Patrn para validacin) PANREAC 131140
Catalizador Kjeldahl 6.25% Cu tabl. 8g PANREAC 174428

Preparacin de la solucin fijadora de amonaco

1.- Con indicador Mixto 4.8 ( 5)

Preparar la solucin de la siguiente frmula para 1 litro de solucin fijadora:

Pesar 10g de Acido Brico (en polvo) PANREAC 141015

Disolverlo en 1 litro de agua destilada.
Aadir 15ml de Indicador mixto 5. PANREAC 283303

2.- Con indicador mixto 4.4

Preparar la solucin de la siguiente frmula para 1 litro de solucin fijadora:

Pesar 10g de cido Brico (en polvo) PANREAC 141015

Disolverlo en 1 litro de agua destilada.
Aadir 10ml de Indicador mixto 4.4. PANREAC 282430

PROCEDIMIENTO

REPARACIN DE LA MUESTRA
1. Triturar, homogeneizar y mezclar la muestra.
2. Pesar entre 1 y 2 gramos de muestra.
3. En muestras con contenidos de nitrgeno muy pequeo, tomar la
muestra suficiente para que contenga como mnimo 5 mg de nitrgeno.
DIGESTIN
Aadir entre 10 y 15 ml (tubo macro) de H2SO4 96-98% y 1 tableta (8 gm) de
catalizador.
(Para el tubo micro, el mximo de H2SO4 es 5ml)
Montar un sistema para la extraccin de humos o scrubber con Na2CO3.
Realizar la digestin en tres pasos:

1. En funcin del contenido de agua de la muestra, empezar la

digestin evaporando agua a 150C entre 15 y 30 minutos.
2. Realizar un segundo paso entre 270 y 300C entre 15 o 30 minutos
para reducir la produccin de humos blancos.
3. Continuar la digestin a 400C entre 60 y 90 minutos.
Algunos ejemplos:

Queso o carne:
Paso1: 150C / 30 Paso 2: 270C / 30 Paso 3: 400C / 90
Cereales:
Paso1: 150C / 15 Paso 2: 300C / 15 Paso 3: 400C / 60

Control Visual: El resultado es un lquido transparente ntido con coloracin azul

claro, verde o amarillo dependiendo del catalizador utilizado. No deben quedar
restos negros adheridos a la pared de tubo.
Nota: Durante la digestin debe controlarse la produccin de espuma en las
muestras. Si esta es excesiva, debe alargarse el paso n 1.

DILUCIN

Sacar los tubos muestra del bloque digestor y dejar enfriar a T ambiente.
(Puede forzarse sumergiendo los tubos, cautelosamente, en un poco de agua).
Aadir unos 25ml de agua destilada en cada tubo.
Aadir el agua despacio y moviendo el tubo sin dejar solidificar la muestra. Si es
necesario calentar ligeramente el tubo (por ej. introducindolo en el bloque
digestor todava caliente)
 Dejar enfriar de nuevo hasta T ambiente.
Para evitar prdidas de nitrgeno y reacciones violentas no introducir el tubo
todava caliente al destilador.

DESTILACIN

Situar un Erlenmeyer de 250ml a la salida del refrigerante con 50ml de cido

Brico y unas gotas de indicador.
Programar una dosificacin de 50 a 75 ml de NaOH.
Introducir el tubo con la muestra en el destilador.
Destilar hasta recoger 250ml en el Erlenmeyer (50ml Brico + 200ml de
destilado).

Control Visual: Una vez se ha aadido el NaOH, la muestra debe tomar una
coloracin azulada, de no ser as, aadir ms NaOH.

VALORACIN Y CLCULO

Valorar el destilado con HCl H2SO4 hasta el cambio de color. (punto final: pH
4.65)
Moles de HCl = Moles de NH 3 = Moles de N en la muestra
Moles de H2SO4= 2Moles de NH 3 = 2Moles de N en la muestra
Realizar el clculo:
mg N = N x V x 14
Donde:
N = Normalidad del cido de valoracin
V = Volumen de cido consumido
14 = Peso atmico del nitrgeno.
Para pasar a contenido de protenas corregir por el factor adecuado segn la
naturaleza de la muestra. (6.25 por defecto)
Peridicamente realizar un ensayo en blanco y restarlo del resultado.

% Protenas = P2/P0 x 100 x F

Donde:
P2: Nitrgeno (mg).
P0: Peso de la muestra (mg).
F: Factor protenico.
(6.25 por defecto)

Factor proteico de algunos alimentos

Almendras 5.18
Nueces 5.30
Nueces - cacahuetes 5.41
Gelatina 5.55
Soja 5.71
Cebada, avena, centeno 5.83
Trigo, harina entera 5.83
Harinas (no entera) 5.70
Arroz 5.95
Maz 6.25
Todos los otros alimentos 6.25
Salvado 6.31
Leche y lcteos 6.38

VERIFICACIN DE LA RECUPERACIN CON AMONIO SULFATO

Esta verificacin es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del

destilador.

Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrgeno es conocido. Esta

se destila, se valora con HCl 0.25N y se calcula el Nitrgeno detectado.

El porcentaje de nitrgeno detectado sobre el de la muestra se

denomina recuperacin de Nitrgeno.
Preparar la muestra:
Contenido de nitrgeno de una muestra de Amonio sulfato:
Formula: (NH4)2 SO4
Peso molecular: 132.14
Factor: 14 * 2 / 132.14 = 0.212
mg de Nitrgeno = 0.212 * mg de Amonio sulfato
 Pesar unos 100mg de amonio sulfato. El peso exacto ser P0
La cantidad exacta de Nitrgeno es:

P1 (mg) = P0 x 0,212
Destilar aadiendo 25ml de NaOH
Una vez destilado y valorado obtenemos el nitrgeno (mg) detectado: P2

P2 = N x V x 14
Donde:
N = Normalidad del cido de valoracin (HCl 0.25)
V = Volumen de cido consumido
14 = Peso atmico del nitrgeno.
Calculamos la recuperacin:

R(%) = P2 / P1 *100
La recuperacin aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.

Si se utiliza HCl de normalidad diferente preparar muestras:

NormalidadMuestra de Amonio sulfato.

0,05 20 ... 40 mg

0,1 40 ... 90 mg

0,25 100 200 mg

0,5 200 400 mg

VERIFICACIN DE LA RECUPERACION CON ACETANILIDA

Esta verificacin es ampliamente utilizada para certificar el funcionamiento del
proceso completo del anlisis del nitrgeno Kjeldahl que incluye las etapas de
digestin, destilacin y valoracin.
Se trata de preparar una muestra cuyo contenido de nitrgeno es conocido. Esta
se digiere, se destila, se valora y se calcula el Nitrgeno detectado.

El porcentaje de nitrgeno detectado sobre el de la muestra se denomina

recuperacin de Nitrgeno.

Para realizar sta verificacin se utiliza la Acetanilida.

Preparar la muestra:
Contenido de nitrgeno de una muestra de Acetanilida :

Frmula: C8H9NO
Peso molecular: 135.17
Factor: 14 / 135.17 = 0.1035
mg de Nitrgeno = 0.1035 * mg de Acetanilida
Pesar alrededor de 250mg de acetanilida. El peso exacto ser P0
La cantidad exacta de Nitrgeno es:

P1 (mg) = P0 x 0,1035

Digestin de la muestra:
Colocar la acetanilida en un tubo, aadir 10ml de cido sulfrico 98% y una
tableta de catalizador Kjeldahl.
Digerir a 400C durante 1h. (El resultado debe ser un lquido transparente con
coloracin azul.)
Dejar enfriar y aadir 25ml de agua destilada en cada tubo. Tomar precauciones
para evitar salpicaduras. La reaccin del agua sobre el cido sulfrico es
violenta.

Destilar:
 Destilar aadiendo 75ml de NaOH. Utilizar HCI 0.25N para la valoracin.
Una vez destilado y valorado, obtenemos el nitrgeno (mg) detectado: P2

Donde:
N = Normalidad del cido de valoracin (HCl 0.25).
V = Volumen de cido consumido.
14 = Peso atmico del nitrgeno.
P2 = N x V x 14
Calculamos la recuperacin:

R(%) = P2 / P1 *100

La recuperacin aceptable es entre 99.5 y 100.5 %.

FUENTES DE ERROR
Las principales fuentes de error son:

En el proceso de digestin:
1.- La inclusin de nitrgeno no protico (aunque la cantidad de este nitrgeno
suele ser despreciable comparada con la del nitrgeno protico);
2.- La prdida de nitrgeno durante la digestin. El exceso de sulfato de sodio o
potasio que se aade al cido para elevar el punto de ebullicin, puede producir
una descomposicin por calor y por lo tanto prdida de nitrgeno. Por otro lado, el
exceso de catalizador (de cobre generalmente) tambin puede producir prdidas
de nitrgeno
3.- La digestin incompleta de la muestra. Generalmente debida a falta de tiempo
de reaccin o falta de cido sulfrico.
Durante la destilacin:
1.- Neutralizacin incompleta de la mezcla digerida. Es necesario aadir suficiente
NaOH para neutralizar el exceso de cido sulfrico resultante de la digestin as
como transformar todo el amonio formado en la digestin en amonaco.
2.- Perdida de amonaco por fugas en el circuito de destilacin.
3.- Perdida de amoniaco por refrigeracin insuficiente en el condensador.