Pdagogie lyce et post bac

Coloration des mycorhizes

Alix Helme-Guizon et Marc-Andr Selosse

Quand on traite de la nutrition des vgtaux, on enseigne aux lves quelle

se fait dans 90 % des cas par des mycorhizes, mais en TP on leur montre
des poils absorbants ! Au mieux, on montre une photo dectomycorhize, mais
ce type dassociation ne concerne que les arbres des forts tempres (5 %
de la flore), alors que prs de 80 % des vgtaux possdent des endomyco-
rhizes arbuscules. Comme aucune lame nest disponible dans le commer-
ce, mais que les racines endomycorhizes sont extrmement communes (nos
cours le prtendent en tout cas !), nous vous proposons de les faire vous-
mmes. Il est aussi possible de rcuprer des spores de champignons endo-
mycorhiziens dans le sol, et bien sr de colorer des ectomycorhizes.
Quelle que soit la mycorhize ou la partie vgtale souterraine observe, sou-
venez-vous que latmosphre est plus desschante que le sol : placez aussi
vite que possible les structures racinaires dans de leau, aprs extraction du
sol ou pour observation la loupe binoculaire. Rappelez-vous que le sol est
aussi un milieu assez stable : les organes souterrains les plus fragiles se dis-
loquent facilement lorsquon les manipule, ils sont moins rsistants que les
parties ariennes.

Coloration des endomycorhizes

Principe de la mthode
Il sagit de dcolorer toutes les cellules en conservant leurs parois, puis de colo-
rer les parois des cellules du champignon grce un colorant de la callose, un glu-
cane majeur de celles-ci. Les champignons concerns sont des Eumyctes du grou-
pe des Glomromyctes ou Glomales.

Matriel
une plante quelconque, except une Brassicace ou une Chnopodiace
(groupes non-symbiotiques, avec des poils absorbants seulement). Avec une
Fabace, on observera aussi des nodosits. Nous avons aussi eu de bons rsultats
avec du Pturin, et dexcellents avec du Plantain et une racine drageonnante (super-
ficielle) de Merisier. Eviter surtout les sols trs riches, o les plantes se nourrissent

! Mots cls : ectomycorhize, endomycorhize, rhizogense

! Alix Helme-Guizon, professeure en BCPST-Vto Angers
Marc-Andr Selosse, professeur, lUniversit Montpellier II

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seules, sans plus tablir de mycorhizes. Garder les racines les plus fines qui sont les
plus mycorhizes : pour cela, viter de tirer les racines ou darracher les plantes du
sol, il vaut mieux extraire une motte puis dgager les racines sous leau ;
si vous souhaitez conserver les lames, faites le montage dans du lactoglycrol
qui limite lvaporation : 1 volume dacide lactique 100% + 1 volume glycrol (ou
glycrine) + 1 volume deau ;
du bleu coton : bleu de mthyle (Color Index 42780) 1 % et acide actique 3 % ;
de la potasse KOH 10 % ;

des tubes essai dans un portoir allant dans un bain marie 90 C. Mettez un
thermomtre dans le bain-marie, car quand les rsistances sont entartres elles ne
montent qu 80 C !
un tamis ou micropline pour rcupration et rinage ;

de leau acidifie : eau distille + un peu dacide chlorhydrique trs dilu.

Protocole
1. Laver prcautionneusement les racines et prendre les plus jeunes, les couper
une longueur de 1-2 cm
2. Les mettre dans un tube essai avec la potasse 10 %, et chauffer au bain-marie
90 C durant 30 min (on peut optimiser ce temps, parfois 10-15 min suffisent si lon
est press et/ou si les racines sont fragiles). Cette opration dtruit le contenu des
cellules vgtales et dcolore les tanins des racines ligneuses. La solution devient
alors brun-rouge.
3. Jeter la potasse et filtrer dans un tamis, rincer avec leau acidifie pour neutraliser.
4. Remettre dans le bleu coton au bain marie 10 15 minutes. Filtrer nouveau
dans un tamis et rincer leau distille.
5. Pour une observation directe, monter dans leau. Si on souhaite observer plus
tard ou conserver les lames, monter dans le lactoglycrol. Si cest trop pais, cra-
ser doucement avec le dos dun crayon papier en bois, voire donner un coup sec
avec une gomme carre (pour ne pas casser la lamelle). Si on souhaite conserver la
prparation plusieurs annes, mettre une pince linge sur la lamelle et du vernis
ongles transparent tout autour de la lamelle (le lactoglycrol est un peu miscible
avec le vernis). Le lendemain dplacer la pince linge et remettre une couche de
vernis. Lun de nous a conserv des lames 15 ans avec cette technique !

Rsultat
Le bleu coton marque le champignon mycorhizien, prsent dans tout le parenchy-
me cortical, sans jamais entrer dans le cylindre central. On distingue (fig. 1) des arbus-
cules lintrieur de certaines cellules racinaires (structure dchange entre partenaires)

2 Biologie Gologie n 4-2010

et des vsicules entre les cellules (souvent, une goutte lipidique dedans : cest une struc-
ture de rserve pour le champignon). On voit parfois aussi des hyphes externes, qui ne
sont jamais cloisonns. Il sagit donc dune endomycorhize arbuscules.
Si les arbuscules paraissent nuageux ( la limite, une vague couleur bleue dans
la cellule), cest quils sont trop lyss : diminuer le temps de dcoloration. Une colo-
ration directe peut tre essaye sur les racines trs claires.

1. Rsultat standard de la coloration dendomycorhizes

a) vue densemble ; b) dtail avec arbuscules et vsicule ; c) trs bonne vue de dtail dun
arbuscule dans une cellule vgtale, la barre mesurant 50 m (clich c : J. Dexheimer)

Observation de spores de Glomromyctes

Principe de la mthode
Les spores sont, avec les hyphes externes des racines, les structures qui vont per-
mettre linfection des nouvelles racines. Ces spores sont trs grosses (une centaine
de microns), car bourres de rserves qui assureront une germination et une coloni-
sation prcoce de la racine en autonomie trophique. Elles peuvent donc tre rcup-
res par tamisage, puis observes la loupe binoculaire.

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 Matriel
du sol non trait : ni engrais (voir plus haut), ni pesticides

des tamis fins maille de 250, 150, et 50 m.

des botes de Ptri pour rcuprer les fractions dintrt.

Protocole
Suspendre 0,25 l environ de sol (dont on a auparavant limin les gros blocs et
morceaux visibles) dans 0,75 l deau. Homogniser puis laisser brivement dcan-
ter et tamiser le surnageant sur trois tamis de 250, 150, et 50 m (placs les uns au-
dessus des autres, le plus fin en bas !). Laver leau distille chaque tamis puis
recueillir chaque fraction laide dun peu deau (rincer le tamis lenvers) dans
une bote de Ptri et lobserver sans coloration, la binoculaire. On peut aussi lob-
server au microscope optique, sans coloration (attention, vue la taille des spores, ne
pas craser la lame pour ne pas les dtruire !).

Rsultat
On observe, entre des dbris de mme taille, de grosses spores (fig. 2). Elles sont
rondes et bourres de rserves (si on crase, une goutte lipidique sort), avec parfois
dun ct un filament ou une hernie : cest le reste de lhyphe qui a gnr la spore
son extrmit.

2. Spores de Glomromyctes
a) vue densemble, la barre mesurant 200 m, b) vue de dtail avec hyphe gnratrice flche,
la barre mesurant 50 m (clichs P.-E. Courty)

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Coloration des ectomycorhizes
Bien quelles ne concernent que les arbres des rgions tempres (et de quelques
forts tropicales), les ectomycorhizes formes par des Ascomyctes et, le plus sou-
vent, des Basidiomyctes, peuvent tre montres car elles sont faciles observer
lil nu ou faible grossissement. Pour cela, prlever en saison de vgtation de
prfrence, et en sol pas trop riche, des petits chnes, sans tirer la racine (avec la
motte), qui ont eu le temps de dvelopper de belles racines dans un sol meuble.
On peut aussi chercher dans lhumus pais sous des Pins ou des Htres : l, dans
les accumulations de matire organique, les mycorhizes se dissocient bien du sol.
Elles sont souvent places latralement sur une racine traante, croissance conti-
nue, et sont rendues visibles par leur couleur diffrente (celle du champignon) et/ou
leur aspect cotonneux (hyphes du champignon ; figure 3a). Souvent, leur forme est
modifie : elles sont trs ramifies (fig. 3b), voire dichotomiques sur le Pin (fig. 3c) ;
il faut y voir leffet danalogues dauxines produits par le champignon qui, en sti-
mulant la rhizogense, dmultiplie les sites dinteraction avec son hte.
Lanalyse peut se faire lil nu sur le terrain mais le mieux est de ramener les
chantillons et de les regarder sous la loupe binoculaire, dans une coupelle deau
pour viter le schage. La morphologie est la plus parlante et trs variable dune
espce de champignon lautre (fig. 3). On peut, sous la loupe, rcuprer des myco-
rhizes et tenter des coupes : effectuer des coupes transversales, compltes ou non
(les coupes incompltes montrent des biseaux dont la marge, trs fine, rvle la
structure cellulaire). On voit au moins le manteau dhyphes fongiques autour de la
racine. Mais avouons-le : sans coupe fine ni fort grossissement, il est difficile de
voir le rseau de Hartig, cest--dire les hyphes pntrant entre les cellules raci-
naires corticales, et dont le rle dchange est analogue celui des arbuscules.

3. Ectomycorhizes de Chne sur le terrain (a, b) et de Pin sous la binoculaire (c)

c) : noter la ramification dichotomique des racines latrales mycorhizes, blanches.
La barre mesure 1 cm pour a et b et 5 mm pour c. c : clich L. Peterson

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 On peut aussi craser ou dilacrer une ectomycorhize afin de voir les hyphes.
Pour lcraser sans casser la lamelle : nen mettez pas trop, crasez en tapotant avec
le dos dun crayon papier en bois. Il est possible aussi de colorer des ectomyco-
rhizes, mais ce nest souvent pas ncessaire pour les plus frappantes. Couper les
petites racines, ou reprendre les coupes, et les placer sur une lame. Colorer avec du
rouge Ponceau 0,1 % dans de lacide actique 10 %. Si vous navez pas de rou-
ge Ponceau, le bleu de toluidine (0,1 % dans du tampon actate pH = 4,6) donne des
rsultats convenables mais moins spcifiques. Comme prcdemment, monter dans
leau pour une observation immdiate, ou dans du lactoglycrol pour une conserva-
tion longue.

Conclusion
Ces observations donnent accs aux champignons mycorhiziens, une fraction
importante de la biodiversit microbienne du sol. Elles permettent dillustrer la dfi-
nition dune mycorhize, un organe mixte form par la racine dune plante et un
champignon du sol . Elles mettent en vidence un aspect fonctionnel majeur,
lexistence dun contact troit, formant une surface dchange entre les partenaires,
pour lesquels cet organe mixte a un rle trophique.

Rfrence des protocoles

Le protocole de coloration des endomycorhizes a t dvelopp par C. Grace et
D. P. Stribley (1991 : A safer procedure for routine staining of vesicular-arbuscular
mycorrhizal fungi, Mycological Research 95, 1160-1162).
Le protocole de coloration des ectomycorhizes a t dvelopp par A.
Daughtridge, S. Boese, S. Pallardy et H. Garrett (1986 : A rapid staining technique
for assessment of ectomycorhizal infection of oak roots, Canadian Journal of
Botany 64, 1101-1103).
Des perfectionnements ponctuels ont t apports par les auteurs ; merci de son assis-
tance technique Nadia PICHERY et P.-E. COURTY pour ses images non publies.

Documentation sur les mycorhizes

DUHOUX E. & NICOLE M. - Atlas de biologie vgtale, associations et interactions
chez les plantes, Dunod, 2004
FORTIN A., PLANCHETTE C. & PICHE Y - Les Mycorhizes, la nouvelle rvolution ver-
te, Editions Quae, 2008
SELOSSE M.-A. - La symbiose : structures et fonctions, rle cologique et volutif,
Vuibert, 2000
Articles au format pdf en ligne www.cefe.cnrs.fr/coev/MA_Selosse.htm
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