Licenciatura en Medicina Veterinaria y Zootecnia.

Mdulo: Enfermedades sistmicas y toxicolgicas

Docente: Silvia D. Pea B.

PROTOCOLO DE INVESTIGACIN

Deteccin de Aflatoxinas en diferentes alimentos balanceados para caninos.

Alumnas: Puebla Renteria Elena

Villeda Enrquez Sandra

16/05/17
INTRODUCCIN
Las micotoxinas son microorganismos abiticos de origen fngico que pueden
crecer en una gran variedad de cultivos, por ende su prevalencia en materias
primas vegetales (alimentos o piensos) puede ser relativamente alta. Las
micotoxinas son producidas por una gran variedad de mohos filamentosos
especialmente de los gneros Aspergillus, Penicillium, Fusarium, y Alternaria, fruto
de su metabolismo secundario (Marn et.al, 2013).
Las aflatoxinas son metabolitos txicos secundarios procedentes de Aspergillus
flavus. En los ltimos aos la necesidad de investigar estas toxinas ha
incrementado debido a la incidencia de stas en los alimentos (Martinez, 2013).
Entre los alimentos considerados ms susceptibles a la contaminacin por hongos
y por ende con aflatoxinas, se incluyen principalmente: maz, cacahuates,
pistachos, semillas de algodn y la pulpa seca del coco (copra). De igual manera
se han encontrado aflatoxinas en semillas oleaginosas tales como la semilla de
girasol y la soya, as como en almendras, avellanas y nueces (Martinez, 2013).

MARCO TERICO
Aflatoxinas: son micotoxinas cancergenas, teratognicas, mutagnicas, que
tienen tropismo por rganos como hgado, cerebro y rin. Estas toxinas son
producidas bajo condiciones ptimas de temperatura y humedad por A. flavus
(Serrano, 2015).
Las aflatoxinas de mayor inters son las B1, B2, G1 y G2 (toman el nombre con
base en la fluorescencia que presentan en capa fina de gel). Los micelios de A.
Flavus y otras especies afines productoras de aflatoxinas, son capaces de
colonizar semillas de oleaginosas de man, girasol, algodn, soja, ssamo,
avellanas, almendras y cereales y sus derivados almacenados en sacos o silos
(Martinez, 2013).
De las cuatro aflatoxinas principales (B1, B2, G1 y G2), la que se observa
habitualmente en mayores concentraciones es la B1, es considerada el compuesto
biolgicamente ms activo de la familia de las aflatoxinas y se presenta en un
nmero importante en alimentos para animales as como tambin en maz,
algodn y man (Rojas, 2009).
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

La alimentacin de los perros se basa principalmente en alimentos balanceados

de diferentes marcas precios y calidad, sin embargo se sabe que la composicin
de dichos alimentos son a base de cereales como maz, arroz, los cuales tienen
un riesgo de contener aflatoxinas que son dainas para el animal.
Algunos estudios han mostrado que los nutrientes y el tipo de sustrato son
importantes para la produccin de aflatoxinas, la cual se puede ver estimulada por
un alto nivel de carbohidratos y un bajo nivel de protenas; los carbohidratos
proveen los dos carbonos precursores para la sntesis de la toxina (Rojas &
Wilches, 2009)
Por otro lado, ciertos autores sugieren que las concentraciones de CO2 e
interacciones ligeramente elevadas con la temperatura e incluso factores como la
disponibilidad del agua pueden estimular el crecimiento de algunas especies
micotoxignicas, entre ellas las aflatoxinas (Magan et. al, 2011).
Lo anterior refiere un riesgo para la salud animal puesto que se puede propiciar la
existencia de aflatoxinas debido a las caracteristicas tanto fisicas, quimicas y
ambientales as como el almacenamiento, empaquetado del alimento, etc. Es por
eso, que es importante conocer el tipo de alimento que consumen los perros y
poder realizar un anlisis de riesgo donde se tomen en cuenta los aspectos ms
importantes en cuanto a la deteccin de aflatoxinas.
HIPTESIS
Se espera encontrar aflatoxinas en los alimentos balanceados para perros, sin
embargo, esto no ser la causa de los signos clnicos que se presenten en estos
animales.

OBJETIVO GENERAL
Determinar la presencia de aflatoxinas en diferentes alimentos balanceados para
perros.

OBJETIVOS ESPECFICOS

Conocer el tipo y composicin de cereales de los alimentos balanceados

para perros.

Comparar e identificar posibles signos clnicos de aflatoxicosis, con los

casos clnicos que se presenten en los perros en el sitio de trabajo.
METODOLOGA
El sitio de trabajo ser K9 Empresa de Seguridad Canina e Intramuros ubicada
en Circonio #60 Col. El Manto. Delegacin Iztapalapa. Mxico D.F
El muestreo se realizar de acuerdo a las tcnicas de toma y remisin de
muestras descritas en clase de diferentes autores.
Mtodo cientfico: Cromatografa de capa fina

EXTRACCIN

1. Pesar 50 g de muestra molida en un vaso de licuadora de vidrio de 250 mL o en

un Erlenmeyer de 250 mL con tapa rosca.
2. Aadir 100 mL de acetonitrilo-agua, 84+16.
3. Homogeneizar a alta velocidad durante 2 minutos (licuadora) o agitar
vigorosamente durante una hora usando un agitador mecnico.
4. Filtrar a travs de papel cualitativo rpido y transferir cerca de 5 mL del extracto
a un tubo de ensayo de 15 x 85 mm.

PURIFICACIN

5. Insertar el extremo con el tapn de caucho en el tubo de ensayo y presionar

hasta obtener 2.0 mL de solucin purificada al interior del cartucho
6. Transferir exactamente 2.0 mL del extracto purificado a un tubo de ensayo
limpio y evaporar a sequedad bajo nitrgeno o bajo vaco en un bao termostatado
a 60C.
CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA

7. Disolver el residuo seco con 100 L de tolueno-acetonitrilo, 95+5 (agregar el

solvente, tapar el tubo y agitar en vrtex durante 30 segundos).
8. Sembrar 20 L de cada muestra junto con 5, 10 y 20 L de estndar de trabajo
en una cromato-placa de silicagel 60 de 10 x 10 cm.. La solucin estndar de
trabajo contiene 0.4 g/mL de aflatoxina B1 (AFB1), 0.4 g/mL de aflatoxina G1
(AFG1), 0.12 g/mL de aflatoxina B2 (AFB2) y 0.12 g/mL de aflatoxina G2
(AFG2) en tolueno-acetonitrilo 95+5 (disponible en Micotox Ltda.).
9. Desarrollar la placa con cloroformo-acetona, 90+10 hasta 1 cm del borde
superior. Dejar secar al aire.
10. Observar la cromatoplaca bajo luz ultravioleta de onda larga (365 nm) y
determinar el contenido de aflatoxinas de la muestra comparando la intensidad de
las manchas de aflatoxinas de la muestra con las de los estndares. Las
aflatoxinas B1 y B2 fluorescen azul, las G1 y G2, fluorescen verde.

CONFIRMACIN

Confirmar la presencia de las aflatoxinas asperjando la cromatoplaca con una

solucin de metanol-cido actico-cido sulfrico, 80+10+10. Observar bajo luz
ultravioleta de onda larga (365 nm). La fluorescencia de las aflatoxinas cambia a
color amarillo.

CLCULOS

Se toman 50 g de muestra en 100 mL de solvente; del extracto se toman 2 mL que

se llevan a sequedad y se redisuelven en 100 L, de los cuales se siembran 20 L
en placa.
Equivalente en peso de la muestra sembrada:
50 g x 2/100 ml x 0.02/0.1 ml = 0.2 g en placa.

(Micotox LTDA)
Referencias

Martnez MM, Vargas del Ro LM, Gmez VM. Aflatoxinas: incidencia, impactos en
la salud, control y
prevencin. Biosalud. 2013;12(2): 89-109.

Micotox LTDA. DETERMINACION DE AFLATOXINAS EN CEREALES Y

ALIMENTO TERMINADO POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA (TLC) Norma
ICONTEC NTC 1232.

Rojas Contreras OL, Wilches Flrez AM. Determinacin de aflatoxinas en

alimentos de mayor consumo infantil comercializados en la ciudad de Pamplona,
Norte de Santander. Bistua: Revista de la Facultad de Ciencias Bsicas 2009.

Serrano-Coll HA, Cardona-Castro N. Micotoxicosis y micotoxinas: generalidades y

aspectos bsicos.
Rev CES Med 2015;29(1):143-152

S. Marin, A.J. Ramos, G. Cano-Sancho, V. Sanchis. Mycotoxins: Occurrence,

toxicology, and exposure assessment. Elsevier: Food and Chemical Toxicology 60
(2013) 218237.

N. Magan, A. Medina y D. Aldred, Posible climate change effectson mycotoxin

contamination of food crops pre and post- harvest. Plant Pathology (2011) 60. 150-
163.