PENGARUH PEMBERIAN CATECHINS TERHADAP RASIO EKSPRESI

BCL-2/BAX SERTA NEUROLOGICAL SEVERITY SCORE TIKUS JANTAN

RATTUS NORVEGICUS GALUR WISTAR MODEL CEDERA OTAK
TRAUMATIK FOKAL

TESIS

Untuk Memenuhi Persyaratan Memperoleh Gelar Magister

Oleh:
dr. Annisa Nurul Arofah
126070100111054

PROGRAM STUDI ILMU BIOMEDIK PEMINATAN IMUNOLOGI

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER SPESIALIS
ILMU PENYAKIT SARAF

PROGRAM PASCASARJANA FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2017
HALAMAN PERSETUJUAN

2
PERNYATAAN ORISINALITAS TESIS

3
 IDENTITAS TIM PENGUJI

JUDUL TESIS :

Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax serta

Neurological Severity Score Tikus Jantan Rattus norvegicus Galur Wistar Model

Cedera Otak Traumatik Fokal

Nama Mahasiswa : dr. Annisa Nurul Arofah

NIM : 126070100111054

Program Studi : Ilmu Biomedik

Minat : Imunologi

KOMISI PEMBIMBING :

Ketua : Dr. dr. Retty Ratnawati, MSc

Anggota 1 : Dr. dr. Masruroh Rahayu, M.Kes.

TIM DOSEN PENGUJI :

Dosen Penguji 1 : Dr. dr. Karyono Mintaroem, Sp.PA

Dosen Penguji 2 : Dr. Husnul Khotimah, S.Si., M.Kes.

TIM MONEV : Edwin Widodo, S.Si., MSc, PhD

Tanggal Ujian Tesis : 24 Januari 2017

SK Penguji : 133/sk/un10.7/kp/2016SK Penguji :

4
 KATA PENGANTAR

Dengan memanjatkan puji syukur ke hadirat Allah SWT, karena atas

ridha-Nya penulis dapat menyelesaikan tesis dengan judul: Pengaruh Pemberian
Catechins terhadap Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax serta Neurological Severity Score
Tikus Jantan Rattus norvegicus Galur Wistar Model Cedera Otak Traumatik
Fokal. Didalam tulisan ini, penulis menyajikan bahasan mengenai dampak
pemberian catechins pada otak dengan cedera kepala fokal terhadap jalur
apoptosis intrinsik melalui regulator pro apoptosis Bax dan anti apoptosis Bcl-2,
serta dampaknya pada kecacatan klinis menggunaan neurological severity score.
Selain itu dibahas pula mengenai farmakokinetik dan farmakodinamik catechins
terutama pada sistem saraf pusat.
Dengan selesainya tesis ini, penulis menyampaikan ucapan terima kasih
yang sebesar-besarnya kepada:
1. Dr. dr. Sri Andarini, M.Kes selaku Dekan Fakultas Kedokteran Universitas
Brawijaya Malang,
2. Prof. Dr. dr. Sumarno, DMM, Sp.MK, selaku Kepala Program Studi Ilmu
Biomedik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang,
3. dr. Sri Budhi Rianawati, Sp.S(K), selaku Kepala Laboratorium Ilmu
Penyakit Saraf,
4. dr. Moch. Dalhar, Sp.S(K), selaku Kepala Program Studi Ilmu Penyakit
Saraf Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang,
5. Dr. dr. Retty Ratnawati, M.Sc, selaku ketua pembimbing penelitian,
6. Dr. dr. Masruroh Rahayu, M.Kes, selaku anggota pembimbing penelitian,
7. Dosen pengajar Program Studi Ilmu Penyakit Saraf dan Ilmu Biomedik
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang,
8. Dr. dr. Karyono Mintaroem, Sp.PA, selaku Penguji 1 penelitian,
9. Dr. Husnul Khotimah, S.Si, M.Kes, selaku Penguji 2 penelitian,
10. Bapak, ibu, dan seluruh keluarga yang mendukung penulis dalam
menyelesaikan tesis ini, serta
11. Semua pihak yang telah membantu pelaksanaan penelitan ini.
Sangat disadari bahwa dalam penulisan tesis ini dirasakan banyak
kekurangan dan keterbatasan, oleh karena itu penulis mengharapkan saran yang
membangun dalam perbaikan tesis ini.

Malang, 24 Januari 2017

Penulis

5
 RINGKASAN

Annisa Nurul Arofah, NIM. 126070100111054. Program Studi Magister Ilmu Biomedik
Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang, 18 Januari 2017. Pengaruh
Pemberian Catechins terhadap Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax serta Neurological Severity
Score Tikus Jantan Rattus norvegicus Galur Wistar Model Cedera Otak Traumatik Fokal.
Komisi Pembimbing Ketua: Dr. dr. Retty Ratnawati, M.Sc, Anggota: Dr. dr. Masruroh
Rahayu, M.Kes.

Apoptosis bertanggungjawab pada duapertiga kematian sel yang terjadi pada

cedera otak traumatik. Apoptosis dapat berlangsung melalui beberapa jalur, salah
satunya jalur intrinsik yang diatur oleh famili Bcl-2. Bax dan Bcl-2 merupakan anggota
famili Bcl-2 yang menjadi regulator jalur intrinsik yang bekerja berlawanan. Bax memicu
apoptosis, sedangkan Bcl-2 menghambat aktivasi Bax, sehingga tidak terjadi apoptosis.
Rasio Bcl-2/Bax merupakan reostat untuk menentukan kematian dari sel.
Penghambatan apoptosis merupakan target terapi cedera kepala karena
terdapat interval waktu antara terjadinya cedera kepala dengan apoptosis. Salah satu zat
yang berpotensi menghambat apoptosis adalah catechins, flavonoid dari teh hijau
(Camelia sinensis), yang bersifat anti inflamasi dan anti oksidan. Dengan dihambatnya
apoptosis, diharapkan keparahan cedera kepala dapat berkurang, sehingga
bermanifestasi penurunan neurological severity score (NSS) pada tikus model. Penelitian
ini bertujuan untuk mengetahui apakah terdapat peningkatan signifikan rasio ekspresi
Bcl-2/Bax pada jaringan otak serta penurunan NSS yang signifikan pada tikus Rattus
norvegicus galur Wistar model cedera otak traumatik yang mendapatkan catechins
dibandingkan yang tidak mendapatkan catechins. Pemeriksaan hari ketiga dilakukan
karena merupakan puncak apoptosis dan pemeriksaan hari ketujuh merupakan waktu
untuk terjadinya perbaikan klinis.
Penelitian ini merupakan penelitian dengan desain eksperimental sebenarnya
(true experimental design) di laboratorium secara in vivo dengan randomized post test
only controlled group design pada hewan tikus Wistar (Rattus norvegicus). Model
penjatuhan beban dlakukan dengan penjatuhan tegak lurus beban 45 gram berdiameter
4 mm dari ketinggian 1 meter sebanyak 1 kali pada bagian tengah kepala tikus untuk
menghasilkan cedera otak ringan fokal. Sebanyak 40 ekor tikus Wistar dibagi menjadi
dua kelompok hari penelitian, yaitu hari ketiga dan ketujuh. Masing-masing kelompok hari
dibagi lagi menjadi 5 kelompok perlakuan. Kelompok A (kontrol negatif) merupakan tikus
yang tidak dilakukan cedera kepala; kelompok B (kontrol positif) merupakan tikus model
cedera otak traumatik yang tidak diberikan catechins; kelompok C, D, dan E merupakan
tikus model cedera otak traumatik yang diberi catechins peroral dengan dosis 513, 926,
dan 1113 mg/kgBB/hari. Pengamatan ekspresi Bax, Bcl-2, dan NSS dilakukan pada hari
ketiga dan hari ketujuh. Ekspresi Bax dan Bcl-2 diukur dengan metode imunohistokimia
dengan metode hot spot. Selanjutnya, Bax dan Bcl-2 dinyatakan dalam bentuk rasio Bcl-
2/Bax.
Pada hari ketiga, terdapat penurunan NSS bermakna pada kelompok model
cedera otak traumatik yang mendapatkan catechins dengan dosis 513 dan 926
mg/kgBB/hari dibandingkan yang tidak mendapatkan catechins berdasarkan uji Tukey (p-
value 0.002; 0.034; p0.05). Sedangkan kelompok yang mendapatkan catechins dosis
926 mg/kgB/hari tidak menunjukkan penurunan NSS bermakna (p-value 0.184; p>0.05).
Tidak terdapat korelasi bermakna antara peningkatan dosis catechins dengan penurunan
NSS berdasarkan dengan uji Pearson (rhitung -0.441; p-value 0.088; p>0.05). Sementara
itu, terdapat peningkatan rasio Bcl-2/Bax bermakna pada kelompok model cedera otak
traumatik yang mendapatkan catechins 513, 926, dan 1113 mg/kgBB/hari dibandingkan
yang tidak mendapat catechins berdasarkan uji Mann Whitney (p-value 0.021; 0.021;
0.021; p0.05). Terdapat korelasi positif kuat antara peningkatan dosis catechins dengan
peningkatan rasio Bcl-2/Bax berdasarkan uji Spearman (rhitung 0.710; p-value 0.002;
p0.05). Selain itu, didapatkan bahwa peningkatan rasio Bcl-2/Bax berkorelasi kuat
dengan penurunan NSS pada model cedera otak traumatik baik pada hari (r hitung -0.623;
p-value 0.010; p0.05).

6
 Pada hari ketujuh, terdapat penurunan NSS bermakna pada kelompok model
cedera otak traumatik yang mendapatkan catechins dengan dosis 513, 926, dan 1113
mg/kgBB/hari dibandingkan yang tidak mendapatkan catechins berdasarkan uji Mann
Whitney (p-value 0.017; 0.017; 0.017; p0.05). Terdapat korelasi kuat antara peningkatan
dosis catechins dengan peningkatan NSS berdasarkan uji Spearman (rhitung -0.754; p-
value 0.001; p0.05). Sementara itu, sudah tidak terdapat peningkatan rasio Bcl-2/Bax
bermakna pada kelompok model cedera otak traumatik yang mendapatkan catechins
513, 926, dan 1113 mg/kgBB/hari dibandingkan yang tidak mendapat catechins
berdasarkan uji Mann Whitney (p-value 0.083; 0.083; 0.083; p>0.05). Terdapat korelasi
positif sedang antara peningkatan dosis catechins dengan peningkatan rasio Bcl-2/Bax
berdasarkan uji Spearman (rhitung 0.504; p-value 0.047; p0.05). Sehingga, semakin besar
dosis catechins, semakin besar rasio Bcl-2/Bax. Selain itu, didapatkan bahwa
peningkatan rasio Bcl-2/Bax berkorelasi kuat dengan penurunan NSS pada model cedera
otak traumatik baik pada hari hari ketujuh (r hitung -0.738; p=0.001; p0.05) berdasarkan uji
Spearman. Dapat disimpulkan bahwa dengan pemberian catechins terjadi peningkatan
rasio Bcl-2/Bax dibandingkan tanpa pemberian catechins, terutama pada hari ketiga serta
terjadi penurunan NSS, terutama pada hari ketujuh pada tikus model cedera otak
traumatik.

7
 SUMMARY

Annisa Nurul Arofah, NIM. 126070100111054. Master Program of Biomedical Science,

Faculty of Medicine, Brawijaya University, Malang, January 18th, 2017. The Effect of
Catechins toward Bcl-2/Bax Expression Ratio and Neurological Severity Score in Male
Rat Rattus Norvegicus Strain Wistar Model of Focal Traumatic Brain Injury. Advisory
committee lead: Dr. dr. Retty Ratnawati, M.Sc, Member: Dr. dr. Masruroh Rahayu, M.Kes.

Apoptosis is responsible to two-third cellular death in traumatic brain injury.

Apoptosis is induced by many signaling pathways, one of them is the intrinsic pathway
controlled by Bcl-2 family. Bax and Bcl-2 are members of Bcl-2 family that regulate
intrinsic pathway with antagonistic actions: Bax induces apoptosis and Bcl-2 inhibits Bax
activation so that apoptosis doesnt occur. Bcl-2/Bax ratio is a rheostat to determine cell
death.
Apoptosis is a delayed programmed cell death, therefore it is a potentially fruitful suitable
target for traumatic brain injury therapy. One of potential substances that inhibits
apoptosis is catechin, a flavonoid found in green tea (Camelia sinensis). It inhibits the
release of inflammatory mediators and decreases the production of free radicals. Through
apoptosis inhibition, the improvement of the severity of brain injury is expected, which is
characterized by the improvement of the neurological severity score (NSS). NSS is a
measurement for determining the functional state in the rat model. Therefor the study
aimed at determining the presence or absence of the effect of catechin on the escalation
of Bcl-2/Bax ratio and significant reduction of NSS in Wistar Rat (Rattus norvegicus)-
model of traumatic brain injury. Suppose an effect was evident, it was then inquired
whether the differences were significant between the control and the treatment group.
Rats were observed at day-3 and day-7 because day-3 was the peak of apoptosis and at
7 days was needed for the clinical improvement to be evident.
This study employed the in vivo true experimental laboratory study, randomized
post-test only controlled group design, conducted on experimental Wistar rat (Rattus
norvegicus). The weight-drop injury was induced by using 45 gram cylinder mass-
diameter 4 mm dropped vertically from 1 meter height to the middle area of the head,
resulted in mild traumatic brain injury. This study was conducted with 40 rats that were
divided into two day-groups. Each day-group was divided into 5 intervention groups, each
group consisted of 4 rats. Each arm was then divided into group A (negative control), in
which the rats did not performed traumatic brain injury; group B (positive control), in
which the injured rats were not provided with catechins; group C, D, and E consisted of
the traumatic brain injury models that were provided with catechins 512, 926, 1113 mg/kg
body weight per day, respectively. Catechin was given orally, after that Bax and Bcl-2
expression, and NSS were measured in day 3 and day 7. Bax and Bcl-2 expression were
measured using immunohistochemistry with hot spot method. Then, Bax and Bcl-2 were
denoted into Bcl-2/Bax ratio. The expressions of Bax, Bcl-2, and NSS were observed in
day-3 and day-7. Bax and Bcl-2 expressions were measured through
immuncohystochemistry by using hot-spot method. Bax and Bcl data were then
converted into a sBcl-2/Bax ratio.
In day-3, groups of traumatic brain injury model treated with catechins 513 and
1113 mg/kgBW/day had significantly decreased NSS compared to control group
according to Tukey test (p-value 0.002; 0.034; p0.05). There was no significant decrease
in NSS in the group treated with catechins 926 mg/kgBW/day (p-value 0.184; p>0.05).
According to Pearson test, there was no significant correlation of the increased catechins
dose and lower level of NSS (p-value 0.184; p>0.05). There is no correlation between the
increased catechins dose and decreased NSS according to Pearson test (p-value 0.088;
p>0.05). Meanwhile, groups of traumatic brain injury model treated with catechins 513,
926 and 1113 mg/kgBW/day had signifcantly increased Bcl-2/Bax ratio compared to
group of untreated ones according to Mann Whitney test (p-value 0.021; 0.021; 0.021;
p0.05). There was a strong positive correlation of increased catechins dose and
decreased Bcl-2/Bax ratio (rcount 0.710; p-value 0.002; p0.05). According to Spearmans

8
correlation test, there was a strong negative correlation between Bcl-2/Bax ratio and NSS
in traumatic brain injury model (rcount -0.623; p 0.010; p<0.05).
In day-7, groups of traumatic brain injury model treated with catechins 513, 926
and 1113 mg/kgBW/day had significantly decreased NSS compared to the control group
according to Mann Whitney test (p-value 0.017; 0.017; 0.017; p0.05). According to
Spearman test, there was strong a correlation between increased catechins dose and
increased NSS rcount -0.754; p 0.001; p0.05). According to Mann Whitney test performed
to Bcl-2/Bax ratio, there was no significant difference between catechins-treated group
and control positive (p-value 0.083; 0.083; 0.083; p>0.05). According to Spearman
correlation test, there was a moderate positive significant correlation of increased of
catechins dose with increased of Bcl-2/Bax ratio (r count 0.504; p-value 0.047; p0.05).
According to Spearman correlation test, there was a strong significant negative
correlation of Bcl-2/Bax ratio with NSS (r count -0.738; p-value 0.001; p<0.05). This study
concluded that Bcl-2/Bax ratio significantly increased in day-3 and the severity of
traumatic brain injury (according to NSS) significantly decreased in day-7 in rat model of
traumatic brain injury treated with catechins when compared to the untreated ones.

9
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ................................................................................................i

HALAMAN PERSETUJUAN..................................................................................ii

PERNYATAAN ORISINALITAS TESIS.................................................................iii

IDENTITAS TIM PENGUJI...................................................................................iv

KATA PENGANTAR..............................................................................................v

RINGKASAN........................................................................................................vi

SUMMARY.........................................................................................................viii

DAFTAR ISI..........................................................................................................x

DAFTAR GAMBAR..............................................................................................xii

DAFTAR TABEL.................................................................................................xiv

DAFTAR LAMPIRAN...........................................................................................xv

DAFTAR SINGKATAN........................................................................................xvi

BAB 1 PENDAHULUAN....................................................................................1
1.1 Latar Belakang........................................................................................1
1.2 Rumusan Masalah..................................................................................3
1.3 Tujuan.....................................................................................................3
1.4 Manfaat...................................................................................................4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA.............................................................................6

2.1 Cedera Otak Traumatik...........................................................................6
2.2 Kematian Neuron pada Cedera Otak Traumatik...................................25
2.3 Jalur Neuroproteksi Endogen setelah Cedera Kepala...........................38
2.4 Dampak Klinis Cedera Otak Traumatik.................................................39
2.5 Pemeriksaan Neurologis in Vivo pada Tikus.........................................42
2.6 Model Cedera Otak in Vivo...................................................................44
2.7 Anatomi Otak Rattus norvegicus Galur Wistar......................................46
2.8 Histologi dan Histopatologi Korteks Otak..............................................49
2.9 Catechins..............................................................................................53

BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN........................67

3.1 Kerangka Konsep.................................................................................67
3.2 Hipotesis Penelitian..............................................................................70

BAB 4 METODE PENELITIAN........................................................................71

4.1 Strategi Penelitian.................................................................................71
4.2 Rancangan Penelitian...........................................................................71
4.3 Populasi dan Sampel............................................................................71

10
 4.4 Lokasi dan Waktu Penelitian.................................................................72
4.5 Variabel Penelitian................................................................................73
4.6 Definisi Operasional Variabel................................................................74
4.7 Bahan dan Alat......................................................................................75
4.8 Prosedur Penelitian...............................................................................79
4.9 Alur Penelitian.......................................................................................86
4.10 Analisis Data........................................................................................86

BAB 5 HASIL PENELITIAN.............................................................................89

5.1 Overview Penelitian..............................................................................89
5.2 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Hasil NSS Tikus Wistar Model
Cedera Otak Traumatik.........................................................................90
5.3 Hubungan Dosis Pemberian Catechins dengan NSS Tikus Wistar Model
Cedera Otak Traumatik.........................................................................95
5.4 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Ekspresi Bax pada Tikus
Wistar Model Cedera Otak Traumatik...................................................97
5.5 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Ekspresi Bcl-2 pada Tikus
Wistar Model Cedera Otak Traumatik.................................................102
5.6 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax
pada Tikus Model Cedera Otak Traumatik..........................................107
5.7 Hubungan Dosis Catechins dengan Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax...........113
5.8 Hubungan Rasio Ekspresi Bcl2/Bax dengan Hasil NSS pada Tikus
Wistar Model Cedera Otak Traumatik..................................................114

BAB 6 PEMBAHASAN...................................................................................115
6.1 Penurunan NSS Tikus Model Cedera Otak Traumatik setelah Pemberian
Catechins............................................................................................121
6.2 Peningkatan Dosis Catechins Berhubungan dengan Penurunan NSS
pada Tikus Model Cedera Otak Traumatik..........................................122
6.3 Peningkatan Rasio Bcl-2/Bax Tikus Model Cedera Otak Traumatik
setelah Pemberian Catechins.............................................................123
6.4 Peningkatan Dosis Catechins berhubungan dengan Peningkatan Rasio
Bcl-2/Bax pada Tikus Model Cedera Otak Traumatik..........................126
6.5 Peningkatan Rasio Bcl-2/Bax Sebanding dengan Penurunan Hasil NSS.
........................................................................................................... 127
6.6 Keterbatasan Penelitian......................................................................128

BAB 7 KESIMPULAN....................................................................................130
7.1 Kesimpulan.........................................................................................130
7.2 Saran..................................................................................................130

DAFTAR PUSTAKA..........................................................................................132

LAMPIRAN.......................................................................................................139

11
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Klasifikasi model cedera otak traumatik in vivo..............................8

Gambar 2.2 Cedera otak traumatik dan faktor yang mempengaruhi prognosis.
.....................................................................................................11

Gambar 2.3 Proses terjadinya kerusakan jaringan otak pada cedera kepala
traumatik......................................................................................14

Gambar 2.4 Perubahan metabolisme energi pada cedera otak traumatik.......16

Gambar 2.5 Proses pembentukan NO oleh NOS............................................19

Gambar 2.6 Mekanisme NO dalam menginduksi sitotoksisitas pada sel otak

setelah terjadi cedera otak traumatik...........................................23

Gambar 2.7 Jalur apoptosis yang melibatkan caspase....................................31

Gambar 2.8 Skema sub-grup famili Bcl-2........................................................33

Gambar 2.9 Interaksi famili Bcl-2 pro-apoptosis dan anti apoptosis................35

Gambar 2.10 Reostat model interaksi Bax dan Bcl-2........................................36

Gambar 2.11 Korteks yang rentan terganggu pada trauma kepala pada manusia
....................................................................................................41

Gambar 2.12 Pemeriksaan NSS.......................................................................42

Gambar 2.13 Anatomi otak Rattus norvegicus galur wistar...............................47

Gambar 2.14 Anatomi otak Rattus norvegicus galur wistar...............................47

Gambar 2.15 Anatomi tulang kranium Rattus norvegicus galur wistar...............48

Gambar 2.16 Pemetaan struktur fungsional otak tikus dilihat dari vertex...........48

Gambar 2.17 Lapisan korteks serebri................................................................49

Gambar 2.18 Mikroanatomi korteks serebri.......................................................50

Gambar 2.19 Gambaran histologi otak cedera pada tikus model penjatuhan
beban...........................................................................................51

Gambar 2.20 Diagram sawar darah otak...........................................................52

Gambar 2.21 Mekanisme kerja catechins pada kaskade iskemia pada penyakit
neurodegeneratif dan neuroinflamasi...........................................63

Gambar 3.1 Kerangka konsep penelitian.........................................................67

Gambar 4.1 Alat untuk penjatuhan beban.......................................................76

12
Gambar 4.2 Alat pengukuran NSS..................................................................78

Gambar 4.3 Perlakuan cedera otak traumatik.................................................80

Gambar 4.4 Pemberian catechins dengan sonde............................................81

Gambar 4.5 Penilaian NSS..............................................................................81

Gambar 4.6 Kranium tikus setelah pembedahan.............................................83

Gambar 4.7 Alur penelitian Kelompok Tikus Hari Ketiga.................................86

Gambar 4.8 Alur penelitian Kelompok Tikus Hari Ketujuh...............................87

Gambar 5.1 Keparahan cedera kepala berdasarkan NSS pada tikus model
cedera otak traumatik hari ketiga.................................................93

Gambar 5.2 Grafik histogram rerata NSS tikus model cedera otak traumatik
hari ketujuh..................................................................................95

Gambar 5.3 Ekspresi Bax dengan pewarnaan imunohistokimia pada korteks

serebri tikus cedera otak traumatik pada hari ketujuh................100

Gambar 5.4 Grafik histogram rata-rata ekspresi imunohistokimia Bax pada

neuron post cedera kepala traumatik kelompok kontrol dan
perlakuan pada hari ketiga dan ketujuh.....................................102

Gambar 5.5 Ekspresi Bcl-2 dengan pewarnaan imunohistokimia pada korteks

serebri tikus cedera otak traumatik pada hari ketiga..................103

Gambar 5.6 ...Ekspresi Bcl-2 dengan pewarnaan imunohistokimia pada korteks

serebri tikus cedera otak traumatik pada hari ketujuh................105

Gambar 5.7 Grafik histogram rata-rata ekspresi imunohistokimia Bcl-2 pada

neuron post cedera kepala traumatik kelompok kontrol dan
perlakuan pada hari ketiga dan ketujuh.....................................107

Gambar 5.8 Grafik histogram rasio ekspresi imunohistokimia Bcl-2/Bax pada

neuron post cedera kepala traumatik kelompok kontrol dan
perlakuan pada hari ketiga dan ketujuh......................................112

13
 DAFTAR TABEL

Tabel 2.1 Inisiasi cedera otak sekunder setelah cedera otak traumatik............13

Tabel 2.2 NSS..................................................................................................43

Tabel 4.1 Penilaian NSS..................................................................................82

Tabel 5.1 Nilai Rerata dan Standar Deviasi NSS Tikus Model Cedera Otak
Traumatik pada Hari Ketiga..............................................................91

Tabel 5.2 Hasil Uji Post Hoc Tukey pada NSS Tikus Wistar Model Cedera Otak
Traumatik pada Hari Ketiga..............................................................92

Tabel 5.3 Nilai Rerata dan Standar Deviasi NSS Tikus Model Cedera Otak
Traumatik pada Hari Ketujuh............................................................94

Tabel 5.4 Hasil Uji Mann Whitney NSS Tikus Wistar Model Cedera Otak
Traumatik pada Hari Ketujuh............................................................95

Tabel 5.5 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Ekspresi Bax Jaringan Otak Tikus
Wistar Model pada Kepala Traumatik pada Hari Ketiga...................98

Tabel 5.6 Hasil Uji Mann Whitney Ekspresi Bax pada Neuron Tikus Model
Cedera Otak Traumatik pada Hari Ketiga.........................................99

Tabel 5.7 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Ekspresi Bax Jaringan Otak Tikus
Wistar Model pada Kepala Traumatik pada Hari Ketujuh................100

Tabel 5.8 Hasil Uji Mann Whitney pada Ekspresi Imunohistokimia Bax pada
Neuron Post Cedera OtakTraumatik Ketujuh..................................101

Tabel 5.9 .......Nilai Rata-rata dan Standar Deviasi Ekspresi Bcl-2 Jaringan Otak
Tikus Wistar Model pada Kepala Traumatik pada Hari Ketiga........104

Tabel 5.10 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Ekspresi Bcl-2 Jaringan Otak Tikus
Wistar Model pada Kepala Traumatik pada Hari Ketujuh................106

Tabel 5.11 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax Neuron
Tikus Post Cedera Otak Traumatik hari Ketiga...............................109

Tabel 5.12 Hasil Uji Mann Whitney pada Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax pada Otak
Tikus Cedera Otak Traumatik pada Hari Ketiga..............................109

Tabel 5.13 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax Neuron
Tikus Post Cedera Otak Traumatik hari Ketujuh..............................111

Tabel 5.14 Hasil Uji Mann Whitney pada Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax pada Otak
Tikus Cedera Otak Traumatik pada Hari Ketujuh............................111

Tabel 5.15 Hasil Uji Korelasi Spearman Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax dan NSS.. .114

14
 DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Keterangan Laik 14

Etik ........................................................ 2
Lampiran 2 Lembar Permintaan Konsultasi Slide 14
Penelitian ............... 3
Lampiran 3 Uji Normalitas dan 14
Homogenitas ....................................... 4
Lampiran 4 Uji Beda dan Uji Lanjutan Ekspresi 14
Bax ........................... 7
Lampiran 5 Uji Beda dan Uji Lanjutan Ekspresi Bcl- 15
2 ........................... 5
Lampiran 6 Uji Beda dan Uji Lanjutan Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax 15
........ 6
Lampiran 7 Uji Beda dan Uji Lanjutan 16
NSS .............................................. 4
Lampiran 8 Uji 17
Korelasi .................................................................. 0
......
Lampiran 9 Uji Korelasi Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax dengan 17
NSS .......... 1
Lampiran Riwayat 17
10 Hidup ................................................................... 3

15
 DAFTAR SINGKATAN

*OH : radikal hidroksil

*NO2 : radikal nitrogen dioksida
3-NT : nitrotirosin
4-HNE : 4-hydroxy-2-nonenal
8-OhdG : 8-hydroxydeoxyguanosine
A : amyloid
ADP : adenosine diphosphate
AIF : apoptosis induce factor
Apaf1 : apoptotic protease activating factor
APOE : apolipoprotein E
ATP : adenosin triphosphate
Bad : Bcl-2 antagonist of cell death
Bak : Bcl-2-antagonist/ killer
Bax : Bcl-2-associated protein X
Bcl-2 : B cell lymphoma gene 2
BH : Bcl-2 homology region
Bid : BH3-domain-only death agonist
Bok : Bcl-2-related ovarian killer protein
BPO : benzoil peroxide
C : (+)-catechin
CA : cornu ammon
2+
Ca : ion kalsium
cAMP : cyclic-AMP
Caspase : cysteine aspartate-specific protease
CBF : cerebral blood flow
CDC : Centers for Disease Control and Prevention
cGMP : cyclic guanosine monophosphate
CICD : caspase-independent cell death
COMT : catechol-O-methyltransferase
CPD : cyclobutane pyrimidine dimer
CT-Scan : computerized tomography scan
Cu2+ : ion cuprum
DNA : deoxyribonucleic acid

16
EC : (-)-epicatechin
ECG : (-)-epicatechin-3-gallate
EGC : (-)-epigallocatechin
EGCG : (-)-Epigallocatechin-3-gallate
endoG : endonuklease G
eNOS : endothelial nitric oxide synthetase
ERK : extracellular regulated kinase
FADD : FAS-associated death domain protein
FoxO : forkhead box protein O
GABA : Gamma ammino butyric acid
GC : (-)-gallocatechin
GCS : Glasgow Coma Scale
GTP : guanosine tri phosphate
H2O2 : hidrogen peroksida
HE : hematoxylin eosin
HPLC : high-performance liquid chromatography
HSP : heat shock protein
ICAM-1 : intracellular adhesion molecules 1
ICE : interleukin-1b converting enzyme
ICP : intracranial pressure
IL-1 : interleukin 1 beta
IL-6 : interleukin 6
iNOS : inducible nitric oxide synthetase
IQ : 2-amino-3-methylimidazol (4,5-f) quinoline
JNK : c-Jun N-terminal kinase
K+ : ion kalium
Kb : kilo basa
kDa : kilo dalton
MAP : mean arterial pressure
MAPK : mitogen-activated protein kinase
MDA : malondyaldehide
Mg : miligram
Mg/kgBB/hari : miligram per satu kilogram berat badan per hari
Mg/kgBW/day : miligram per one kilogram body weight per day
mL : mili liter

17
mM : mili mol
mRNA : messenger ribonucleid acid
MPTP : mitochondrial permeability transition pore
N2O3 : dinitrogen trioksida
+
Na : ion natrium
NAD : nicotinamide adenine dinucleotide
NADPH : nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NFB : nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
MCL-1 : myeloid cell leukaemia sequence 1
NMDA : N-methyl-D-aspartate
nNOS : neuronal nitric oxide synthetase
NO : nitric oxide, nitrogen oksida
NO* : radikal nitrogen oksida
NOS : nitric oxide synthetase
NSS : neurological severity scale
-
O2 : ion oksida, superoksida
ONOO- : peroksinitrit
ONOOH : peroxynitrous acid
PARP : poly-ADP ribose polymerase
PBS : prediluted blocking serum
PCOOH : phosphatidylcholine hydroperoxide
PERDOSSI : Perhimpunan Dokter Spesialis Saraf Indonesia
PI3K : phosphatidyl inositol-3 kinase
PMN : polimorfonuklear
PUMA : p53 upregulated modulator of apoptosis
RNS : reactive nitrogen species
ROS : reactive oxygen species
SOR : superoxide anion radical
ssDNA : single-stranded DNA
SPSS : Statistical Products and Service Solutions
TBI : traumatic brain injury
tBid : truncated of Bid
TCA : tricarboxylic acid
TNF : tumor necrosis factor alpha
TNFR1 : TNF receptor-1

18
TRADD : TNFR-associated death domain protein
TRAIL : TNF receptor apoptosis inducing ligand
TUNEL : Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling
VCAM-1 : vascular adhesion molecules 1
XO : xantin oxidase

19
 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Cedera otak traumatik merupakan injury pada kepala yang paling sering

terjadi di seluruh dunia terutama pada populasi dewasa muda (Roozenbeek et

al., 2013). Cedera otak traumatik mengakibatkan gangguan fungsi kognisi, fisik,

atau psikologis akut (Dietrich and Bramlett, 2015) dan berlangsung proses

patologis berkelanjutan yang secara kolektif mengakibatkan terjadinya

neurodegerasi (Albert-Weissenberger and Sirn, 2010). Kerusakan neuron yang

terjadi pada cedera otak traumatik sebagian besar disebabkan karena cedera

otak sekunder (Selladurai and Reilly, 2007). Dengan tatalaksana yang ada saat

ini, meskipun progresivitas penyakit dan kematian dapat diturunkan, tetapi

keluaran pasien tetap sama (Dinsmore 2013).

Pada trauma, peningkatan influks kalsium ke dalam sel diikuti oleh

peningkatan ambilan kalsium ke mitokondria. Peningkatan influks kalsium ini

berlangsung sejak 6 jam hingga 7 hari setelah cedera (Prins et al., 2013). Selain

menyebabkan edema sitotoksik, peningkatan ambilan kalsium ke badan sel dan

akson neuron juga menyebabkan kematian neuron (Prins et al., 2013). Salah

satu bentuk kematian neuron pada cedera otak traumatik adalah melalui jalur

apoptosis intrinsik, dimana nitric oxide (NO) yang dihasilkan berlebihan oleh NOS

mengaktivasi mediator proapoptosis, diantaranya faktor transikripsi p53, B cell

lymphoma-2-associated protein X (Bax) dan caspase (Gahm et al., 2005). Bax

merupakan anggota famili B cell lymphoma gene 2 (Bcl-2), yang bersifat pro-

apoptosis (Tamm et al., 2001). Bax telah diketahui sebelumnya dapat

menginduksi apoptosis pada neuron (Shacka and Roth, 2006). Aktivitas Bax

dihambat oleh Bcl-2, yaitu anggota famili Bcl-2 yang bersifat anti-apoptosis. Bcl-

1
2 menghambat kaskade apoptosis dengan membentuk heterodimer dengan Bax

(Tamm et al., 2001). Selain itu, Bcl-2 berikatan protein Bcl-2 homology region-3-

only (BH3-only) sehingga protein tersebut tidak mengaktivasi Bax (Czabotar et

al., 2014). Tingginya rasio Bcl-2/Bax akan membuat sel resisten terhadap

stimulus apoptosis dan rendahnya rasio tersebut akan memacu apoptosis (Tamm

et al., 2001; Vaskivuo et al., 2002). Proses apoptosis yang diatur oleh famili Bcl-2

adalah apoptosis yang bergantung caspase, dengan puncak pada hari 1-3

setelah cedera otak traumatik (Stoica and Faden, 2010). Apabila pada manusia

keparahan cedera dinilai dengan Glasgow Coma Scale (GCS), maka pada

binatang model cedera kepala dinilai dengan Neurological Severity Score (NSS)

(Aritonang, 2007; Xiong et al., 2014).

Catechins adalah polifenol yang berasal dari teh hijau (Mandel and

Youdim, 2004; Gramza et al., 2005). Kandungan terbesar dari catechins adalah

(-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG). Catechins memiliki efek luas dan diteliti

untuk terapi berbagai penyakit, mulai antikanker, antivirus, antibakteri hingga

antidiabetes (Mandel and Youdim, 2004; Gramza et al., 2005; Chaturvedi and

Mishra, 2012). Manfaaat utama dari catechins didapatkan dari efek anti inflamasi

dan anti oksidannya (Yashin et al., 2012). Pemberian ekstrak teh hijau yang

mengandung catechins pada penelitian tikus trauma medula spinalis terbukti

menghambat apoptosis dengan mencegah up-regulasi ekspresi Bax dan

mencegah down-regulasi Bcl-2 (Paterniti et al., 2009). Hal ini menunjukkan

bahwa catechins juga memiliki potensi sebagai alternatif terapi pada cedera otak

traumatik.

Berdasarkan latar belakang diatas, akan dilakukan penelitian mengenai

pengaruh pemberian catechins pada apoptosis jalur intrinsik (dengan mengamati

ekspresi Bax dan Bcl-2 yang merupakan regulator jalur intrinsik) pada tikus

model cedera otak traumatik fokal dan menilai perbaikan skala keparahan

2
neurologisnya menggunakan NSS. Pengamatan pada hari ketiga didasarkan

atas terjadinya puncak apoptosis pada hari ketiga, sedangkan pengamatan pada

hari ketujuh didasarkan karena proses cedera sekunder melalui influks kalsium

dan peningkatan NO berlangsung sampai 7 hari. Pada hari ketujuh setelah

cedera kepala, ekspresi Bcl-2 di jaringan otak sudah normal, seperti halnya

dengan ekspresi Bax pada hipokampus, meskipun pada korteks lobus temporal

dan occipital masih dapat dijumpai peningkatan ekspresi Bax (Stoica and Faden,

2010; Schoch et al., 2012; Prins et al., 2013). Selain itu, pada ketujuh perbaikan

fungsional pada cedera otak traumatik ringan sudah dapat teramati (Albert-

Weienberger et al., 2012).

1.2 Rumusan Masalah

Rumusan masalah pada penelitian ini adalah apakah dengan

peningkatan pemberian dosis catechins mampu menurunkan NSS dan

meningkatkan rasio ekspresi Bcl-2/Bax jaringan otak pada tikus model cedera

otak traumatik dibandingkan tikus yang tidak diterapi catechins dengan

pengamatan hari ketiga dan ketujuh?

1.3 Tujuan

1.3.1 Tujuan Umum

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui bahwa peningkatan

pemberian dosis catechins menurunkan NSS dan meningkatkan rasio ekspresi

Bcl-2/Bax jaringan otak pada tikus model cedera otak traumatik dibandingkan

tikus model cedera otak traumatik yang tidak diterapi catechins dengan

pengamatan hari ketiga dan ketujuh.

3
1.3.2 Tujuan Khusus

1. Mengetahui adanya penurunan NSS pada tikus model cedera otak tramatik

yang diterapi catechins dibandingkan tikus model cedera otak traumatik yang

tidak diterapi dengan catechins pada pengamatan hari ketiga dan ketujuh.

2. Mengetahui hubungan antara peningkatan dosis catechins dengan

penurunan NSS pada tikus cedera otak traumatik pada pengamatan hari

ketiga dan ketujuh.

3. Mengetahui adanya peningkatan rasio ekspresi Bcl-2/Bax pada jaringan otak

tikus model cedera otak traumatik yang diterapi dengan catechins

dibandingkan tikus dengan cedera otak traumatik yang tidak diterapi dengan

catechins pada pengamatan hari ketiga dan ketujuh.

4. Mengetahui hubungan antara peningkatan dosis catechins dengan

peningkatan rasio ekspresi Bcl2/Bax pada jaringan otak tikus cedera otak

traumatik pada pengamatan hari ketiga dan ketujuh.

5. Mengetahui hubungan antara peningkatan rasio ekspresi Bcl-2/Bax dengan

penurunan NSS pada tikus cedera otak traumatik pada pengamatan hari

ketiga dan ketujuh.

1.4 Manfaat

Manfaaat dari penelitian ini adalah berupa manfaat di bidang akademis

dan bagi masyarakat umum.

1.4.1 Manfaat Akademis

1. Penelitian ini bermanfaat dalam pengembangan ilmu pengetahuan dan

praktik klinis dalam pengembangan penggunaan catechins sebagai terapi

dasar teori alternatif pada cedera otak traumatik.

4
2. Penelitian ini juga dapat menjadi sumber referensi bagi penelitian lanjutan

mengenai pemanfaatan catechins sebagai terapi cedera otak traumatik.

1.4.2 Manfaat bagi Masyarakat

Penelitian ini diharapkan dapat menjadi dasar teori penggunaan

catechins dalam pengembangan terapi alternatif cedera otak traumatik di

masyarakat sehingga mengurangi risiko komplikasi cedera otak sekunder dan

mengurangi jumlah kematian serta kecacatan akibat cedera otak traumatik.

5
 BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Cedera Otak Traumatik

2.1.1 Definisi Cedera Otak Traumatik

Cedera otak traumatik atau traumatic brain injury (TBI) adalah kerusakan

pada otak yang disebabkan karena gaya mekanik eksternal, berupa benturan,

penetrasi atau pergerakan yang cepat dari otak dalam tulang tengkorak akibat

gaya dari luar (Prins et al., 2013), berakibat gangguan fungsi kognisi, fisik, atau

psikologis akut (Dietrich and Bramlett, 2015) dan kejadian patologis lanjutan

yang secara kolektif mengakibatkan terjadinya neurodegerasi (Albert-

Weissenberger and Sirn, 2010). Cedera otak traumatik merupakan proses

berkelanjutan yang dapat menyebabkan gangguan pada banyak organ dan

dapat mempercepat perjalanan penyakit sehingga terjadi penurunan angka

harapan hidup penderitanya (Erdman et al., 2011).

2.1.2 Epidemiologi Cedera Otak Traumatik

Cedera otak traumatik merupakan salah satu masalah kesehatan dan

sosial ekonomi utama di seluruh dunia. Hal itu juga merupakan salah satu

penyebab kematian utama terutama pada populasi dewasa muda dan dapat

menyebabkan kecacatan permanen pada pasien-pasien yang dapat bertahan

hidup (Maas et al., 2008; Dinsmore, 2013; Roozenbeek et al., 2013). Penyebab

terbanyak cedera otak di Amerika Serikat pada tahun 2002-2006 adalah jatuh,

kecelakaan lalu lintas, dan benturan lainnya (Albert-Weissenberger and Sirn,

2010).

6
 Menurut Ontario Brain Injury Association, prevalensi cedera otak setiap

tahunnya di Ontario diperkirakan 18.000 dengan 4.000 kejadian pada populasi

pediatri (0-14 tahun) (Coronado et al., 2011). Di kawasan Eropa, insiden cedera

otak traumatik sebesar 235 kasus tiap 100.000 penduduk per tahun (Werner and

Engelhard, 2007). Di Amerika Serikat, sekitar 53.000 orang meninggal dunia

karena cedera otak traumatic setiap tahunnya (Coronado et al., 2011). Prevalensi

cedera di Indonesia pada tahun 2013 adalah 8,2% dengan terjadi peningkatan

dibandingkan dengan tahun 2007. Penyebab cedera terbanyak, yaitu jatuh

(40,9%) dan kecelakaan sepeda motor (40,6%) (Badan Penelitian dan

Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, 2013).

2.1.3 Klasifikasi Cedera Otak Traumatik

Cedera kepala diklasifikasikan dalam berbagai aspek. Secara praktis

cedera kepala diklasifikasikan berdasarkan mekanisme cedera, tingkat

keparahan dan morfologinya (gambar 2.1). Berdasarkan mekanisme cedera,

cedera kepala dibagi menjadi cedera statis (remuk) dan dinamis. Cedera dinamis

kemudian dibedakan menjadi cedera kepala langsung dan tidak langsung

(karena daya ledakan). Cedera langsung dibedakan menjadi cedera benturan

dan akselerasi. Baik cedera kepala benturan maupun akselerasi dibedakan

berdasarkan gerakan kepala saat terbentur, yaitu apakah kepala bergerak bebas

atau tertahan gerakannya. Cedera benturan dibedakan menjadi cedera tumpul

dan cedera tembus (penetrasi, menembus duramater) dan cedera kepala karena

akselerasi. Cedera kepala tumpul, dapat terjadi pada kecepatan tinggi yang

berhubungan dengan kecelakaan kendaraan bermotor atau kecepatan rendah,

yang biasanya disebabkan jatuh dari ketinggian atau dipukul dengan benda

tumpul. Cedera kepala tembus disebabkan oleh cedera peluru atau cedera

7
tusukan benda tajam. Tingkat keparahan cedera dinilai dari tingkat skala

kesadaran Glasgow (GCS), sedangkan morfologi cedera dibagi menjadi fraktur

kranium dan lesi intrakranial (Cernak, 2005; Aritonang, 2007).

Untuk meniru bentuk cedera kepala, dikembangkan model pada binatang

coba sesuai bentuk cedera yang akan diduplikasi. Salah satunya adalah model

penjatuhan beban (weight-drop), yang merupakan cedera mekanik, dinamik,

langsung, dengan tidak tembus pada jaringan otak, serta kepala binatang

ditahan (gambar 2.1). Bentuk model cedera otak in vivo dijelaskan pada bagian

2.5.

Gambar 2.1 Klasifikasi model cedera otak traumatik in vivo. Berdasarkan gaya
mekanis, cedera kepala dibagi menjadi cedera statik dan dinamik. Cedera dinamik dapat
terjadi secara tidak langsung (seperti pada cedera ledakan), maupun terjadi secara
langsung (karena benturan maupun karena akselerasi kepala). Berdasarkan
benturannya, cedera dibedakan antara cedera penetrasi dan non penetrasi. Baik cedera
langsung maupun tidak langsung masing-masing juga dibedakan dari tahanan atau
bebasnya gerakan kepala (Cernak, 2005).

Tingkat keparahan dari cedera otak traumatik pada manusia digolongkan

melalui skala GCS (Dinsmore, 2013; Roozenbeek et al., 2013). GCS digunakan

untuk menilai secara kuantitatif kelainan neurologis dan dipakai secara umum

dalam deskripsi beratnya penderita cedera kepala. Penilaian GCS terdiri atas 3

8
komponen, yaitu respon membuka mata, respon motorik dan respon verbal

(PERDOSSI, 2006). Hipoksia, hipoperfusi, hipotensi dan intoksikasi alkohol yang

dapat berpengaruh terhadap GCS sehingga dapat mengganggu hasil diagnosis.

Oleh karena itu pada pasien cedera otak traumatik perlu dilakukan resusitasi dan

koreksi pada penyebab reversibelnya sebelum dilakukan pengukuran GCS

(Dinsmore, 2013; Roozenbeek et al., 2013). Menurut Perhimpunan Dokter

Spesialis Saraf Indonesia (PERDOSSI), pasien cedera otak traumatik ringan,

didefinisikan sebagai pasien dengan GCS 13-15, dengan gambaran klinis tidak

sadar selama kurang dari tigapuluh menit, tanpa ditemukan defisit neurologis

dengan gambaran computerized tomography scan (CT Scan) tidak didapatkan

lesi operatif, dan durasi amnesia post trauma kurang dari satu jam (PERDOSSI,

2006).

Secara morfologi cedera kepala dapat dibagi atas fraktur kranium dan lesi

intrakranial. Fraktur kranium dapat terjadi pada atap atau dasar tengkorak, dibagi

atas fraktur kalvaria dan fraktur dasar kranium. Fraktur kalvaria, berbentuk garis

atau bintang, dengan depresi ataupun tanpa depresi tulang, dan terbuka maupun

tertutup. Fraktur dasar kranium (basis cranii), dapat terjadi dengan ataupun tanpa

kebocoran cairan serebrospinal, dengan ataupun tanpa paresis nervus kranialis.

Lesi intrakranial dapat digolongkan menjadi lesi fokal dan lesi difus. Lesi fokal

terjadi akibat kontak secara langsung pada kepala yang mengakibatkan kontusio,

laserasi, pendarahan intrakranial, perdarahan epidural, perdarahan subdural

serta perdarahan intraserebral. Lesi difus terjadi akibat akselerasi dan deselerasi,

sehingga terjadi kommosio serebri, edema otak dan cedera aksonal difus

(PERDOSSI, 2006; Aritonang, 2007).

9
2.1.4 Patofisiologi Cedera Otak Traumatik

Karakteristik cedera otak traumatik bervariasi tergantung individu, bentuk

terjadinya cedera, serta proses berkelanjutan yang belum diketahui. Proses

tersebut memiliki patobiologi umum, termasuk perdarahan intrakranial,

eksitotoksik, gangguan ionik, penurunan aliran darah otak, edema, stress

oksidatif, inflamasi, dan kematian sel yang terjadi akut (dalam beberapa menit)

dan sub akut (dalam 24 jam). Patofisiologi tersebut berlangsung hingga jangka

panjang meskipun masih merupakan konsekuensi dari cedera primer. Cedera

otak traumatik berhubungan dengan defisit neurologis, penyakit

neurodegeneneratif (misalnya Alzheimer, parkinson, dan ensefalopati kronik),

gangguan neuro endokrin, dan gangguan muskuloskeletal. (Erdman et al., 2011).

Patogenesis pada cedera otak traumatik terbagi menjadi dua bagian yang

saling berkaitan yaitu: (a) cedera primer (kerusakan primer atau kerusakan

mekanis) yang terjadi pada saat trauma berlangsung; (b) cedera sekunder

(kerusakan sekunder atau kerusakan non-mekanik). Kedua bagian itu

merupakan rangkaian proses patologis berkelanjutan yang dimulai sejak

terjadinya trauma hingga beberapa hari setelah trauma (Werner and Engelhard,

2007; Prins et al., 2013). Proses cedera otak sekunder ini dapat berlangsung

sangat panjang. Pada pasien dengan cedera otak traumatik yang dirawat hingga

12 bulan, masih ditemukan penanda apoptosis pada cairan serebrospinalisnya

(Zhang et al., 2005). Hal ini mendukung diperlukannya pemberian pengobatan

jangka panjang bertujuan menurunkan apoptosis setelah cedera kepala (Zhang

et al., 2005).
Adanya cedera primer dan sekunder, baik secara langsung maupun tidak

langsung, menyebabkan kerusakan sawar darah otak, edema, peningkatan

tekanan intrakranial, gangguan aliran darah, iskemi dan hipoksia, peningkatan

laktat dan defisit energi. Hal itu menyebabkan kematian seluler, cedera aksonal,

10
atrofi otak, maupun demyelinisasi, serta secara klinis ditemukan adanya

gangguan fungsi (Xiong et al., 2014). Setiap penderita memiliki kondisi yang

berbeda sebelum terjadinya cedera, baik usia, status psikologis, status nutrisi,

maupun penyakit penyerta (Gambar 2.2). Selain itu, kondisi setelah cedera juga

mempengaruhi keluaran fungsional, baik kelainan pada intrakranial, maupun

komorbid ekstrakranial seperti fraktur, infeksi penyerta, serta rehabilitasi

fungsional (Clark et al., 2015).

Faktor Faktor hipertensi
Sebelum Setelah hipotensi
Cedera Cedera edema otak
kerusakan
hipoksia hematom sawar darah
peningkatan
usia massa otak
TIK
intrakranial
status Cedera Cedera
psikologis Keluaran
Otak Otak
Fungsional
Primer Sekunder
status
nutrisi Cedera
ekstrakranial Rehabilitasi
fungsional
penyakit kejang infeksi
penyerta Reorganisasi
neuron

Limitasi dari
faktor eksternal

Gambar 2.2 Cedera otak traumatik dan faktor yang mempengaruhi

prognosis. Garis vertikal tebal menandakan momentum terjadinya cedera. Setiap
penderita memiliki kondisi yang berbeda sebelum terjadinya cedera, baik usia, status
psikologis, status nutrisi, maupun penyakit penyerta. Selain itu, kondisi setelah cedera
juga mempengaruhi keluaran fungsional, baik kelainan pada intrakranial, maupun
komorbid ekstrakranial seperti fraktur, infeksi penyerta, serta rehabilitasi fungsional.
Keterangan: TIK; tekanan intrakranial (Clark et al., 2015).

2.1.4.1 Cedera Otak Primer

Cedera otak primer disebabkan oleh kerusakan mekanik pada jaringan

otak dan pembuluh darah pada saat terjadinya trauma. Efek primer terjadi karena

kerusakan mekanik, yaitu kontusi langsung otak terhadap tengkorak, kontusi otak

akibat gerakan terhadap permukaan kasar bagian dalam tengkorak maupun

kontusi tidak langsung pada sisi otak kontralateral (contracoup), robekan dan

11
regangan antar otak maupun dengan struktur tengkorak, regangan dan ruptur

pembuluh darah yang menyebabkan kelainan mikrosirkulasi, regangan dan

ruptur jaringan otak (sel neuron, akson neuron dan glia), pelepasan isi

intraseluler dan intravaskuler, penurunan aliran darah akibat peningkatan

tekanan intrakranial dan edema, serta gangguan metabolisme. Proses cedera

primer diikuti oleh cedera sekunder (Cernak, 2005; Selladurai and Reilly, 2007;

Erdman et al., 2011; Xiong et al., 2014).

Pada gambaran CT scan, kontusio serebri tampak pada gray matter.

Pada sentral area terlihat hiperdens dan bercampur dengan area hipodens yang

merupakan bagian dari nekrosis perdarahan, serta bagian otak disekitarnya yang

mengalami edema (pericontusional edema). Tidak ada aliran darah pada area

sentral kontusio serebri. Sedangkan pada daerah perikontusio terjadi penurunan

aliran darah dan autoregulasi pembuluh darah terganggu (vasoparalysis). Karena

daerah perilesional mengalami kerusakan parsial, sel disana rentan terhadap

injury akibat penurunan perfusi yang disebabkan karena penurunan tekanan

rerata arteri (MAP, mean arterial pressure), peningkatan tekanan intrakranial,

ataupun vasokonstriksi setelah hipokapnea akibat dari hiperventilasi (Selladurai

and Reilly, 2007).

Perkembangan dari lesi kontusio serebri adalah perkembangan

komponen perdarahan, berupa penyatuan fokusfokus perdarahan kecil.

Perluasan komponen perdarahan dari kontusio serebri dapat mencapai maksimal

dalam waktu dua belas jam post trauma pada 84% pasien. Selain itu juga disertai

dengan adanya edema pada zona perkontusional (Selladurai and Reilly, 2007).

Dapat terjadi kerusakan berat pada akson yang ditandai adanya gangguan pada

transport aksonal, kerusakan sitoskeleton, edema, dan diskoneksi. Selain itu juga

dapat terjadi kerusakan pada sistem vaskuler (Erdman et al., 2011).

12
2.1.4.2 Cedera Otak Sekunder

Cedera otak sekunder merupakan fenomena metabolik (Werner and

Engelhard, 2007). Proses patologis pada cedera otak sekunder yang terpenting

adalah hipoksia, hipotensi, hiperkarbia, gangguan elektrolit, hipoglikemia,

hiperglikemia, anemia, koagulopati, hipertermia, dan hipotermia (Selladurai and

Reilly, 2007; Werner and Engelhard, 2007). Proses yang terjadi pada cedera otak

sekunder terdapat pada tabel 2.1 dan gambar 2.3.

Tabel 2.1 Inisiasi cedera otak sekunder setelah cedera otak traumatik
Dalam beberapa menit
Tarikan pada sel atau akson,
pemadatan neurofilamen,
gangguan transport aksonal,
edema aksonal, diskoneksi
aksonal
Gangguan sawar darah otak
Pelepasan glutamat
berlebihan
Beberapa menit hingga 24 jam Lebih dari 24 jam
Kerusakan oksidatif, peningkatan Perubahan metabolik non
spesies oksigen dan nitrogen iskemi
reaktif (lipid peroksidase, protein
oksidasi, peroksinitrit),
penurunan antioksidan endogen
(glutation)
Iskemi
Edema sitotoksik dan vasogenik

Pelepasan neurotransmiter Aktivasi enzim: kalikrenin-kinin,

(katekolamin, serotonin, kalpain, caspase, endonuklease,
histamin, GABA, asetilkolin) metaloprotein

Perdarahan (toksisitas Penurunan ATP, perubahan

dimediasi oleh besi)
Gangguan fisiologis:
penurunan aliran darah otak,
hipotensi, hipoksemia,
peningkatan tekanan
intrakranial, penurunan
tekanan perfusi otak
Peningkatan produksi radikal
bebas
Gangguan homeostasis
kalsium
metabolsime di otak (gangguan
pemakaian glukosa, penggunaan
sumber energi lain), peningkatan
laktat
Perubahan sitoskeletal pada
badan sel dan akson
Perubahan ekspresei gen: siklus
sel, metabolisme, inflamasi,
reseptor, kanal dan transporter,
transduksi sinyal, sitoskeleton,
protein membran untuk
transkripsi dan translasi

Gangguan mitokondria Inflamasi: sitokin, kemokin,

molekul adhesi sel, influks
leukosit, aktivasi makrofag
ATP (Adenosine Triphosphate); GABA (Gamma ammino butyric acid) (Erdman et al., 2011)
Cedera otak traumatik ditunjukkan dengan adanya kerusakan jaringan

secara langsung dan gangguan pada regulasi dari aliran darah dan metabolisme

pada otak. Pola ischemia-like ini menyebabkan adanya akumulasi dari asam

laktat karena glikolisis anaerob, peningkatan permeabilitas membran dan

13
pembentukan edema secara berturutan (Erdman et al., 2011; McAllister, 2011;

Prins et al., 2013). Iskemia dapat menyebabkan hipotensi serta vasokonstriksi

yang diinduksi oleh prostaglandin (Erdman et al., 2011).

Adanya edema serebri merupakan salah satu faktor utama terhadap

morbiditas dan mortalitas yang tinggi. Terjadi kerusakan parsial sel parenkim

pada sentral kontusio juga pada zona perikontusional. Pada area nekrosis dari

kontusio, makromolekuler didegradasi menjadi molekul yang lebih kecil dan

dapat meningkatkan osmolaritas jaringan serta menyebabkan perpindahan

cairan dari intravaskuler ke area nekrosis kontusio (edema osmotik).

Pembengkakan area sentral kontusio menyebabkan penekanan zona

perikontusional dan menyebabkan iskemik lebih lanjut dan edema. Pada hari

ketiga setelah cedera otak traumatik juga terjadi edema sitotoksik yang dapat

bertahan hingga dua minggu (Werner and Engelhard, 2007). Edema

perikontusional dapat mencapai maksimal pada 48-72 jam setelah cedera

(Selladurai and Reilly, 2007). Selain itu, kerusakan sawar darah otak

menyebabkan terjadinya edema vasogenik yang berlangsung mulai beberapa

jam setelah cedera kepala (Werner and Engelhard, 2007). Sawar darah otak

menutup kembali setelah dua minggu (Finnie, 2013).

14
Gambar 2.3 Proses terjadinya kerusakan jaringan otak pada cedera kepala
traumatik. Cedera otak traumatik diikuti oleh cedera sekunder dimana terjadi kerusakan
otak yang lebih lanjut setelah cedera primer (Erdman et al., 2011).

2.1.4.2.1 Perubahan Metabolisme Glukosa

Glukosa merupakan sumber ATP utama pada otak. ATP tersebut

didapatkan dari proses glikolisis. Asam piruvat dari glikolisis kemudian melalui

siklus tricarboxylic acid (TCA) dan ATP kemudian diperoleh dari transfer elektron

pada mitokondria (Prins et al., 2013).

Setelah cedera otak traumatik, terjadi peningkatan ambilan glukosa

karena dibutuhkan energi seluler untuk menjaga keseimbangan ion dan

keseimbangan membran potensial. Peningkatan ambilan glukosa tersebut diikuti

oleh periode penurunan ambilan glukosa. Penurunan ambilan glukosa ini diduga

terjadi akibat penurunan aliran darah yang bergantung oleh aliran darah otak,

penurunan fungsi transporter glukosa atau karena penurunan kebutuhan

15
glukosa. Pada kondisi tersebut terjadi penurunan produksi asam piruvat

sehingga terjadi penurunan produksi ATP. Terjadi penumpukan Ca 2+ pada

mitokondria. Selain itu juga diproduksi radikal bebas yang merusak membran

plasma, seperti diilustrasikan pada gambar 2.4. (Prins et al., 2013).

2.1.4.2.2 Pelepasan Glutamat

Terjadi serangkaian proses patofisiologi yang melibatkan depolarisasi

membran terminal bersamaan dengan pelepasan yang berlebihan dari

neurotransmiter eksitatorik (diantaranya glutamat dan aspartat) dan voltage-

dependent kanal ion kalsium (Ca2+) dan ion natrium (Na+). Pelepasan glutamat

yang berlebihan akan menyebabkan terjadinya toksisitas pada sel yang ditandai

dengan terjadinya kerusakan membran sel dan gangguan pada homeostesis dari

ion-ion dalam sel (Prins et al., 2013). Proses pelepasan glutamat juga dapat

menginduksi terjadinya respon inflamasi pada jaringan saraf yang dapat

menyebabkan kerusakan lebih lanjut dari sel saraf (Bell, 2007; Werner and

Engelhard, 2007; Erdman et al., 2011; McAllister, 2011; Prins et al., 2013).

16
Gambar 2.4 Perubahan metabolisme energi pada cedera otak traumatik.
Pada cedera otak traumatik, terjadi penurunan produksi asam piruvat sehingga terjadi
penurunan produksi ATP. Terjadi penumpukan Ca 2+ pada mitokondria. Selain itu juga
diproduksi radikal bebas yang merusak membran plasma (Prins et al., 2013).

Pada membran sel, cedera otak menyebabkan perubahan ion dan

neurotransmiter, sehingga mempengaruhi potensial membran. Kurang dari satu

jam setelah cedera otak, terjadi pelepasan glutamat dalam jumlah besar pada

terminal presinaps. Glutamat yang berlebihan menyebabkan aktivasi reseptor N-

methyl-D-aspartate (NMDA) postsinaps (Prins et al., 2013).

17
2.1.4.2.3 Gangguan Kanal Ion dan Energi

Metabolisme anaerob tidak mampu mempertahankan energi selular yang

cukup, sehingga cadangan ATP menurun serta terjadi kegagalan pompa ion

membran yang tegantung pada ATP (Bell, 2007; Werner and Engelhard, 2007;

Erdman et al., 2011; McAllister, 2011; Prins et al., 2013). Pompa ion natrium

kalium (Na-K)-ATPase berfungsi untuk menjaga membran potensial tetap -40

hingga -70 mV. Pompa Na-K-ATPase membutuhkan ATP untuk mengeluarkan

ion kalium (K+) ke ekstraseluler dan memasukkan ion natrium (Na+) dan kalsium

(Ca2+) ke intraseluler. Peningkatan K+ intraseluler sebanding dengan keparahan

cedera. Agar terjadi keseimbangan semula, dibutuhkan ATP dalam jumlah besar

sehingga menurunkan ketersediaan energi seluler dengan cepat (Prins et al.,

2013).
Selain peningkatan K+, juga terjadi peningkatan Ca2+ intraseluler. Dalam

keadaan fisiologis, konsentrasi Ca2+ ekstraseluler jauh lebih tinggi dibandingkan

dengan di dalam sel. Konsentrasi Ca2+ dalam sel adalah sebesar 0,001 mM

sedangkan konsentrasi Ca2+ ekstraseluler adalah 1 mM. Dalam keadaan normal

Ca2+ mempunyai beberapa peranan yaitu mekanisme transduksi sinyal neuron,

sintesis dan sekresi neurotransmitter, ekstabilitas membran sel, plastisitas

neuron, aktivitas metabolisme, sintesis protein, proses long term potentiation

(McAllister, 2011; Prins et al., 2013). Sebaliknya apabila konsentrasi Ca2+ intrasel

berlebihan, timbul edema, infark, kejang, vasospasme, apoptosis dan nekrosis

(Erdman et al., 2011). Ca2+ yang terakumulasi mengaktifkan ambilan Ca2+ oleh

mitokondria. Peningkatan ambilan Ca2+ pada mitokondria menyebabkan stress

oksidatif sehingga terjadi gangguan fungsi mitokondria. Peningkatan Ca 2+ terjadi

dalam enam jam setelah cedera dan tetap meningkat hingga 4-7 hari setelah

cedera (Prins et al., 2013).

Pertama, Ca2+ intraseluler meningkat melalui mekanisme pelepasan

neurotransmiter dari neuron yang terganggu. Masuknya Ca2+ ke dalam sel

18
memicu pengeluaran simpanan kalsium di dalam sel. Peningkatan kalsium di

dalam sel memicu terjadinya reaksi intraseluler sehingga terjadi edema

sitotoksik. Kedua, neuron dan akson yang mengalami gangguan mengalami

mekanoporasi sehingga terjadi ambilan kalsium ekstraseluler ke dalam badan sel

dan akson. Kedua mekanisme tersebut menyebabkan kematian sel (McAllister,

2011).
Influks berlebihan dari Ca2+ dan Na+ menyebabkan self-digesting process

dalam sel. Proses tersebut mengakibatkan adanya peningkatan konsentrasi

asam lemak bebas dan radikal bebas di dalam sel. Selain itu dapat terjadi

perubahan dan fragmentasi deoxyribonucleic acid (DNA) serta hambatan dalam

proses perbaikan DNA. Keseluruhan proses tersebut menyebabkan terjadinya

degradasi membran dari struktur selular dan vaskular sehingga terjadi nekrosis

dan apoptosis sel. Akibatnya terjadi kecacatan dan bahkan kematian pada

penderita cedera otak traumatik (Bell, 2007; Werner and Engelhard, 2007;

Erdman et al., 2011; McAllister, 2011; Prins et al., 2013).

2.1.4.2.4 Peningkatan Radikal Bebas

Kaskade sitotoksik juga dapat disebabkan karena terbentuknya radikal

bebas serta gangguan membran lisosom yang menyebabkan pelepasan enzim

hidrolitik ke intraseluler (McAllister, 2011). Radikal bebas adalah molekul yang

memiliki elektron yang tidak berpasangan. Molekul tersebut bersifat reaktif

karena menarik elektron dari sekitar, sehingga terjadi kerusakan sel membran,

protein, dan DNA. Radikal bebas dapat dikelompokkan menjadi 2 kelompok

besar, yaitu spesies oksigen reaktif (ROS) dan spesies nitrogen reaktif (RNS).

Peningkatan produksi ROS dan RNS menyebabkan kerusakan oksidatif. Selain

itu, akumulasi Ca2+ intraseluler yang terjadi pada cedera otak traumatik yang

mengaktifkan berbagai enzim, misalnya xantin dehidrogenase, fosfolipase A2,

19
dan NOS, akibatnya terjadi peningkatan produksi ion oksida (O2-) dan radikal

nitrogen oksida (NO*) (Prins et al., 2013).

NOS adalah suatu enzim dimer yang terbentuk dari 2 subunit, masing-

masing mengandung 3 domain yang berbeda, yaitu domain reduktase, domain

ikatan calmodulin, dan domain oksigenase. Domain reduktase bekerja

mentransfer elektron dari nicotinamide adenine dinucleotidephosphate (NADPH)

ke domain oksigenase dari subunit dimer yang berlawanan. Domain ikatan

calmodulin memiliki lokasi ikatan untuk Ca2+-calmodulin. Domain oksigenase

memiliki lokasi ikatan untuk tetrahydrobiopterin, heme, dan arginine dan

mengkatalisis konversi arginine menjadi citrulline dan NO. Di samping kelima

kofaktor ini, NOS juga membutuhkan 3 ko-substrat: L-arginine, oksigen, dan

NADPH (gambar 2.5). NOS merupakan enzim yang berperan untuk membentuk

NO (Huang, 2004; Gahm et al., 2005).

Terdapat tiga isoform NOS pada otak, dua isoform diantaranya juga

diekspresikan pada kondisi normal, yaitu neuronal nitric oxide synthetase (nNOS)

dan endothelial nitric oxide synthetase (eNOS). nNOS terdapat dalam neuron

serta pada astrosit dengan kadar rendah. eNOS dapat ditemukan dalam endotel

pembuluh darah serebral. Satu isoform yang lain diekspresikan pada kondisi

patologis, yaitu inducible nitric oxide synthetase (iNOS). iNOS dapat ditemukan

pada astrosit, mikroglia, otot polos pembuluh darah, dan sel endotel (Bell, 2007).

L-Arginine + O2
O2-
NADPH
NOS
NADP+
NO
L-Citrulline

Gambar 2.5 Proses pembentukan NO oleh NOS. NOS mampu membentuk NO

dengan memediasi reaksi antara asam amino L-arginine dan NADPH menjadi NADP +
dan L-citrulline yang menghasilkan produk NO dan O2- (Gahm et al., 2005).

NO yang diproduksi oleh eNOS berperan penting dalam menjaga aliran

darah serebral saat istirahat melalui vasodilatasi pembuluh darah otak (Gahm et

20
al., 2005). NO yang diproduksi oleh nNOS berpartisipasi dalam respons

serebrovaskular terhadap aktivitas metabolik melalui mediasi plastisitas sinaps

dan sinyal neuronal (Huang, 2004; Gahm et al., 2005). Beberapa penelitian juga

menemukan peranan NO dalam pengaturan tekanan dalam otak (Gahm et al.,

2005). NO yang diproduksi oleh nNOS juga dapat memiliki aktivitas sitotoksik

dalam kondisi patologis seperti trauma, apabila kadarnya berlebihan. Proses

fisiologis di otak yang diperantarai oleh NO, antara lain pengaturan tonus

vasomotor basal, inhibisi agregasi platelet dan leukosit, sitoksisitas yang

dimediasi oleh makrofag, neurotransmisi, neuroproteksi selektif, sinaptogenesis,

sinyal intraselular, plastisitas sinaps, dan formasi memori (Huang, 2004).

NO memediasi fungsi biologis melalui efek direk dan indirek. Efek direk

adalah efek yang cepat terjadi antara NO dan molekul biologis yang spesifik.

Efek direk yang paling banyak diketahui adalah aktivasi guanylate cyclase larut,

yang menyebabkan peningkatan cyclic guanosine monophosphate (cGMP)

intraselular, suatu pengatur kontraktilitas otot polos, agregasi platelet, dan adhesi

leukosit yang penting. Efek direk tejadi bila kadar NO rendah, sedangkan efek

indirek timbul bila kadar NO tinggi. Sel atau jaringan yang berada di dekat

sumber NO dapat mengalami efek direk dan indirek dari NO, sementara sel yang

berjauhan hanya akan mengalami efek indirek karena kadar NO menurun akibat

difusi dan konsumsi (Gahm et al., 2005; Bell, 2007).

Efek patologis tidak melibatkan NO secara langsung, namun dimediasi

oleh RNS. RNS terbentuk dari reaksi NO* dengan oksigen (O2) maupun dengan

O2-. Reaksi NO* dengan oksigen menghasilkan dinitrogen trioksida (N2O3). N2O3

memediasi stres nitrosatif (S-nitrosothiol) dan peroksinitrit memediasi stres

oksidatif (peroksidasi lipid, kerusakan DNA, hidroksilasi). O2- merupakan hasil

dari metabolisme normal dan merupakan prekursor hidrogen peroksida (H 2O2).

Melalui reaksi fenton, H2O2 dapat membentuk radikal hidroksil (*OH). Reaksi NO*

dengan O2- dengan membentuk peroksinitrit (ONOO-) (Prins et al., 2013).

21
Peroksinitrit merupakan radikal bebas yang sangat toksik dan dapat

mengoksidasi protein, lipid, dan DNA; serta secara homolitik berdekomposisi

untuk menghasilkan neurotoksin yang lebih poten, seperti radikal hidroksil

(Huang, 2004). Pada pH fisiologis, peroksinitrit berbentuk peroxynitrous acid

(ONOOH), suatu campuran tidak stabil yang berdekomposisi untuk membuang

*OH dan radikal nitrogen dioksida. (*NO 2); O2- + *NO ONOO - + H+

ONOOH *NO2 + *OH (Werner and Engelhard, 2007).

Terdapat penelitian yang membuktikan bahwa peroksinitrit berperan

penting dalam patogenesis kerusakan sekunder setelah cedera kepala.

Peningkatan aktivitas ketiga isoform NOS setelah cedera kepala menjelaskan

formasi dan keterlibatan peroksinitrit pada cedera otak sekunder (gambar 2.8).

Isolasi NOS mitokondria menunjukkan bahwa peroksinitrit juga merupakan

radikal bebas utama yang dihasilkan di mitokondria. Keterlibatan peroksinitrit

dalam patogenesis cedera kepala dibuktikan dengan adanya radikal bebas yang

berasal dari peroksinitrit akan meningkatkan akumulasi nitrotirosin (3-NT) dalam

otak yang mengalami cedera (Werner and Engelhard, 2007).

Radikal bebas yang terbentuk pada kondisi normal dapat diatasi oleh

sistem antioksidans seluler tetapi efek negatif terjadi dalam kondisi patologis

(Prins et al., 2013). Berkurangnya produksi NO oleh eNOS akan menyebabkan

penurunan perfusi otak, sementara produksi NO yang berlebihan oleh nNOS dan

iNOS dapat menyebabkan neurotoksisitas dan kerusakan selular. Perubahan

metabolisme NO terjadi pada perubahan patofisiologis yang terjadi setelah

cedera otak traumatik (Huang, 2004).

NO dapat menyebabkan sitotoksisitas melalui beberapa mekanisme

(gambar 2.6). NO dapat secara langsung merusak DNA, menghambat respirasi

mitokondria, atau menginduksi apoptosis neuron melalui aktivasi dan

peningkatan regulasi dari mediator proapototik seperti faktor transkripsi p53, Bax

dan caspase. Kerusakan DNA yang terjadi akibat reaksi dengan NO juga dapat

22
menyebabkan terjadinya aktivasi dari enzim untuk memperbaiki DNA yaitu PARP

yang mengkonsumsi banyak energi sehingga dapat mengakibatkan metabolisme

energi mengalami kolaps dan kemudian terjadi nekrosis akibat sel mengalami

kekurangan energi. Hal ini diperparah oleh gangguan secara langsung dari

perbaikan DNA oleh NO (Gahm et al., 2005; Bell, 2007).

Pada tahap awal cedera otak traumatik, eNOS dan nNOS berkontribusi

dalam peningkatan NO meskipun produksi NO lebih didominasi oleh nNOS. NO

yang diproduksi oleh nNOS pada tahap awal cedera otak traumatik ini

menimbulkan efek yang negatif. Sebaliknya, NO yang diproduksi oleh eNOS

menimbulkan efek yang positif dan berfungsi mempertahankan CBF dalam otak

yang mengalami cedera. NO yang diproduksi dalam sel endotel atau dalam

neuron perivaskular segera setelah trauma bersifat protektif akibat vasodilatasi

dan peningkatan aliran darah serebral, penurunan aktivasi platelet, dan

berkurangnya adhesi leukosit. NO-donor juga terbukti protektif selama reperfusi,

melalui pengeluaran ROS dan perlindungan terhadap cedera reperfusi yang

dimediasi oleh ROS (Calabrese et al., 2004).

Pada tahap lanjut dari cedera otak traumatik, NO yang berasal dari

neuron parenkim atau dari sel inflamasi memberikan efek yang negatif. NO juga

dapat menginduksi cedera otak melalui efeknya pada fungsi astrosit, karena NO

dapat memperlambat uptake glutamat astrosit. Pada iskemia global, induksi

iNOS terjadi dominan pada astrosit yang reaktif, sehingga menyebabkan rilis NO,

yang dapat meningkatkan kadar glutamat perineuronal. Dengan demikian, efek

NO pada otak tergantung dari dimana dan kapan NO tersebut disintesis

(Calabrese et al., 2004; Gahm et al., 2005).

23
Gambar 2.6 Mekanisme NO dalam menginduksi sitotoksisitas pada sel otak
setelah terjadi cedera otak traumatik. NO menginduksi Bax dan p53 yang
menyebabkan terjadinya apoptosis pada sel, menginduksi kerusakan DNA, dan
meningkatkan ekspresi ONOO- yang menyebabkan peroksidasi lemak dan nitrasi protein
(Gahm et al., 2005).

Kerusakan oksidatif yang diinduksi oleh radikal bebas berperan penting

dalam kerusakan struktur neurovaskular sekunder post trauma kepala.

Kerusakan oksidatif yang dimediasi oleh lipid peroksidatif terjadi segera setelah

aksi radikal bebas yang dihasilkan dari ROS dan RNS, dan dikatalisis oleh

mekanisme yang bergantung pada zat besi. Namun demikian, radikal lipid

peroksida adalah propagator sentral dari reaksi lipid peroksidatif melewati

membran selular dan mitokondrial. Selain itu, 4-hydroxynonenal (4-HNE)

berikatan kovalen dengan protein selular dan mitokondrial, yang selanjutnya

akan mengganggu fungsinya. Telah terbukti bahwa akumulasi 4-HNE

mengganggu mekanisme transpor glutamat, yang akan meningkatkan aktivitas

reseptor NMDA, sehingga akan memperlama influks Ca2+ (Hansson et al., 2008).
Kerusakan lipid peroksidatif menyebabkan terbebasnya aldehida yang

reaktif, seperti 4-HNE dari membran saraf. 4-HNE adalah campuran yang

neurotoksik. Neurotoksisitasnya disebabkan oleh kemampuannya untuk

24
mengikat asam amino dasar dengan protein selular. Modifikasi protein post

translasional menyebabkan hilangnya fungsi dari berbagai protein selular

enzimatik. 4-HNE juga terbukti berinteraksi dengan asam nukleat untuk

membentuk deoxyribonucleic acid (DNA) yang dapat mengakibatkan mutasi

selular serius. Terdapat peranan signifikan dari kerusakan lipid peroksidatif yang

diinduksi oleh radikal bebas pada kasus post cedera kepala traumatik. Hal ini

ditunjukkan dengan beberapa penelitian bahwa terapi antioksidan yang

mengurangi lipid peroksidatif dapat meningkatkan kondisi neurologis setelah

cedera kepala (Werner and Engelhard, 2007; Hansson et al., 2008).

Influx kalsium ke intraseluler juga mengaktivasi enzim P38 mitogen-

activated protein kinase (MAPK). Enzim P38 MAPK akan mengaktivasi gen iNOS

untuk melakukan transkripsi menghasilkan protein iNOS. Induksi iNOS setelah

cedera otak traumatik juga dipengaruhi oleh sitokin pro-inflamasi, yaitu tumor

necrosis factor alpha (TNF), interleukin 1 beta (IL-1), dan interleukin 6 (IL-6),

yang dirilis setelah kerusakan otak. TNF dan IL-1 adalah dua induktor utama

dari transkripsi messenger ribonucleid acid (mRNA) iNOS dan bekerja melalui

jalur nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NFB). iNOS

berperan besar dalam reaksi inflamasi dan dapat mengkatalisis sintesis NO pada

otak yang cedera (Calabrese et al., 2004).

Produksi OH* meningkat sebesar 60% dalam 30 menit pada cedera otak

traumatik. Ekspresi iNOS muncul sekitar 6 jam setelah cedera, mencapai

puncaknya dalam 8-23 jam, dan dapat diamati hingga 7 hari setelah cedera.

Ekspresi iNOS terdeteksi dalam neuron, makrofag, neutrofil, astrosit, dan

oligodendrosit. Selain itu, ekspresi iNOS juga ditemukan pada sel otot polos

serebrovaskular setelah cedera otak traumatik. Hal itu menunjukkan bahwa iNOS

juga berperan dalam hiperemia serebral yang terjadi 2-3 hari setelah cedera otak

traumatik (Bayir et al., 2005; Prins et al., 2013).

25
2.1.4.2.5 Inflamasi

Cedera primer maupun sekunder mengaktifkan sitokin proinflamasi,

prostaglandin, radikal bebas dan komplemen. Proses ini menginduksi kemokin

dan molekul adhesi untuk memobilisasi sistem imun dan sel glia. Terjadi aktivasi

leukosit polimorfonuklear (PMN) dan beradhesi dan menuju endotel. Terjadi

infiltrasi PMN beserta makrofg dan limfosit T. Akibat infliltrasi leukosit, terjadi up-

regulasi P-selectin, intracellular adhesion molecules (ICAM-1) dan vascular

adhesion molecules (VCAM-1). Jaringan yang cedera dan mengalami inflamasi

tersebut kemudian mengalami kerusakan. Astrosit membentuk mikrofilamen dan

netropin sehingga terbentuk jaringan parut. Progresivitas kerusakan jaringan

terkait dengan pelepasan mediator neurotoksik serta pelepasan NO dan sitokin

(Werner and Engelhard, 2007).

2.2 Kematian Neuron pada Cedera Otak Traumatik

Proses kematian sel digolongkan berdasarkan gambaran morfologi

(apoptosis, nekrosis, autofagi, dan terkait mitosis), enzim yang terlibat (protease

caspase dan cathepsin), fungsional (terprogram atau tidak, fisiologis atau

patologis), dan karakter imunogenik (Patarroyo and Vargas, 2013). Dua

mekanisme utama kematian sel, termasuk neuron, adalah nekrosis dan

apoptosis. Dua mekanisme kematian neuron yang menyertai cedera otak

tersebut mempunyai proses dan sifat morfologi yang berlainan (Kaufmann and

Hengartner, 2001; Kumar et al., 2010).

Pada usia dewasa, neuron yang ada merupakan neuron matur post

mitotik yang tidak berada di dalam siklus sel. Neuron memasuki siklus sel saat

menuju melalui proses kematian sel, seperti pada kondisi neurodegeneratif.

Seperti halnya pada proses degenerasi, diduga masuknya neuron dalam siklus

sel merupakan hulu dari dimulainya eksekusi kematian pada cedera otak

26
traumatik maupun injury lain di otak. Penanda dari aktivasi siklus sel antara lain

cyclin D1, CDK4, E2F5, c-myc, dan PCNA. Penghambatan pada aktivasi siklus

sel juga dapat memperbaiki keluaran tikus pada cedera otak traumatik (Stoica

and Faden, 2010).

Kematian neuron pada cedera otak traumatik berlangsung dalam dua

tahap. Tahap pertama terjadi segera setelah cedera kepala, akibat benturan

ataupun luka tembus pada otak. Terjadi kematian neuron berupa nekrosis karena

kerusakan membran dan eksitotoksitas serta gangguan metabolik ireversibel.

Tahap kedua kematian neuron terjadi lebih lambat, yaitu melalui mekanisme

apoptosis. Proses kematian terprogram ini yang banyak diteliti untuk target terapi

(Schoch et al., 2012). Proses kematian terprogram merupakan penyebab

terbesar dari kematian sel dan banyaknya kematian terprogram berhubungan

dengan prognosis buruk pada cedera kepala traumatik (Stoica and Faden, 2010).

Berdasarkan spekulasi, kematian sel melalui nekrosis mengkontribusikan

sepertiga kematian sel pada cedera kepala, sepertiga lainnya disebabkan oleh

apoptosis yang tergantung caspase, sedangkan sepertiganya yang terakhir

disebabkan oleh apoptosis yang tidak tergantung caspase (Zhang et al., 2005).

2.2.1 Nekrosis

Nekrosis merupakan reaksi yang terjadi secara cepat dan pasif akibat

kegagalan energi. Nekrosis lebih banyak terjadi melalui mekanisme calpain yang

kemudian menyebabkan respon inflamasi (McAllister, 2011). Nekrosis terjadi

akibat kondisi lingkungan eksternal yang ireversibel. Sel yang mengalami

kerusakan ini mengalami pembengkakan, termasuk pada organelnya, yaitu

mitokondria. Membengkaknya sel disebabkan karena hilangnya kemampuan

membran plasma untuk mengatur pengeluaran ion dan cairan, sehingga isi sel

keluar dan menyebabkan inflamasi disekitar jaringan (Kaufmann and Hengartner,

27
2001; Kumar et al., 2010). Proses nekrosis terjadi secara pasif (Czabotar et al.,

2014). Sitoskeleton merupakan substrat bagi calpain. Oleh karena itu, aktivasi

calpain menyebabkan gangguan transpor seluler, destruksi sitoarsitektur dan

membran, diakhiri dengan terjadinya kematian sel (McAllister, 2011).

Penumpukan Ca2+ berlebihan akibat hipoksia dan iskemia mengaktifkan

enzim-enzim, diantaranya protease, lipase, dan endonuklease. Akibatnya, terjadi

perubahan fosfolipid yang merupakan bagian membran sel. Kemudian terjadi

mobilisasi asam arakhidonat menuju sitosol. Asam arakhidonat diubah oleh

lipooksigenase dan siklooksigenase menjadi leukotriens, prostaglandin dan

tromboksan. Proses ini disertai dengan pelepasan oksigen radikal bebas yang

mengakibatkan adanya peroksidasi membran sel (Czabotar et al., 2014).

Ca2+ berlebihan di dalam sel juga mengaktifkan enzim iNOS pada astrosit

sehingga terbentuk NO. NO akan bereaksi dengan oksigen radikal bebas

sehingga terbentuk peroksinitrit, yaitu suatu senyawa yang sangat reaktif yang

akan memacu peroksidasi lipid. Peroksidasi lipid membran sel menjadikan

membran sel pecah dan menjadikan isi sel tumpah keluar (Slemmer, Weber and

de Zeuw, 2004).
Secara morfologi, sel-sel neuron yang mengalami nekrosis berkelompok

dan mengalami edema sebelumnya, kromatin tidak berubah, morfologi

mitokondria berubah, kemudian membran sel pecah sehingga mengakibatkan isi

sel berada pada ekstraseluler. Hal tersebut memicu terjadinya reaksi peradangan

(Slemmer et al., 2004).

2.2.2 Apoptosis

Cedera otak traumatik juga dapat menyebabkan terjadinya apoptosis.

Proses apoptosis dapat dideteksi pada sel neuron tikus di sekitar jejas otak pada

10 menit setelah cedera dan mencapai puncaknya pada hari ketiga (Mao et al.,

2014).

28
2.2.2.1 Mekanisme Umum Apoptosis

Apoptosis merupakan jalur kematian sel yang dipacu oleh mekanisme

pengaturan intraseluler dimana sel yang akan mati mengaktifkan enzim yang

akan mendegradasi DNA nukleus sel dan protein sitoplasma (Kaufmann and

Hengartner, 2001; Ghobrial et al., 2005; Kumar et al., 2010). Apoptosis pada

kondisi fisiologis berfungsi untuk mengatur jumlah sel, proliferasi dan

menghilangkan sel yang sudah tidak berguna pada proses perkembangan

normal dari sel, seperti pada embriogenesis, hormone-dependent involution pada

siklus menstruasi dan atresia folikel pada menopause, delesi sel pada proliferasi

sel epitel, eliminasi sel reaktif limfosit yang berlebihan, kematian sel yang

diinduksi oleh sel T sitotoksik pada infeksi virus, dan pada perkembangan tumor

(Kaufmann and Hengartner, 2001; Ghobrial et al., 2005; Kumar et al., 2010).

Pada kondisi patologis, apoptosis bertanggung jawab pada kematian sel

seperti stimulasi kerusakan eksternal pada radiasi, obat sitotoksik anti-kanker,

infeksi virus, atrofi akibat obstruksi saluran pada parenkim pankreas dan ginjal,

juga kematian sel pada tumor. Disregulasi proses kematian sel ini mempunyai

peranan pada patogenesis dari penyakit. Penilaian jumlah sel yang mengalami

kematian karena apoptosis dinyatakan dalam indeks apoptosis (Kaufmann and

Hengartner, 2001; Ghobrial et al., 2005; Kumar et al., 2010).

Secara garis besar, proses apoptosis terdiri dari 3 fase, yaitu yaitu fase

induksi (induction phase), fase efektor (effector phase), dan fase degradasi

(degradation phase). Fase induksi tergantung oleh death-inducing signal yang

akan memulai sinyal kaskade pro-apoptosis. Hal-hal yang dapat memulai

terjadinya proses apoptosis adalah adanya radikal bebas, signal ceramid, stres

oksidatif, pengobatan ultraviolet, aktivitas kanal ion Ca2+ yang berlebihan,

beberapa keluarga protein Bcl-2, dan lain-lain. Pada fase efektor, sel

29
berkomitmen untuk mati melalui pusat pengaturan apoptosis pada mitochondria

dan dilepaskan sitokrom c dari ruang intermembran mitochondrial permeability

transition pores (MPTP). Selanjutnya, terbentuk apoptosome. Pada fase terakhir,

yaitu fase degradasi, terjadi kondensasi kromatin, robeknya membran inti dan

fragmentasi DNA menjadi apoptotic bodies. Adanya phosphatidyl-serine pada

membran apoptotic bodies memicu fagositosis oleh makrofag atau sel sekitarnya

(Slemmer et al., 2004; Kasan, 2006).

Proses apoptosis dikelompokkan berdasarkan keterlibatan caspase.

Berdasarkan hal tersebut, apoptosis dikelompokkan menjadi dua, yaitu jalur yang

melibatkan caspase dan jalur yang tidak melibatkan caspase (Patarroyo and

Vargas, 2013). Selain istilah tersebut, dikenal juga dengan kematian sel

terprogram tipe I, tipe II dan tipe III. Proses yang melibatkan caspase

digolongkan dalam tipe I dan proses yang tidak melibatkan caspase digolongkan

menjadi tipe II dan III (Hongmei, 2012).

2.2.2.1.1 Jalur Apoptosis yang Melibatkan Caspase

Caspase merupakan efektor utama dari apoptosis. Pada kondisi sel

sehat, caspase berbentuk inaktif dengan aktivitas enzimatik rendah. Apabila

caspase teraktivasi, ia mengaktivasi caspase lainnya sehingga terjadi kaskade

yang berlangsung dengan cepat. Jalur aktivasi caspase yang dikenal adalah jalur

yang dimediasi reseptor kematian, jalur apoptosom, dan jalur yang dimediasi

stress yang melibatkan retikulum endoplasma. Tidak semua caspase terlibat

dalam apoptosis, selain terlibat dalam apoptosis (caspase 2, 3, 6, 7, 8, 9, 10) ada

pula caspase yang terlibat pada inflamasi (caspase 1, 4, 5, 12-L). Caspase yang

berperan pada apoptosis dikelompokkan menjadi inisiator (melakukan aktivasi

langsung dan menginisiasi proses proteolitik) dan caspase eksekutor atau

efektor (diaktivasi oleh molekul caspase lainnya). Caspase eksekutor dari

30
apoptosis antara lain adalah caspase 3, 6, dan 7 (Patarroyo and Vargas, 2013;

Czabotar et al., 2014).

Substrat dari caspase adalah sitoskeleton, berupa mikrofilamen (aktin,

miosin, spectrin, -actinin, gelsolin, dan filamin), mikrotubulus (protein Tau,

cytoplasmic dynein intermediate chain, dan p150), serta filamen intermediet

(vimentin, keratin, dan nuclear lamin). Proteolisis dari sitoskeleton ini diduga

berkontribusi pada bentuk bulat retraksi pada sel yang mengalami awal dari

apoptosis (Taylor et al., 2008; McAllister, 2011).

Jalur apoptosis yang melibatkan caspase terdiri dari dua jenis (gambar

2.8), yaitu jalur ekstrinsik (jalur kematian reseptor) dan jalur intrinsik (jalur

mitokondria). Jalur intrinsik dan jalur ekstrinsik mengalami proses yang sama di

tingkat caspase efektor (Czabotar et al., 2014).

2.2.2.1.1.1 Jalur Ekstrinsik

Jalur ekstrinsik, atau jalur reseptor kematian, merupakan salah satu jalur

yang melibatkan caspase. Proses ini dipicu oleh ligan terhadap reseptor

kematian yang mengaktivasi reseptor kematian pada permukaan sel, yaitu TNF-

receptor-1 (TNFR1), reseptor CD95/FasL, dan TNF-related apoptosis inducing

ligand receptor-1 dan -2 (TRAIL-R1/2) (Hongmei, 2012; Patarroyo and Vargas,

2013). Reseptor ini mengaktifkan caspase 8 melalui FAS-associated death

domain protein (FADD) dan TNFR-associated death domain protein (TRADD).

Selanjutnya, caspase 8 akan mengaktifkan caspase efektor di bawahnya

(caspase 3, 7 dan 6), sehingga terjadi apoptosis (gambar 2.7) (Nijhawan et al.,

2000; Slemmer et al., 2004; Czabotar et al., 2014).

31
Gambar 2.7 Jalur apoptosis yang melibatkan caspase. Apoptosis digolongkan
menjadi jalur intrinsik dan jalur ekstrinsik. Pada jalur intrinsik dimediasi melalui
mitokondria, sedangkan pada jalur ekstrinsik dimediasi oleh sinyal kematian pada
membran sel. Pada jalur intrinsik, famili Bcl-2 merupakan regulator utama. Bcl-2 insiator
pada apoptosis adalah grup dengan BH-3-only. Bax dan Bak adalah efektor pro
apoptosis, sedangkan Bcl-2 merupakan protein yang mendukung pertahanan hidup sel
(Czabotar et al., 2014).

Caspase 8 juga dapat mengaktifkan Bid menjadi truncated of Bid (tBid).

tBid dapat menghambat subfamili anti apoptosis serta memicu ekspresi Bax

sehingga dapat terbentuk MPTP yang melepaskan sitokrom c dari mitokondria

(gambar 2.7). Peran tBid terhadap famili Bcl-2 ini menyebabkan adanya

hubungan antara jalur intrinsik dan jalur ekstrinsik (Czabotar et al., 2014).

Jalur ekstrinsik juga dapat diaktivasi oleh dependence receptor,

diantaranya reseptor netrin. Reseptor ini dapat menginduksi apoptosis apabila

tidak ada stimulus yang dibutuhkan (reseptor tidak ditempati oleh ligan trofik,

atau berikatan dengan antitrofin). Sebaliknya, apoptosis dapat terhambat bila

reseptor ini ditempati oleh ligan trofik (Patarroyo and Vargas, 2013).

32
2.2.2.1.1.2 Jalur Intrinsik

Jalur intrinsik, atau jalur mitokondria atau jalur stress, terjadi akibat peran

permeabilitas mitokondria dalam kaskade intraseluler. Proses ini melibatkan

proteinprotein famili Bcl-2. (Nijhawan et al., 2000; Igney and Krammer, 2002;

Slemmer et al., 2004). Bcl-2 awalnya merupakan protein kedua yang ditemukan

pada limfoma dari berbagai protein lainnya, sehingga dinamakan B cell

lymphoma 2. Terdapat lebih dari 20 anggota dari famili Bcl-2 (Elmore, 2007). Gen

Bcl-2 memiliki lebih dari 230 kb dari DNA dan terdiri dari tiga exons yang mana

exon 2 dan sebagian kecil dari exon 3 mengkode protein. Protein Bcl-2

merupakan membran protein yang memiliki berat molekul 26 kDa terletak pada

bagian sitosolik dari amplop inti, retikulum endoplasma dan bagian luar membran

mitokondria dan sitoplasma (Igney and Krammer, 2002; Elmore, 2007). Pada

famili Bcl-2 dikenal adanya domain homolog Bcl-2 (BH). Konfigurasi BH domain

yang berbeda-beda menentukan subgrup dari famili Bcl-2. Subgrup antiapoptosis

memiliki domain BH-1 sampai BH-4, subgrup proapoptosis memiliki domain BH-1

sampai BH-3 saja, sedangkan subgrup inisiator hanya memiliki domain BH-3

(gambar 2.8) (Czabotar et al., 2014).

Ambang terjadinya proses jalur intrinsik apoptosis tergantung pada

interaksi tiga sub-grup dari Bcl-2 pada membran luar mitokondra (mitochondria

outer membrane) (gambar 2.8). Tiga sub-grup itu adalah (1) BH-3-only protein

yang menginisiasi apoptosis, (2) pelindung sel anti-apoptosis (misalnya protein

Bcl-2, Bcl-XL, Bcl-W, MCL1 (myeloid cell leukemia sequence 1), A1, dan Bcl-B),

dan (3) protein efektor pro-apoptosis (yaitu Bax, Bak (Bcl-2 antagonist/ killer),

dan Bok (Bcl-2-related ovarian killer protein) (Czabotar et al., 2014).

Apabila stress sitotoksik telah mengaktivasi BH-3-only protein hingga

melewati ambang apoptosis, Bax dan Bak membentuk oligomer yang membuat

membran luar mitokondria permeabel. Permeabilitas tersebut menyebabkan

33
pelepasan sitokrom c. Sitokrom c akan mengaktivasi caspase 9 dan APAF1.

Caspase 9 kemudian mengaktivasi caspase efektor (caspase 3, 6, dan 7)

(Czabotar et al., 2014). Sitokrom c yang dilepaskan dari mitokondria juga dapat

bertranslokasi menuju retikulum endoplasma untuk menghambat reseptor

inositol-(1,4,5)-triphosphate, sehingga terjadi peningkatan sinyal kalsium dan

pelepasan sitokrom C lebih banyak lagi dari mitokondria (Zhang et al., 2005).

Gambar 2.8 Skema sub-grup famili Bcl-2. Sub-grup itu adalah BH-3-only protein
yaitu inisiator apoptosis, anti-apoptosis dan protein efektor pro-apoptosis (Czabotar et al.,
2014).

BH-3-only protein diindusi secara transkripsi dan post translasi. BH-3-

only protein bekerja sebagai pro-apoptosis melalui netralisasi protein anti-

apoptosis atau langsung pada protein efektor pro-apoptosis. Yang termasuk pada

BH-3-only protein adalah Bad (Bcl-2 antagonist of cell death), NOXA, Bim, tBid,

dan PUMA. Bim, PUMA, dan tBid dapat menghambat semua anggota anti-

apoptosis, sedangkan Bad dan NOXA menghambat protein anti-apoptosis secara

spesifik. Bad menghambat Bcl-2, Bcl-XL, dan Bcl-W, sedangkan NOXA

menghambat Mcl-2 dan A1 (Czabotar et al., 2014). Bim dan tBid juga dapat

mengaktivasi Bax dan Bak (Stoica and Faden, 2010).

BH-3-only protein mengaktivasi sub-grup pro-apoptosis dengan berikatan

pada residu hidrofobik. Protein anti-apoptosis juga berikatan pada domain BH-3

dari Bax dan Bak yang teraktivasi untuk menghambat aktivitas pro-apoptosisnya.

34
Semua protein pro apoptosis, termasuk Bcl-2, dapat berikatan dengan Bax.

Sedangkan Bak hanya dapat diinaktivasi oleh Mcl1, A1, dan Bcl-X L. Interaksi

antara sub-grup famili Bcl-2 berlangsung secara kompetitif. Sehingga bila banyak

terjadi stress pada sel, BH-3-only protein akan dilepaskan dalam jumlah besar,

dan berikatan dengan Bcl-2 anti-apoptosis. Karena Bcl-2 anti-apoptosis sudah

banyak berikatan dengan BH-3-only protein, maka tidak ada yang menginaktivasi

efektor pro-apoptosis (Czabotar et al., 2014).

Pada sel sehat, Bak berada di dalam mitokondria dengan salah satu

domainnya menonjol pada membran luar mitokondria, sedangkan Bax terutama

berada pada sitosol. Bax akan berakumulasi pada mitokondria apabila terdapat

sinyal sitotoksik. (Czabotar et al., 2014).

Dalam mengatur saklar apoptosis, terdapat hipotesis mengenai interaksi

sub-grup Bcl-2 anti-apoptosis dan pro-apoptosis, yaitu model aktivasi langsung,

model aktivasi tidak langsung, dan model gabungan. Model interaksi tersebut

terdapat pada gambar 2.9. Model yang banyak dipakai adalah model gabungan

(unified model), dimana Bcl-2 selain berikatan dengan protein BH3-only domain

sehingga tidak berikatan dengan Bax, Bcl-2 juga menghambat Bax secara

langsung agar tidak meneruskan proses apoptosis (Czabotar et al., 2014).

Aksi pro-apotosis dari protein Bax tergantung pada pembentukan Bax

homodimer pada membran luar mitokondria. Efek antagonis dari protein Bcl-2

dilihat pada kemampuannya untuk membentuk heterodimer Bcl-2-Bax yang akan

mencegah pembentukan homodimer Bax (Tamm et al., 2001).

Bcl-2 dapat mencegah terjadinya apoptosis melalui beberapa hipotesis.

Bcl-2 diduga dapat mencegah peningkatan Ca2+ intraseluler dengan mencegah

terbentuknya MPTP sehingga mitokondria dapat menyimpan Ca2+. Hilangnya Bcl-

2 pada aksotomi menyebabkan hilangnya neuroregenerasi setelah aksotomi

(Raghupathi et al., 2003). Delesi gen Bcl-2 dapat menyebabkan berkurangnya

35
neuron motorik perifer, neuron sensoris dan neuron simpatis. Neuron yang

menunjukkan ekspresi Bcl-2 pada korteks setelah cedera kepala menunjukkan

morfologi yang normal. Selain itu, Bcl-2 diduga meregulasi respon terhadap

stress dengan berinteraksi dengan heat shock protein (HSP) (Zhang et al.,

2005). HSP70 memiliki fungsi sebagai chaperone dan membantu pelipatan

protein yang baru disintesis. HSP70 memiliki efek neuroproteksi dengan

berikatan dengan Apaf1 dan apoptosis induce factor (AIF) sehingga dapat

menurunkan apoptosis (Stoica and Faden, 2010).

Gambar 2.9 Interaksi famili Bcl-2 pro-apoptosis dan anti apoptosis. (a) Pada
model aktivasi langsung, tBid, Bim, dan PUMA berikatan langsung dengan efektor Bax
dan Bak. Bcl-2 terutama memecah BH-3-only protein; (b) pada model aktivasi tidak
langsung, protein anti-apoptosis menghambat semua Bax dan menunjukkan domain BH-
3 nya untuk berikatan dengan BH-3-only protein (c) model gabungan. Pada model
gabungan, proses pada model 1 dan 2 terjadi bergantian sesuai dengan situasinya
(Czabotar et al., 2014).

Faktor kunci dari regulasi apoptosis adalah tingginya rasio Bcl-2/Bax akan

membuat sel resisten terhadap stimulus apoptosis dan rendahnya rasio tersebut

akan memacu apoptosis (Vaskivuo et al., 2002; Zhang et al., 2005). Reostat

model dimerisasi Bax dengan Bcl-2 terdapat pada gambar 2.10 (Shacka and

Roth, 2006). Terdapat peningkatan ekspresi Bcl-2 pada neuron yang mampu

36
bertahan dari apoptosis, serta terdapat peningkatan ekspresi granula apoptotik

pada neuron dengan peningkatan ekspresi Bax (Raghupathi et al., 2003).

Gambar 2.10 Reostat model interaksi Bax dan Bcl-2. Semakin banyak sel yang
mengekspresikan Bax maka akan memicu terjadinya apoptosis, sedangkan bila semakin
banyak sel yang mengekspresikan Bcl-2 maka akan menghambat terjadinya apoptosis
(Shacka and Roth, 2006).

Selain diregulasi oleh famili Bcl-2, apoptosis juga diregulasi oleh protein

kinase. Terdapat aktivasi komponen jalur MAPK, antara lain extracellular

regulated kinase (ERK) 1/2, c-Jun N-terminal kinase (JNK), dan jalur p38

(Patarroyo and Vargas, 2013).

2.2.2.1.2 Jalur Apoptosis yang Tidak Melibatkan Caspase

Dengan pemberian inhibitor caspase, peneliti menemukan bahwa

apoptosis masih dapat berlangsung. Oleh karena itu, terdapat jalur apoptosis lain

yang tidak melibatkan caspase. Kematian sel terprogram tipe II ditunjukkan

dengan adanya autofagi dan membran vakuola ganda, sedangkan tipe III adalah

kematian sel tanpa terjadi kondensasi kromatin (Hongmei, 2012). Proses

apoptosis yang tidak melibatkan caspase (caspase-independent cell death)

dimulai dengan translokasi AIF dan endonuklease G (endoG) dari ruang

intermembran mitokondria menuju nukleus. Translokasi AIF menuju nukleus

menginduksi fragmentasi DNA dengan berat molekul besar (lebih dari 50

pasangan basa). Kondisi ini dapat terjadi apabila sel mengalami stress oksidatif,

37
misalnya pada cedera otak traumatik dan iskemia. Protein lain pada mitokondria

yang dapat menginduksi apotosis tanpa keterlibatan caspase adalah

endonucleas G, Htr2A/Omi, dan Smac/Diablo (Nijhawan et al., 2000; Slemmer et

al., 2004; Zhang et al., 2005; Stoica and Faden, 2010; Hongmei, 2012).

Cyclophilin A membantu translokasi AIF dari sitosol ke nukleus dan memberikan

efek kromatolitik dari AIF. Pada cedera otak traumatik, kematian melalui AIF

banyak terjadi pada area sentral kontusi (Stoica and Faden, 2010).
Aktivasi PARP pada dasarnya terjadi akibat deplesi ATP. Poly-ADP-ribose

polymerase (PARP) sebelumnya diketahui berkontribusi dalam nekrosis. Tetapi,

PARP juga terlibat dalam proses apoptosis yang tidak melibatkan caspase. Pada

kondisi cedera berat dimana tidak terdapat ATP, terjadi aktivasi PARP yang

menyebabkan bocornya membran sel dan kemudian menyebabkan nekrosis.

Tetapi pada kondisi kegagalan energi yang tidak komplit, misalnya pada daerah

perikontusional, PARP dapat berkontribusi dalam depolarisasi mitokondria,

sehingga melepaskan AIF dan memicu apoptosis yang tidak terkait

caspase.Caspase sendiri tidak teraktivasi karena ATP yang tersedia tidak cukup

untuk mengaktifkannya (Zhang et al., 2005).

Selain caspase, protease lain yang dapat menyebabkan apoptosis adalah

calpain dan granzyme. Protease ini sel spesifik dan jejas spesifik. Selain itu,

apoptosis juga dapat terjadi tanpa aktivasi caspase pada kondisi dimana terjadi

kerusakan organela (mitokondria, retikulum endoplasma, dan lisosom) akibat

peningkatan pelepasan kalsium, ROS, dan protein efektor (Patarroyo and

Vargas, 2013).
Beberapa oksidan diketahui dapat mempengaruhi proses apoptosis.

Pengaruh oksidan pada apoptosis tergantung konsentrasi zat tersebut. NO

dengan konsentrasi rendah akan menghambat caspase 3 dan menghambat

protein Bcl-2 pro-apoptosis, sehingga mencegah pengeluaran sitokrom C dari

38
ruang intermembran. Akan tetapi pada kondisi NO yang berlebihan dapat

mengiduksi terjadinya apoptosis (Nijhawan et al., 2000).

2.2.3 Autofagi

Selain apoptosis dan nekrosis, pada cedera otak traumatik juga dapat

terjadi autofagi. Pada autofagi terjadi degradasi komponen di dalam sel yang

dilakukan oleh lisosom (Schoch et al., 2012). Autofagi diatur oleh gen dari famili

Atg. Pada kondisi fisiologis, autofagi memliki efek neuroproteksi dengan

membentuk asam amino dan energi pada sel. Pada kondisi patologis, autofagi

diduga merupakan proses paralel pada cedera otak sekunder. Namun autofagi

dapat pula merupakan mekanisme kompensasi yang diinisiasi oleh inhibisi

apoptosis (Stoica and Faden, 2010).

2.3 Jalur Neuroproteksi Endogen setelah Cedera Kepala

Selain aktivasi dari apoptosis, juga terjadi transduksi sinyal intraseluler

pro-survival pada sel yang mengalami cedera kepala traumatik. Proses ini

diperantarai oleh jalur protein kinase B (PKB). PKB dapat menghambat apoptosis

secara tidak langsung melalui fosforilasi dan inaktivasi protein terkait apoptosis

misalnya Bad, caspase 8, dan caspase 9. PKB terfosforilasi tidak tampak pada

sel yang mengekspresikan terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end

labeling (TUNEL) setelah cedera kepala, sehingga secara tidak langsung hal ini

menunjukkan penghambatan kematian sel. PKB juga mendukung kehidupan sel

dengan meregulasi NFB dan ekspresi gen yang mempengaruhi respon ikatan

cyclic-AMP (cAMP) (Zhang et al., 2005).

Bcl-2 juga dapat meningkat setelah cedera kepala. Peningkatan ekspresi

Bcl-2 setelah cedera kepala lebih banyak ditemukan pada cairan serebrospinal

39
pasien yang dapat bertahan hidup dibandingkan yang meninggal dunia. Pasien

cedera kepala dengan peningkatan ekspresi Bax tetapi lebih sedikit Bcl-2

memiliki keluaran yang lebih buruk dibandingkan dengan pasien yang mengalami

peningkatan ekspresi keduanya (Zhang et al., 2005).

2.4 Dampak Klinis Cedera Otak Traumatik

Penderita cedera kepala dapat kembali normal tanpa gejala residual

maupun terjadi gejala menetap. Gangguan dapat terjadi pada fungsi kognisi,

memori, fungsi bahasa, artikulasi, kelemahan motoris, gangguan sensoris,

ataksia, dan tremor (Burton and Aisen, 2006). Pasien cedera kepala melalui

tahapan sindroma neurobehavior hingga tahap kembalinya kesadaran dan

orientasi. Pada cedera kepala ringan, pasien mengalami kebingungan sesaat

yang kembali seperti sedia kala dalam beberapa menit tanpa gejala gangguan

memori. Pasien dengan cedera kepala berat yang bertahan hidup kadang tidak

pernah sadar kembali dan jatuh pada kondisi vegetatif persisten (Capruso and

Levin, 2006).

Karena fungsi otak sangat kompleks, maka tiap cedera otak dapat

menunjukkan gejala yang berbeda. Gejala tersebut dapat langsung muncul,

dapat pula baru muncul hingga beberapa hari ataupun beberapa minggu

kemudian (Capruso and Levin, 2006). Berdasarkan Centers for Disease Control

and Prevention (CDC), gangguan yang mungkin muncul akibat cedera kepala

adalah (1) gangguan kognisi (2) gangguan kekuatan motoris, koordinasi, dan

keseimbangan, (3) gangguan sensoris taktil, dan sensoris khusus seperti

pengelihatan, (4) gangguan kejang (epilepsi) (Burton and Aisen, 2006). Gejala

post konkusi lainnya adalah nyeri kepala, kelelahan, dizzy, tinitus, gangguan

tidur, depresi, cemas, gangguan kognisi, gangguan emosional, serta gangguan

somatis lainnya (Capruso and Levin, 2006).

40
2.4.1 Dampak Jangka Panjang Cedera Otak Traumatik

Terdapat konsekuensi neuropsikiatri jangka panjang akibat cedera otak

traumatik. Cedera otak traumatik meningkatkan risiko terjadinya Alzheimer di

kemudian hari. Kerusakan akson pada cedera otak traumatik menyebabkan

akumulasi protein abnormal yang beragregasi pada sel dan parenkim. Pada

binatang coba, beberapa jam setelah cedera otak traumatik, terdapat akumulasi

amyloid prekursor protein pada akson dan badan sel yang rusak. Hal itu

berasosiasi dengan peningkatan amyloid (A). Pada pasien dengan gangguan

neurodegeneratif setelah cedera otak traumatik juga berasosiasi dengan adanya

deposit alel apolipoprotein E (APOE) 4, yang juga merupakan faktor risiko

Alzheimer. Polimorfisme pada gen yang mengkode neprilysin, yaitu enzim yang

menghancurkan A, juga mempengaruhi degradasi dan pembersihan A seteleh

cedera otak traumatik (DeKosky et al., 2013).

2.4.2 Area Otak yang Rentan Terganggu pada Cedera Otak Traumatik

Area yang paling sensitif mengalami trauma mekanis pada manusia adalah

pada batang otak terutama mecencephalon, lobus temporalis, dan frontalis.

Mesencephalon mengalami gangguan melalui mekanisme shearing. Sedangkan

lobus temporalis dan frontalis sering mengalami gangguan karena benturan otak

dengan penonjolan tulang (sphenoid ridge), struktur sulcus dan girusnya ireguler,

jarak terjauh dari pusat gravitasi otak, serta sudut rotasi akibat benturan otak.

Selain itu hippocampus pada lobus temporal merupakan area yang paling sensitif

terhadap hipoksia dan iskemi. Kontusi pada lobus temporalis anterior dapat

mengganggu fungsi hipokampus dan sekitarnya yang berfungsi untuk

penyimpanan dan mengingat kembali kejadian yang masih baru. Hipokampus

41
juga rentan mengalami kerusakan akibat pelepasan asam amino eksitotoksik.

Lobus parietal dan occipital biasanya lebih jarang mengalami kelainan. Daerah

yang rentan mengalami diffuse axonal injury dan apoptosis antara lain korteks

serebri, hipokampus, thalamus, substansia nigra, serta subkortikal nigra (Burton

and Aisen, 2006; Capruso and Levin, 2006).

Batang otak terletak pada dasar dari otak, berfungsi untuk mengatur

arousal, fungsi otonomik, dan fungsi nervus kranialis. Mesencephalon,

mesotemporal dan regio temporal merupakan area yang berpengaruh pada

atensi, memori jangka pendek dan mengatur emosi. Trauma yang mengenai

daerah ini dapat menyebabkan disorientasi, frustasi, dan marah. Selain berfungsi

untuk memori dan fungsi emosi, lobus temporal juga mengatur pemahaman

berbahasa dan jaras visual. Lobus frontalis merupakan daerah yang sering

mengalami cedera karena ukurannya besar dan terletak di depan kranium.

Gangguan pada lobus frontal bagian anterior menyebabkan gangguan dalam

judgement, meningkatkan impulsitas, dan dapat menyebabkan apatis (Burton

and Aisen, 2006).

Gambar 2.11 Korteks yang rentan terganggu pada trauma kepala pada
manusia. Lobus frontal dan temporal terutama pada daerah basal merupakan lokasi
yang rentan mengalami gangguan akibat cedera kepala, selain karena rentan mengalami
benturan, hippocampus pada lobus temporal juga rentan mengalami iskemia (Burton and
Aisen, 2006).

42
2.5 Pemeriksaan Neurologis in Vivo pada Tikus

2.5.1 Derajat Keparahan Neurologi pada Cedera Otak Traumatik in Vivo

Apabila keparahan cedera kepala pada manusia digunakan GCS

(Aritonang, 2007), maka untuk menilai keparahan cedera otak tertutup pada

binatang coba adalah dengan menggunakan NSS (Xiong et al., 2014). NSS

terdiri dari 8 parameter klinis yang mencakup fungsi motorik, keseimbangan,

kesadaran dan perilaku fisiologis seperti digambarkan pada gambar 2.14.

(Albert-Weienberger et al., 2012). Fungsi motorik diatur oleh sistem neuron

kompleks yang berawal dari korteks serebri hingga sistem muskuloskeletal

dengan adanya hubungan antara korteks sensorimotor, nukleus subkorteks,

serebelum, dan batang otak (Xiong et al., 2014).

Gambar 2.12 Pemeriksaan NSS. NSS digunakan untuk memeriksa keparahan defisit
neurologis pada tikus. (a-c) tes keluar dari lingkaran merupakan tes untuk menilai rasa
ingin tahu binatang coba. (d-f) tes berjalan pada balok (g-h) tes keseimbangan pada stik
silinder (Flierl et al., 2009).

43
 Tabel 2.2 NSS
Parameter Deskripsi
1. Keluar dari Tikus diletakkan pada platform
lingkaran lingkaran dengan diameter 30 cm
dan dihitung kemampuan keluar
dari papan dalam 2 menit
2. Perilaku mencari Tikus diletakkan pada papan dan
diamati adanya perilaku eksprorasi
dan mengendus pada papan
3. Monoparesis atau Terdapat gangguan dalam
hemiparesis menggerakkan satu (monoparesis)
atau dua anggota gerak
(hemiparesis). Pada normalnya,
tikus dapat menggenggam forsep
yang disentuhkan pada telapak
anggota gerak dan memegangnya
4. Berjalan lurus Tikus diletakkan pada permukaan
datar dan dilihat cara jalannya untuk
menilai kesadaran, inisisasi dan
kemampuan motorisnya
5. Refleks kejut Tikus dikejutkan dengan suara
tepukan, dan tampak refleks kejut
dengan melompat atau gerakan
menggerenyet
6. Balok Tikus diletakkan pada papan
keseimbangan berukuran 7 mm x 7 mm dan
diharapkan dapat seimbang pada
papan selama 10 detik
7. Berjalan pada balok Tes ini bertujuan untuk menilai
koordinasi motorik dan
keseimbangan. Terdiri dari papan
sepanjang 30 cm dengan lebar 3
cm, 2 cm, 1 cm
8. Keseimbangan Menilai keseimbangan dan
pada tongkat kekuatan genggaman dengan
silinder menggenggam stik dengan
diameter 3mm selama 30 detik
(Wu et al., 2010)
Skor
0 = tikus dapat keluar dalam 2
menit
1 = tikus tidak keluar lingkaran
0 = terdapat perilaku mencari
1 = tidak ada perilaku mencari
0 = tikus dapat menggenggam
forsep
1 = tikus tidak dapat
menggenggam forsep
0 = tikus berjalan lurus
1 = tikus tidak berjalan lurus, baik
akibat kurang inisiasi atau
menyeret setidaknya satu anggota
gerak
0 = terdapat refleks kejut
1 = tidak ada respon
0 = tikus dapat seimbang
1 = tikus gagal seimbang
0 = tikus dapat melalui ketiga
balok
1 = tikus dapat melalui balok 3 cm
dan 2 cm
2 = tikus dapat melalui balok 3 cm
saja
3 = tikus tidak dapat melalui balok
0 = tikus dapat bertahan pada stik
silinder setidaknya pada 2
anggota gerak
1 = tikus tidak dapat bertahan

Tikus tanpa defisit neurologis memiliki skor 0 dan makin berat defisit

neurologis, skor semakin meningkat dengan skor maksimal 10. Parameter

tersebut dijelaskan pada tabel 2.2. (Wu et al., 2010; Albert-Weienberger et al.,

2012). NSS yang dilakukan 1 jam setelah cedera otak tertutup merupakan

prediktor keluaran pada kemudian hari. Cedera fatal dan nyaris fatal didapatkan

pada tikus dengan NSS 9-10, cedera berat pada NSS 7-8, cedera sedang pada

NSS 5-6, dan cedera ringan pada tikus dengan NSS <5 (Wu et al., 2010). NSS

secara signifikan berkurang pada hari ketiga dan ketujuh setelah trauma (Albert-

Weienberger et al., 2012). Pemeriksaan fungsi sensorimotor lainnya antara lain

44
tes silinder, tes rotarod, tes kekuatan genggaman, tes kemampuan meraih kaki

depan dan tangga (Xiong et al., 2014).

2.5.2 Pemeriksaan Kognisi

Pemeriksaan kognisi untuk tikus antara lain dengan Morriz water maze,

freezing response test, memory task, dan tes pengenalan kembali obyek.

Penilaian gangguan kognisi banyak dilakukan pada binatang model perkusi

fluida, cortical controlled impact, dan model ledakan (Xiong et al., 2014).

2.5.3 Pemeriksaan Perilaku

Gangguan perilaku yang sering muncul pada cedera otak adalah

gangguan kecemasan dan depresi. Tes untuk menilai kecemasan antara lain

elevated-plus maze, aktivitas emosional dan eksplorasi, serta open field test. Tes

yang dilaporkan untuk menilai gejala seperti depresi adalah forced swimming

test (Xiong et al., 2014).

2.6 Model Cedera Otak in Vivo

Binatang model digunakan untuk lebih memahami proses cedera otak

sekunder sehingga dapat diberikan pengobatan neuroprotektif yang efektif.

Metode yang banyak digunakan sebagai model cedera otak antara lain model

penjatuhan beban, cedera perkusi fluida, dan cedera kontusi korteks. Tidak

satupun model yang dapat mencakup semua spektrum kejadian cedera

traumatik dan masing-masing memiliki kelebihan dan kekurangan (Albert-

Weissenberger and Sirn, 2010).

Metode penjatuhan beban merupakan model cedera otak yang

menggunakan gaya gravitasi dari beban yang dijatuhkan untuk menghasilkan

cedera otak fokal dan difus. Tanda khas dari cedera otak yang disebabkan

45
karena cedera akson difus adalah adanya gangguan aksonal yang disebabkan

karena gaya robekan, sehingga terjadi edema aksonal, retraksi bola aksoplasmik

ovoid, dan ekspresi beta amiloid (Albert-Weienberger et al., 2012).

Kelemahan dari model penjatuhan beban adalah tingginya mortalitas

karena apnea. Hal tersebut diatasi dengan bantuan respirasi dan penggunaan

binatang dengan berat dan usia tertentu (Albert-Weissenberger and Sirn, 2010).

Selain itu, juga berisiko terjadi benturan kedua akibat benturan pada tengkorak

(Cernak, 2005). Model penjatuhan beban pun memiliki beberapa cara,

tergantung efek yang ingin didapatkan. Beban dapat dijatuhkan pada tengkorak

yang terbuka maupun benturan langsung pada pada duramater. Apabila beban

dijatuhkan pada tengkorak terbuka, digunakan pelapis silikon untuk mengurangi

risiko fraktur tengkorak. Untuk menghasilkan cedera fokal, tempat benturan

harus tidak fleksibel untuk meminimalisir pemborosan energi. Untuk menginduksi

cedera otak difus, benturan harus terdistribusi merata pada permukaan

tengkorak, sehingga digunakan alas yang fleksibel sehingga kepala dapat

berakselerasi (misalnya dengan alas busa atau dengan pegas elastis. Untuk

menghasilkan derajat keparahan cedera yang berbeda digunakan beban dan

ketinggian penjatuhan yang berbeda (Albert-Weissenberger and Sirn, 2010).

Beberapa model penjatuhan beban antara lain, model penjatuhan beban Feeney,

model model penjatuhan beban Shohami, model penjatuhan beban Marmarou,

model Maryland dan model penjatuhan beban Albert-Weienberger (Albert-

Weissenberger and Sirn, 2010; Xiong et al., 2014).

Metode penjatuhan beban juga sebelumnya dilakukan di Universitas

Brawijaya oleh Riawan et al. (2015). Scalp tikus diinsisi, kemudian dijatuhkan

beban sebesar 45 mg dengan diameter 4 mm dengan sudut 90 derajat dari

ketinggian 100 cm. Setelah penjatuhan beban, scalp dijahit kembali.

Pada model cedera otak dengan penjatuhan beban terjadi perubahan

metabolisme energi pada otak, yaitu penurunan ATP, GTP, dan enzim nikotinik

46
nicotinamide adenine dinucleotide (NAD), nicotinamide adenine dinucleotide

phosphate (NADP), serta penurunan N-acetylaspartate (penanda disfungsi dan

kerusakan neuron) yang terjadi sejak 2 jam setelah cedera. Selain itu juga

didapatkan penurunan konsentrasi magnesium, penurunan rasio fosforilasi

sitostolik, dan peningkatan fosforilasi oksidatif mitokondria. Selain itu, pada

model cedera ini juga didapatkan peningkatan mediator calpain dan caspase,

sehingga model dapat menginduksi kematian neuron baik apoptosis, maupun

nekrosis (Riawan et al., 2015).

Selain model penjatuhan beban, terdapat model cedera perkusi fluida

(fluid percussion injury), model benturan korteks terkontrol, model kriolesi, model

cedera ledakan, serta model cedera penetrasi. Masing-masing model memiliki

kelebihan dan kekurangannya serta dipakai berdasarkan bentuk cedera yang

akan diteliti (Xiong, Mahmood and Chopp, 2014).

2.7 Anatomi Otak Rattus norvegicus Galur Wistar

Bregma dan lambda merupakan bagian dari tikus yang penting untuk

menentukan posisi otak pada tikus. Jarak lambda dan bregma pada tikus dengan

berat sekitar 180 gram adalah 7 mm. Jarak lambda-bregma pada tikus dengan

berat 290 gram adalah 9 mm. Posisi mid coronal berada pada 3 mm di depan

lambda. Korteks serebri berada pada bagian superior dari otak (Paxinos and

Watson, 2006). Pemetaan korteks sensorimotor berada pada bagian depan

serebri dengan diameter 7 mm dengan pusat 1 mm anterior dari bregma (Jung et

al., 2013). Korteks motorik primer (M1) tampak paling luas pada potongan

koronal otak tikus 2,2 mm anterior dari bregma (Paxinos and Watson, 2006).

47
Gambar 2.13 Anatomi otak Rattus norvegicus galur wistar. Gambar di atas
adalah penampang lateral otak Rattus norvegicus galur wistar dengan berat 290 gram.
Cortex cerebri berada pada superior dari otak. Mid coronal berada pada 3 mm anterior
dari Lambda (Paxinos and Watson, 2006).

Gambar 2.14 Anatomi otak Rattus norvegicus galur wistar. Penampang

koronal otak Rattus norvegicus galur wistar pada potongan 2,2 mm anterior dari bregma.
M1 merupakan area motorik primer. (Paxinos dan Watson, 2006)

48
Gambar 2.15 Anatomi tulang kranium Rattus norvegicus galur wistar.
Gambar di atas adalah penampang tulang kranium Rattus norvegicus galur wistar
dengan berat 290 gram dari superior (atas) dan lateral (bawah). Bregma dan Lambda
merupakan struktur penting dalam menentukan posisi otak (Paxinos and Watson, 1997).

Gambar 2.16 Pemetaan struktur fungsional otak tikus dilihat dari vertex.
Lingkaran dengan diameter 7 mm dengan pusat 1 mm anterior dari bregma dan 3,5 mm
lateral kanan dari garis tengah merepresentasikan korteks sensorimotor. Titik 0 dari
sumbu horizontal menunjukkan posisi bregma dan titik 0 pada sumbu vertikal
menunjukkan posisi garis tengah (Jung et al., 2013).

49
2.8 Histologi dan Histopatologi Korteks Otak

2.8.1 Histologi Korteks Otak

Lapisan korteks otak terdiri dari enam lapisan. Lapisan terluar adalah

lapisan molekularis, diikuti ke arah profundus, yaitu lapisan granularis eksterna,

lapisan piramidalis eksterna, lapisan granularis interna, lapisan piramidalis

interna, dan lapisan multiformis. Lapisan molekularis sedikit mengandung sel.

Lapisan granularis terutama terdiri dari sel granularis yang merupakan neuron

GABA-ergik. Lapisan piramidalis eksterna dari sel piramidalis yang merupakan

sel glutamat-ergik. Sel piramidalis pada lapisan piramidalis eksterna berukuran

lebih kecil dibandingkan pada lapisan piramidalis interna. Sel piramidalis yang

berukuran besar pada lapisan piramidalis interna disebut sebagai sel betz.

Lapisan multiformis terdiri dari sel yang polimorfik (Baehr and Frotscher, 2012).

Gambar 2.17 Lapisan korteks serebri. Korteks serebri terdiri dari enam lapisan,
yaitu lapisan molekuler pada paling luar, disusul lapisan granularis eksterna, piramidalis
eksterna, granularis interna, piramidalis interna, serta lapisan multiformis (Baehr and
Frotscher, 2012).

50
Gambar 2.18 Mikroanatomi korteks serebri. A: Dengan pewarnaan hematoxylin
eosin, pada korteks serebri didapatkan neuron dan sel glia. Oligodendrosit tampak
sebagai inti berwarna gelap (panah kecil). Astrosit tampak sebagai inti yang lebih terang
dengan ukuran yang lebih besar (panah besar). Sel yang berukuran lebih besar
merupakan neuron. Area di sekeliling neuron adalah neuropil (asteriks) yang merupakan
dendrit, akson dan sinaps. B: Pada gambar skematik sel di korteks serebri, tampak
neuron (berwarna hijau). Astrosit (berwarna biru) berhubungan dengan neuron, pembuluh
darah, dan meningen. Oligodendrosit juga memiliki juluran ke arah akson neuron dimana
ujungnya membentuk myelin yang menyelubungi akson neuron (Valdevelde et al., 2012).

Sel pada sistem saraf pusat terdiri dari neuron dan glia. Neuron

merupakan sel dengan ukuran yang terbesar dan dapat dibedakan melalui

kandungan badan Nissl pada sitoplasmanya. Badan Nissl adalah agregasi dari

retikulum endoplasma kasar yang mengandung ribosom. Neuropil adalah area di

sekitar neuron yang dibentuk oleh prosesus dari dendrit dan akson serta sinaps.

Neuropil tidak tampak pada pewarnaan HE. Sel glia terdiri dari oligodendrosit,

astrosit dan mikroglia. Sel glia ini berjumlah hingga sepuluh kali lipat dari jumlah

neuron. Pada pewarnaan HE, sel glia ini hanya tampak nukleusnya saja.

Oligodendrosit memiliki inti kecil, bulat, dan hiperkromatin, serupa dengan

limfosit. Prosesus dari oligodendrosit membentuk lapisan myelin. Lokasi

oligodendrosit banyak terdapat pada subkorteks. Astrosit meiliki nukleus dengan

bentuk bulat lonjong dengan ukuran yang lebih besar, lebih ireguler, dan lebih

pucat dibandingkan dengan oligodendrosit. Prosesus astrosit mengisi ruang di

neuropil, serta membentuk lapisan kontinyu pada superfisial piamater (glial

limiting membrane). Mikroglia merupakan sel yang berukuran kecil, tipis, dengan

sel yang elongasi tanpa sitoplasma yang tampak, pada korteks dan subkorteks.

51
Mikroglia merupakan 15% dari sel glia. Korteks serebri memiliki vaskularisasi

yang tinggi. Pembuluh darah pada korteks dan subkorteks terdiri dari sel endotel

dengan tight junction yang dilapisi oleh membran basalis dan dikelilingi oleh

perisit dan ujung dari prosesus astrosit. Struktur-struktur tersebut disebut dengan

sawar darah otak (blood-brain barrier) (Valdevelde et al., 2012).

2.8.2 Histolopatologi Otak dengan Trauma Kepala Tumpul

Gambaran histologi pada tikus dengan cedera otak dengan model

penjatuhan beban adalah adanya perdarahan petekial dan edema pada korteks

bilateral dan batang otak. Lesi histologis ditemukan pada neuron, glia, dan

mikrovaskuler (dos Santos Silva et al., 2012).

A. B.
Gambar 2.19 Gambaran histologi otak cedera pada tikus model penjatuhan
beban. Tampak neuron mengalami edema sitotoksik (A), serta jarak antar neuron
melebar pada neuropil (B) (dos Santos Silva et al., 2012).

Imunoreaktivitas Bcl-2 pada otak tikus terbatas pada area-area tertentu,

yaitu hipokampus, cerebellum, batang otak, striatum, thalamus dan korteks

serebri. Ekspresi Bcl-2 lebih banyak pada neuron cornu ammon (CA)-3

dibanding CA-1 hipokampus. Pada cerebellum, Bcl-2 lebih sedikit terekspresi

pada sel purkinye dibandingkan pada golgi II yang relatif resisten terhadap

iskemia. Nukleus neuron pada brainstem mengekspresikan Bcl-2 dengan kuat.

Hal itu mendukung bahwa brainstem merupakan area paling resisten terhadap

iskemia. Bcl-2 juga terdeteksi terbatas pada neuron di striatum, thalamus, dan

korteks serebri lapisan 3 dan 4 (lapisan piramidalis eksterna dan lapisan

52
granularis interna). Berbeda dengan Bcl-2, Bax ditemukan terekspresi pada

hampir semua neuron (Krajewski et al., 1995).

2.8.3 Sawar Darah Otak

Gambar 2.20 Diagram sawar darah otak. A.Skema yang menunjukkan sel endotel
kapiler, perisit dan astrosit serta tight juction yang membentuk sawar darah otak. B. Skema yang
menunjukkan lokasi transporter dan carrier pada sawar darah otak (Faria et al., 2012).

Sawar darah otak dibentuk oleh tiga jenis sel, yaitu endotel, astrosit, dan

perisit. Suatu zat dapat menembus sawar darah otak melalui tiga mekanisme,

yaitu (1) pasif, (2) dengan karier, dan (3) membutuhkan protein transport. Proses

pasif terjadi apabila suatu zat berukuran kecil, larut lemak, tidak terionisasi dan

terdapat perbedaan konsentrasi antara dua membran. Proses pasif terjadi tanpa

membutuhkan energi. Transport dengan karier mer membutuhkan satu atau lebih

transporter dan terdapat influks atau efluks dari zat. Transport ini bersifat saturasi

dan spesifik, serta melalui cara: (1) uniport (transport satu molekul), (2) simport

(transport dua atau lenih molekul atau ion pada arah yang sama), atau (3)

antiport (transport dua atau lenih molekul atau ion pada arah yang berlawanan).

Transport lain adalah dengan endositosis, yaitu terjadi dengan atau tanpa

interaksi membran reseptor dan terjadi untuk molekul besar dan protein. Bentuk

endositosis antara lain berupa fagositosis, pinositosis, dan potositosis. Karena

tight junction bersifat relatif tidak permeabel, maka sistem transport menjadi

penting dalam memindahkan nutrien, vitamin, dan obat-obatan serta membatasi

masuknya zat-zat yang bebahaya untuk otak (Faria et al., 2012).

53
2.9 Catechins

Polifenol adalah bahan biologi aktif yang berasal dari tanaman dan

tergolong dalam non nutrien. Asupan polifenol sekitar 1 gram sehari dapat

bermanfaat dalam penangkap radikal bebas pada manusia. Pada minuman teh

hijau kemasan, didapatkan konsentrasi catechins adalah 3-60 mg per 250 mL.

Sedangkan pada satu cangkir teh hijau yang diseduh konvensional didapatkan

catechins sebanyak 400-500 mg (Araya-Farias et al., 2014).

Banyak penelitian yang menyebutkan manfaat polifenol dalam

pencegahan penyakit, menurunkan mortalitas akibat penyakit kardiovaskuler dan

neoplasma, serta dapat menghambat progresivitas penyakit degeneratif (Gramza

et al., 2005). Penelitan pada binatang model cedera otak traumatik menunjukkan

efek yang baik, terutama pada resveratrol dan kurkumin (flavonoid) (Sutherland

et al., 2006; Erdman et al., 2011).

Catechins merupakan kelompok flavonoid yang banyak didapatkan pada

daun teh (Mandel and Youdim, 2004; Gramza et al., 2005). Teh adalah tanaman

yang berasal dari famili Theaceae spesies Camellia sinensis. Kelompok polifenol

yang paling banyak didapatkan pada teh adalah flavan-3-ols atau catechins.

Selain catechins, teh juga mengandung polifenol theaflavins, thearubigenes, dan

flavonols (Gramza et al., 2005; Sutherland et al., 2006).

2.9.1 Kandungan Bioaktif Catechins

Camellia sinensis mengandung catechins hingga 25-35% (Sutherland et

al., 2006). Klon GMB-4 Camellia sinensis memiliki kadar catechins 14-16%

(Ratnawati et al., 2009). Komponen lain pada teh adalah protein (15% berat

kering), karbohidrat (5-7% berat kering), mineral (5% berat kering), serta sedikit

komponen lemak, sterol, vitamin, xanthic base (caffein), pigmen, dan bahan

volatil (Chacko et al., 2010).

Catechins adalah derivat dari flavan dan ditandai dengan derajat oksidasi

pada cincin heterosiklik terbesar dan bersifat larut air. Bentuk terbanyak dari

54
catechins adalah ester gallic acid, yaitu (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG).

Selain itu juga didapatkan (-)-epigallocatechin (EGC), (-)-epicatechin (EC), (+)-

catechin (C), (-)-gallocatechin (GC), dan (-)-epicatechin-3-gallate (ECG) (Mandel

dan Youdin, 2004). Catechins yang termetilasi antara lain (-)-epigallocatechin-3-

(3-O-methylgallate) dan (-)-epigallocatechin-3-(4-O-methylgallate). Camellia

sinensis merupakan satu-satunya tanaman yang mengandung EGCG (Gramza

et al., 2005; Sutherland et al., 2006).

Kandungan EGCG dari minuman teh hijau kemasan bervariasi hingga

50%. Perbedaan kandungan EGCG dapat disebabkan karena perbedaan

komposisi polifenol pada daun teh, maupun proses pembuatan minuman.

Kandungan catechins didapatkan lebih tinggi pada daun teh yang lebih muda

(Gramza et al., 2005).

2.9.2 Ekstraksi Catechins

Teh hijau dikelompokkan menjadi tiga tipe berdasarkan perbedaan derajat

fermentasinya, yaitu teh hijau (non fermentasi), oolong (semi fermentasi), dan teh

hitam (fermentasi). Terdapat empat tahap dalam memproses teh. Teh awalnya

dipetik dan dibiarkan sedikit dikeringkan, lalu dipanggang untuk menginaktivasi

enzim enzim polyphenol oxydase dan glycosidase dan menghentikan proses

fermentasi. Kemudian daun teh digulung, dikeringkan dan dikemas. Pembuatan

teh hitam lebih rumit, karena melalui fermentasi berulang dan kemudian

dipanggang hingga berwarna coklat kehitaman. Teh oolong mengalami

fermentasi lebih singkat daripada teh hitam. Proses oksidasi teh menghasilkan

tannins. Tannins terdiri dari fenolic acid, gallic acid, poluols, dan polimer partikel

flavonoid sederhana (Gramza et al., 2005).

Selama fermentasi, catechins mengalami oksidasi oleh enzim polyphenol

oxidase menjadi quinones dan mengalami polimerisasi menjadi struktur yang

lebih kompleks, yaitu theaflavins, thearubigens, serta molekul dengan massa

55
yang lebih besar. Theaflavins dan kandungan gallate-nya terjadi karena

kondensasi EC dan EGC. Fermentasi menurunkan kadar catechins dan

meningkatkan kadar gallic acid (Gramza et al., 2005).

Catechins diekstrak dengan menggunakan etil asetat (Yashin et al.,

2012). Kualitas terbaik didapatkan dengan melakukan ekstraksi pada suhu 77-

800C. Molekul EC dan EGC yang berukuran lebih kecil diekstraksi lebih cepat

dibandingkan dengan EGCG dan ECG. Peningkatan pH juga dapat menurunkan

kadar catechins, namun meningkatkan kadar caffeine. Peningkatan kadar

caffeine disebabkan karena adanya degradasi theaflavins dari agregat caffeine-

theaflavin (Gramza et al., 2005).

2.9.3 Farmakologi Catechins

2.9.3.1 Farmakokinetik Catechins

2.9.3.1.1 Absorbsi Catechins

Tidak semua polifenol diabsorbsi pada efisiensi yang sama. Flavonoid

aglycone (tidak mengandung gula) dapat diabsorbsi pada usus kecil Tetapi,

kebanyakan flavonoid berada dalam bentuk glikosida, ester dan polimer

sehingga tidak dapat diabsorbsi langsung. Untuk dapat dicerna, flavonoid

mengalami hidrolisis oleh enzim lambung atau flora dalam saluran cerna.

Polifenol mengalami konjugasi pertama pada usus kecil dan konjugasi berikutnya

terjadi di liver. Pada saat konjugasi terjadi metilasi, sulfasi, dan glukoronidasi

(Yashin et al., 2012). Galloylasi pada catechins menurunkan absorbsinya

(Manach et al., 2005).

Catechins yang tidak diserap pada usus kecil mencapai usus besar. Pada

usus besar, catechins didegradasi oleh enzim bakteri menjadi molekul yang lebih

kecil, contohnya asam oxiaromatik, sehingga dapat diabsorbsi. Metabolit dari

mikroba antara lain 5-(3,4,5-trihydroxyphenyl) valerolactone, 5-(3,4-

dihydroxyphenyl) valerolactone, dan 5-(3,5-dihydroxyphenyl) valerolactone

56
dalam bentuk terkonjugasi. Metabolit ini muncul lebih lambat pada plasma dan

memiliki waktu paruh panjang, sehingga dapat meningkatkan durasi kerja

catechins (Yashin et al., 2012).

2.9.3.1.2 Distribusi Catechins

Catechins memiliki berat molekul yang cukup besar (antara 300-450

g/mol), sehingga bioavailabilitasnya rendah. Dari 100-200 mg catechins yang

dikonsumsi, kadar yang berada pada plasma tidak melebihi 1 M. Konsentrasi

total catechins, baik yang bebas maupun terkonjugasi, tidak melebihi 2-3 M.

Pada manusia, hanya 0,2-2% catechins yang dikonsumsi yang terdeteksi pada

plasma dengan menggunakan high-performance liquid chromatography (HPLC).

Pada penelitan lain, EGCG terdeteksi sebesar 6 mg di darah pada konsumsi

sebanyak 82 mg (kadar kurang dari 7%) (Yashin et al., 2012).

Karena mengalami biokonversi di usus, catechins pada plasma dan urine

terdapat pada bentuk konjugat. Beberapa konjugat memiliki substituen hidroksil

yang intak. Hidroksil tersebut dapat menangkap radikal bebas superoksida dan

efisiensinya tetap tinggi. Oleh karena itu, meskipun bioavailabilitasnya rendah,

catechins dapat memiliki efek yang luar biasa dalam banyak penyakit (Yashin et

al., 2012).

Karena merupakan antioksidan, bioavailabilitas catechins dapat

ditentukan melalui peningkatan aktivitas antioksidan pada plasma darah setelah

konsumsi dan menilai penanda penurunan stress oksidatif. Penanda stress

oksidatif yang digunakan antara lain 8-hydroxydeoxyguanosine (8-OhdG), derivat

tirosin, MDA, F2-isoprostane, dan phosphatidylcholine hydroperoxide ().

Selain itu, kadar catechins dihitung pada cairan tubuh dan organ-organ tertentu

1-2 jam setelah konsumsi (Yashin et al., 2012). Jumlah EGCG yang diukur pada

organ-organ penting, termasuk otak, berkisar sepersepuluh dari kadar EGCG

57
darah (Smith, 2011). C ditemukan terakumulasi pada korteks serebri dan

hipothalamus pada binatang coba tikus (Huang et al., 2011).

2.9.3.1.2.1 Masuknya Catechins pada Sawar Darah Otak

Salah satu penentu bioavailabilitas flavonoid di otak adalah

kemampuannya menembus sawar darah otak. Catechins dapat menembus blood

brain barrier, terutama yang bersifat non polar dan lipofilik. Namun, terdapat pula

catechins yang mengalami glukoronidasi dan polar yang dapat menembus sawar

darah otak. Masuknya catechins ke dalam otak juga dapat dimodulasi oleh

transporter efluks pada sawar darah otak, misalnya melalui P-glycoprotein

(Farooqui, 2012).
Terdapat beberapa model sel in vitro untuk meneliti transfer flavonoid

melalui sawar darah otak. Beberapa model tersebut antara lain ECV 304

(merepresentasikan sisi perifer sawar darah otak) yang di ko-kultur dengan sel

glioma C6 (merepresentasikan sisi sistem saraf pusat), bEND5, dan RBE4.

Berdasarkan model ini, flavanoid dapat menembus lapisan sel endotel. Flavanoid

yang termetabolisir, yaitu mengalami glukoronidasi derivat O-metilasi, juga dapat

menembus sel endotel. Tampaknya, sel-sel ini dapat mendekonjugasi derivat

glukoronidasi menjadi bentuk aglikon sehingga dapat memasuki sel glia dan

akhirnya masuk otak. Isomer C dan EC ditemukan dapat menembus sawar

darah otak dengan perbedaan signifikan. Diduga terdapat proses stereo-selektif

dalam masuknya flavanol ke dalam sawar darah otak karena perbedaan efluks

dari sel. Ditemukan konjugasi asam glukoronat dari C dan EC pada sisi

basolateral, menunjukkan sel dapat memetabolisme zat tersebut. hCMEC/D3

cell line, yaitu endotel mikrovesel serebri imortal pada manusia, juga

menunjukkan bahwa flavan-3-ol dapat menembus sawar darah otak dan

mengalami metabolisme glukoronidasi. Flavan-3-ol yang termetilasi juga dapat

58
menembus sel ini dengan efisien. Karena ditemukan flavan-3-ol dengan

termetabolisir O-metilasi pada in vivo, maka flavonoid dapat masuk dan berefek

pada otak. Bioavailabilitas EC dalam bentuk metabolit O-metilasi dan

glukoronidasi ditemukan pada otak tikus setelah diberikan peroral. EGCG juga

ditemukan di dalam otak setelah pemberian intravena (Faria et al., 2012).

Flavonoid rata-rata didapatkan pada jaringan otak dengan kadar kurang dari 1

nmol/gram jaringan. Flavonoid didapatkan tersebar pada seluruh jaringan otak

dan tidak terakumulasi pada area tertentu, sehingga flavonoid dapat menjadi

kandidat neuroprotektif langsung di otak (Vauzour, 2012).

Pada sistem saraf pusat, catechins diketahui dapat bekerja pada neuron

dan astrosit. EGCG diduga dapat mempengaruhi transduksi sinyal, baik dengan

berinteraksi dengan reseptor di permukaan membran, maupun berikatan dengan

protein intraseluler. Pada pemberian label 3H pada EGCG, didapatkan bahwa

EGCG dapat terdeteksi di mitokondria neuron granularis serebelum tikus, dimana

EGCG dapat mencegah stress oksidatif dan melindungi sel dari apoptosis. Untuk

dapat masuk dalam sel, catechins diduga dapat berinteraksi dengan membran

fosfolipid, ditunjukkan pada nuclear magnetic resonance spectroscopy. EGCG

diduga dapat ditransportasi ke lipid raft, suatu mikrodomain kaya-kolesterol

tempat menempelnya signalling protein, termasuk reseptor. Kemudian EGCG

dapat masuk ke sitosol melalui reseptor atau beberapa reseptor, seperti

endositosis. Setelah di dalam sel, EGCG dapat berikatan dengan protein target.

Selain itu, polifenol teh dapat pula berikatan dengan DNA dan RNA, sehingga

diduga dapat mempengaruhi transkripsi gen (Lorenz, 2013).

2.9.3.1.3 Metabolisme Catechins

Catechins dimetabolisme dengan glukoronidasi, metilasi, dan sulfonasi

menjadi komponen yang lebih hidrofilik. Proses metabolisme tersebut melalui

59
mekanisme enzimatik (Yashin et al., 2012). Pada manusia, EGCG dimetilasi oleh

enzim liver catechol-O-methyltransferase (COMT) dan mengurangi aktivitas

EGCG. EGCG dimetilasi menjadi 4.4-di-O-methyl-EGCG, EGC dimetilasi

menjadi 4-O-methyl-EGC, sedangkan C dimetilasi pada posisi 3-. Analisis dari

catechins kebanyakan dihitung dari catechins yang tidak berubah, sedangkan

metabolit termetilasi tidak teranalisis (Manach et al., 2005). Akan tetapi, EGCG

lebih banyak ditemukan dalam bentuk bebas (77-90%). Catechins lainnya berada

dalam bentuk konjugat dengan asam glukoronat dan sulfat (Manach et al., 2005;

Yashin et al., 2012).

2.9.3.1.4 Eliminasi Catechins

Mayorita catechins dieliminasi dari tubuh melalui urin dan sisanya melalui

empedu. Pada urine, terdeteksi metabolit flavan-3-ol dan bentuk asam gallat

yang tidak termetabolisme. Urine mengandung 7,2% dari metabolit flavan-3-ol

yang dikonsumsi dan 4,5% asam gallat. Metabolit yang tertinggi antara lain

epicatechins sulfate, methyl-epicatechins sulfate, epicatechin glucuronide,

epigallocatechin glucuronide, dan methyl-epigallocatechin glucuronide (Yashin et

al., 2012). Pada penelitian di tikus, EGCG dieksresikan melalui empedu (Manach

et al., 2005).

2.9.3.2 Waktu Paruh, Onset, Puncak, Durasi Catechins

Catechins terdeteksi pada plasma darah 1-2 jam setelah dikonsumsi.

Waktu paruh rata-rata dari catechins adalah 2-3 jam (Yashin et al., 2012). Waktu

paruh catechins pada tikus lebih singkat, sedangkan waktu paruh pada mencit

sama dengan pada manusia. Pada mencit, sepertiga dari EGCG yang

dikonsumsi dieliminasi melalui feces dalam 24 jam pertama (Smith, 2011).

60
 Metabolit catechins mulai terdeksi pada urine 4 jam setelah konsumsi.

Puncak konsentrasi metabolit epicatechins sulfate dan methyl-epicatechins

sulfate terdeteksi setelah 10 jam. Konsentrasi EGC terus meningkat hingga lebih

dari 24 jam setelah dikonsumsi. Ekskresi EGCG lebih lambat (Yashin et al.,

2012).

2.9.3.3 Farmakodinamik Catechins

Catechins dapat mempengaruhi absorbsi zat besi, terutama pada pasien

dengan risiko defisiensi besi. Efek catechins terhadap ion lainnya tidak diketahui.

Catechins dapat mempengaruhi absorbsi dan metabolisme ion karena flavanoid

berinteraksi dengan ion metal (Chacko et al., 2010).

2.9.3.3.1 Toksisitas Catechins

Konsumsi teh hijau pada manusia dengan dosis tinggi tidak menunjukkan

efek samping (Chacko et al., 2010). Berdasarkan penelitian dari Hsu et al.

(2011), pemberian ekstrak teh hijau hingga 2500 mg/kgBB per hari selama 28

hari tidak menyebabkan timbulnya efek samping pada mencit.

Disebutkan pada penelitian lain bahwa EGCG merupakan zat yang

sitotoksik. Konsumsi EGCG dosis tinggi dapat bersifat sitotoksik pada hepatosit.

EGCG dosis tinggi juga dapat merusak DNA pada pankreas dan liver hamster.

Dosis tinggi ekstrak teh hijau juga dapat menyebabkan pembesaran kelenjar

tiroid (goiter) pada tikus normal (Chacko et al., 2010).

2.9.3.3.2 Aktivitas dan Manfaat Catechins

Nutrisi diteliti atas efektivitasnya terhadap terapi cedera otak dan cedera

terkait cedera otak misalnya hipoksia, kejang, dan perdarahan sehingga

merupakan terapi penunjang dalam penatalaksanaan cedera kepala. Nutrisi

61
dipilih berdasarkan perannya dalam mengembalikan energi seluler, menurunkan

stress oksidatif dan inflamasi, dan perbaikan serta kesembuhan dari cedera.

Nutrisi yang teridentifikasi antara lain asetil KoA, antioksidan, asam amino rantai

cabang, kolin, kreatin, diet ketogenik, magnesium, nikotinamid adenin

dinukleotida, asam lemak n-3, polifenol, vitamin D dan zink (Erdman et al., 2011).
Efek utama dari polifenol di otak adalah (1) menghambat pelepasan

sitokin pro inflamasi oleh glia teraktivasi, (2) menghabat induksi iNOS dan

produksi NO akibat aktivasi glia, (3) menghambat aktivasi NADPH oksidase dan

pembentukan ROS oleh glia teraktivasi, dan (4) menurunkan aktivitas faktor

transkripsi proinflamasi seperti NFB oleh glia dan kaskade signaling pathway

neuron seperti MAPK. Produksi NO berlebihan, terutama yang diproduksi oleh

mikroglia dan astrosit, dapat menginduksi kematian neuron melalui kerusakan

transpor elektron di mitokondria sehingga terjadi penurunan sintesis ATP dan

peningkatan produksi ROS. Neurotoksisitas dari mikroglia mengaktifkan NADPH

oksidase yang memediasi produksi superoksida dan pelepasan molekul pro

inflamasi, seperti TNF. NO dan superoksida tersebut dapat bereaksi

membentuk radikal peroksinitrit. Peroksinitrit tersebut menghambat respirasi

mitokondria, menginduksi apoptosis bergantung caspase dan menginduksi

pelepasan glutamat. Akibatnya semakin terjadi eksitotoksisitas dan

menyebabkan kematian neuron. TNF yang dihasilkan berikatan dengan TNRF1

dan menyebabkan apoptosis neuron melalui jalur ekstrinsik. Jalur lain yang

penting dari efek biologis polifenol adalah penghambatan faktor transkripsi famili

forkhead (FoxO) yang teraktivasi oleh stress oksidatif. Hambatan aktivasi famili

FoxO dapat meregulasi apoptosis dengan mengaktifkan Bcl-2 anti apoptosis

(Vauzour, 2012).
Ekstrak teh hijau berpeluang dalam terapi gangguan kardiovaskuer,

antikarsinogenik, dan anti inflamasi melalui mekanisme antioksidan dan aksi

iron-chelating, memodulasi metabolisme endogen, dan antioksidan (Mandel and

62
Youdim, 2004). Konsumsi catechins selama tujuh hari dapat menurunkan

konsentrasi penanda stress oksidatif, seperti 8-OhdG dan MDA pada urine, F2-

isoprostane, dan PCOOH pada plasma (Yashin et al., 2012). Selain mekanisme

di atas, catechins juga memiliki sifat neuroprotektif melalui mekanisme pleiotropik

pada intraseluler. Antara lain, melalui regulasi homeostasis kalsium, aktivasi

MAPK, enzim detoksifikasi antioksidan fase II, serine/threonine protein kinase

AKT dan protein kinase C, serta memodulasi beberapa gen pertahanan sel atau

siklus sel (Mandel and Youdim, 2004).

Pada penelitian yang dilakukan Paterniti et al., (2009) pada tikus model

cedera spinal, catechins terbukti memberikan manfaat pada derajat kerusakan

medulla spinalis dan memperbaiki gangguan motoris. Cedera medula spinalis

memicu kerusakan sel neuron sekunder, seperti pada cedera otak dengan

melibatkan oksidan ROS, dan sebagainya. Sehingga, pemberian catechins yang

berfungsi sebagai free radical scavanger, dapat bekerja sebagai antioksidan dan

memiliki efek neuroprotektan.

Masih dari penelitian yang sama, cedera medula spinalis traumatis juga

memicu terjadinya peroksidase lipid. Pada penelitian tersebut kadar

Malondialdehyde (MDA) dievaluasi, dan pada kelompok yang diberikan ekstrak

teh hijau juga ditemukan penurunan kadar MDA yang bermakna, pada kelompok

sham procedure, tidak ada peningkatan MDA sama sekali (Paterniti et al., 2009).

Peran catechins pada iskemia otak, seperti pada cedera otak traumatik

dijelaskan pada gambar 2.21. Catechins bersifat antioksidan melalui

penghambatan pelepasan ;roteolys, meningkatkan gradien H+ pada

mitokondria, menurunkan produksi enzim-enzim xantin oksidase, fosfolipase,

protein kinase, protease, dan endonuklease. Selain itu, catechins juga

menghambat NOS baik melalui penghambatan aktivitas iNOS, nNOS, maupun

eNOS yang berlebihan, sehingga produksi NO tidak berlebihan. Aktivitas eNOS

selain bersifat protektif karena menyebabkan vasodilatasi di area iskemik, juga

63
berbahaya bila berlebihan karena meningkatkan risiko perdarahan. Catechins

juga menghambat mediator pro inflamasi, sehingga menurunkan pembentukan

radikal bebas melalui jalur inflamasi. Catechins dapat menurunkan apoptosis dan

proteolisis sehingga menurunkan sel yang mati. (Sutherland et al., 2006).

Catechins juga menghambat aktivitas PARP (Paterniti et al., 2009).

Gambar 2.21 Mekanisme kerja catechins pada kaskade iskemia pada

penyakit neurodegeneratif dan neuroinflamasi. Tempat aksi catechins ditandai
dengan logo daun, menunjukkan perannya dalam mencegah kematian sel. Selain itu
catechins juga bersifat neuroprotektif dengan menginduksi produksi eNOS.
Neuroinflamasi merupakan jalur yang tetap teraktivasi hingga berbulan-bulan, dan
catechins juga berperan dalam berbagai mekanisme di dalamnya (Sutherland et al.,
2006).

Aktivasi NFkB memediasi protein mediator dalam proses inflamasi. Pada

cedera spinalis, catechins mampu menurunkan aktivasi NFkB, sehingga

mengjambat kenaikan sitokin proinflamasi, seperti TNF- dan IL-1. Selain itu,

juga terjadi penurunan produksi NO yang diinduksi iNOS, pada tikus model

cedera medula spinalis traumatik yang diberikan ekstrak teh hijau dibandingkan

kelompok yang tidak diberikan ekstrak teh hijau (Paterniti et al., 2009).

64
 Anggota flavan-3-ol, memiliki efek berbeda pada otak. EC dan C dapat

menghambat pelepasan TNF, tetapi tidak menurunkan ekspresi iNOS dan

produksi NO pada sel glia. EC dan C juga tidak dapat menghambat NADPH

oksidase (Vauzour, 2012). EC diketahui memiliki efek antioksidan pada injury

neuron. Pemberian EC sebelum induksi neurotoksik dapat menghambat produksi

TNF dan NFB serta menurunkan aktivasi iNOS (Mohamed, Karam and Amer,

2011). C dan EGCG memiliki efek anti neuroinflamasi (Jger and Saaby, 2011).

Efek antiinflamasi EGCG dan catechins ditunjukkan dengan hambatan pada jalur

NFB dan AP-1 (Ekawati et al., 2012). EGCG dapat menghambat pelepasan

TNF, menghambat aktivasi iNOS, serta menurunkan aktivasi PARP (Khalatbary

and Ahmadvand, 2011). EGCG juga diketahui dapat menurunkan ekspresi

aquaporin 4 (kanal air pada sawar darah otak) sehingga dapat mengurangi

edema otak. Selain itu EGCG juga dapat menurunkan ekspresi GFAP yang

menunjukkan penurunan glia yang teraktivasi (Zhang et al., 2015). Hasil

penelitian Kaul dan Khanduja menemukan bahwa polifenol menghambat

produksi superoxide anion radical (SOR) yang diinduksi benzoil peroxide (BPO).

Penghambatan xantin oxidase (XO) juga dapat dilakukan oleh EGCG (Ekawati et

al., 2012). EGCG juga membantu dalam memetabolisme protein prekursor

amiloid melalui jalur -secretase sehingga mengurangi pembentukan fibril -

amyloid (Mandel and Youdim, 2004).

Pemberian EGCG pada cedera spinalis dapat menurunkan ekspresi Bax

dan meningkatkan ekspresi Bcl-2 setelah trauma (Khalatbary, 2014). EGCG

memodulasi jalur apoptosis dengan melindungi dari stress oksidatif. Beberapa

sekuens apoptosis yang dihambat oleh EGCG antara lain adalah caspase-3,

pelepasan sitokrom c, poly-ADP-ribosome polymerase cleavage, jalur glycogen

kinase synthase kinase-3 pathway, dan memodulasi sinyal sel melalui jalur

phosphatidyl inositol-3 kinase (PI3K/Akt), sehingga sel tetap hidup. Catechins

65
juga memodulasi apoptosis dengan mempengaruhi gen pro-apoptosis dan anti-

apoptosis. EGCG menghambat ekspresi gen pro-apoptosis Bax, Bad, dan Mdm2

serta menginduksi ekspresi gen anti-apoptosis, yaitu Bcl-2, Bcl-w, dan Bcl-xl,

sehingga melindungi sel dari apoptosis. EGCG juga mempromosi kehidupan sel

dengan menjaga jalur protein kinase c dan extracellular signal-related kinase

pathway (Sutherland et al., 2006).

Selain sebagai antioksidan dan antiinflamasi seperti tersebut diatas,

catechins juga dapat menurunkan kadar kolesterol, LDL, dan trigliserida.

(Ekawati et al., 2012). Selain manfaat yang jelaskan di atas, catechins juga

dikenal dengan manfaat sebagai antibakteri, antidiabetes, antivirus, antimalaria,

hepatoprotektan, neuroprotektan dan kardioprotektan (Chaturvedi and Mishra,

2012).

2.9.4 Kelemahan Catechins

Kelemahan catechins yang paling signifikan adalah sifat reaktif dan tidak

stabil, baik dalam kondisi fisiologis maupun eksperimen. Catechins merupakan

radical scavenger untuk O2- dan OH-. Namun, catechins juga mudah dioksidasi

oleh dioksigen sehingga dapat menghasilkan ROS, antara lain hidrogen

peroksida (H2O2) dan O2-. Ion cuprum (Cu2+) meningkatkan auto-oksidasi dan

dapat membentuk produk samping quinone yang bersifat sitotoksik (Smith,

2011).
EGCG, sebagai komposisi terbesar dari catechins juga ditemukan cepat

dimetabolisme in vivo. Karena kelarutannya tinggi, catechins sedikit diabsorbsi

pada pemberian peroral. Selain itu, mikroba pada usus juga dapat menyebabkan

degradasi dari catechins (Smith, 2011). Kendala lain, dosis catechins pada

penelitian in vitro biasanya lebih tinggi daripada kadar catechins yang didapatkan

dari penelitian in vivo (Lorenz, 2013).

66
2.9.5 Upaya untuk Meningkatkan Bioavailabilitas Catechins

Untuk menghindari auto-oksidasi dan modifikasi catechins in vivo,

dilakukan asetilasi dari alkohol phenolic. Konfisi serupa juga dilakukan pada

asetilasi asam salisilat menjadi acetic anhydrate untuk membentuk aspirin.

Asetilasi menyebabkan bahan menjadi lebih hidrofobik, menghambat

biotrasformasi fase II, maupun degradasi oksidatif. Pada penelitian yang

dilakukan oleh Lambert et al. (2006) didapatkan bahwa EGCG terasetilasi akan

mengalami deasetilasi setelah masuk ke dalam berbagai sel serta meningkatkan

kadarnya hingga 4 kali lipat pada serum serta meningkatkan waktu paruh hingga

6 kali lipat (Smith, 2011). Terdapat penelitian lain yang memberikan terapi dalam

bentuk metabolit catechins. Dimerisasi EGCG pada medium alkali menghasilkan

theasinensins A dan D, yang memiliki aktivitas antioksidan 2-3 kali lebih besar

(Yashin et al., 2012). Huang et al. (2011) memberikan C dengan liposom,

menghasilkan konsentrasi C yang lebih tinggi di otak (Faria et al., 2012).

67
 BAB 3

KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

68
3.1 Kerangka Konsep

69
Berlangsung mulai beberapa menit
setelah cedera

70
Gambar 3.22 Kerangka konsep penelitian

71
Keterangan

Cedera otak traumatik menyebabkan gangguan mekanik langsung

terhadap jaringan otak, dimana secara patofisiologi terbagi menjadi cedera

primer dan sekunder. Pada cedera otak primer, terjadi kontusio pada jaringan

otak, kebocoran sawar darah otak, dan perubahan aliran darah ke otak. Cedera

otak sekunder merupakan proses lanjut dari cedera otak primer, dimana terjadi

proses metabolik akibat cedera otak primer. Proses yang serupa dengan iskemia

ini meningkatkan pelepasan glutamat dan ekspresi reseptornya, yaitu NMDA dan

AMPA, akibatnya terjadi peningkatan influks kalsium ke intraseluler. Ditambah

dengan berkurangnya ATP, kalsium intraseluler semakin menumpuk.

Peningkatan kalsium intraseluler ini berlangsung hingga 7 hari setelah cedera.

Penumpukan kalsium intraseluler mengaktifkan jalur apoptosis intrinsik.

Pada jalur intrinsik, mitokondria memainkan peran penting. Pelepasan sitokrom

C dari mitokondria merupakan kejadian yang menginisiasi kaskade apoptosis.

Pelepasan ini diatur oleh keluarga Bcl-2, yang mengandung anggota pro dan anti

apoptosis. Diantara anggota pro-apoptosis adalah Bax dan keluarga anti-

apoptosis adalah Bcl-2. Bax berkerja akibat aktivasi BH3-only protein dan

hambatan BH3-only protein terhadap Bcl-2. Dengan adanya aktivasi jalur pro

apoptosis, sitokrom C dilepaskan dari mitokondria. Sitokrom c mengaktifkan

kaskade caspase, yang terdiri dari caspase inisiator (caspase 9), diikuti aktivasi

caspase efektor (caspase 3, 6 dan 7). Aktivasi caspase 3 menyebabkan

fragmentasi DNA dan terjadi apoptosis.

Penumpukan kalsium intraseluler juga mengaktivasi iNOS pada neuron

dan mikroglia sehingga terjadi inflamasi. Inflamasi mengaktifkan jalur apoptosis

ekstrinsik. Jalur apoptosis ekstrinsik berhubungan dengan intrinsik melalui tBid

yang mengaktifkan caspase 9 (tidak tampak pada gambar 3.1). Aktivasi iNOS

menghasilkan NO yang membentuk radikal bebas. Radikal bebas yang terbentuk

72
juga merupakan stress seluler yang mengaktifkan protein BH3-only pada jalur

apoptosis intrinsik. NO juga dapat mengaktivasi Bax secara langsung.

Ikatan Bcl-2 anti apoptosis terhadap Bax menyebabkan sel dapat bertahan

dari apoptosis. Sedangkan apabila Bcl-2 tidak menghambat Bax, proses

apoptosis berlangsung. Ekspresi Bcl-2 dan Bax secara teori dapat digambarkan

berupa rasio, dimana ketika rasio Bcl-2/Bax meningkat sel lebih bertahan hidup.

Sebaliknya, apabila rasio tersebut turun, sel lebih rentan mengalami apoptosis.

Puncak apoptosis ini terjadi pada hari ketiga setelah cedera.

Catechins merupakan senyawa yang bersifat anti inflamasi dan anti

oksidan. Catechins diduga mampu menurunkan apoptosis neuron dengan

menghambat pembentukan protein pro-apoptosis (Bax) serta meningkatkan

pembentukan protein anti-apoptosis (Bcl-2). Peningkatan rasio ekspresi Bcl-

2/Bax berkorelasi dengan penurunan apoptosis. Karena apoptosis merupakan

proses yang bertanggungjawab pada perburukan kondisi klinis, maka diharapkan

keluaran klinis akan lebih baik dengan hambatan pada proses apoptosis.

Perbaikan keluaran klinis biasanya didapatkan setelah 7 hari.

Keluaran klinis juga dipengaruhi oleh inflamasi. Sitokin proinflamasi

diaktikan oleh peningkatan glutamat. Mediator inflamasi dikeluarkan baik oleh

neuron dan glia pada jaringan otak yang mengalami injury, juga oleh adanya

infiltrasi sel inflamasi dari intravaskuler ke jaringan otak. Progresivitas kerusakan

jaringan terkait oleh pelepasan mediator neurotoksik, NO, dan sitokin. Adanya

inflamasi mengaktifkan jalur apoptosis ekstrinsik, sehingga caspase 8 menjadi

aktif. Aktivasi jalur ekstrinsik dapat memicu jalur intrinsik melalui aktivasi Bid

menjadi tBid. tBid dapat mengaktifkan Bax dan Bak.

3.2 Hipotesis Penelitian

Berdasarkan kerangka teori dan konsep penelitian diatas, hipotesis

penelitian ini, yaitu :

73
1. Terdapat perbedaan NSS pada tikus model cedera otak traumatik yang diberi

catechins dibandingkan tikus model cedera otak traumatik yang tidak diterapi

catechins pada pengamatan hari ketiga dan ketujuh.

2. Terdapat hubungan antara peningkatan dosis catechins dengan penurunan

NSS pada tikus cedera otak traumatik pada pengamatan hari ketiga dan

ketujuh.
3. Terdapat perbedaan rasio ekspresi Bcl-2/Bax pada jaringan otak tikus model

cedera otak traumatik yang diterapi dengan catechins dibandingkan tikus

dengan cedera otak traumatik yang tidak diterapi catechins pada pengamatan

hari ketiga dan ketujuh.

4. Terdapat hubungan antara peningkatan dosis catechins dengan peningkatan

rasio ekspresi Bcl-2/Bax pada jaringan otak tikus cedera otak traumatik pada

pengamatan hari ketiga dan ketujuh.

5. Terdapat hubungan antara peningkatan rasio ekspresi Bcl-2/Bax dengan

penurunan NSS pada tikus cedera otak traumatik pada pengamatan hari

ketiga dan ketujuh.

74
 BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Strategi Penelitian

Penelitian ini menggunakan strategi penelitian model cedera otak

traumatik dengan metode penjatuhan beban. Dilakukan pengamatan ekspresi

Bcl-2 dan Bax dengan metode imunohistokimia, serta status fungsional tikus

dengan NSS.

4.2 Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan desain penelitian sebenarnya (true

experimental design) di laboratorium secara in vivo dengan randomized post test

only controlled group design pada hewan coba tikus putih (Rattus norvegicus)

galur Wistar.

4.3 Populasi dan Sampel

Sampel penelitian adalah tikus yang dipilih memenuhi kriteria yaitu tikus

putih Rattus norvegicus galur wistar jantan yang berusia 6-8 minggu dengan

berat 100-150 gram. Jenis kelamin yang dipilih adalah jantan karena tidak

dipengaruhi oleh faktor hormonal, seperti pada tikus betina. Tikus yang dipilih

adalah tikus dengan kondisi sehat dan bergerak aktif, ditandai dengan

mendapatkan hasil normal pada pemeriksaan NSS. Kriteria drop out adalah tikus

yang mati pada saat penelitian berlangsung.

Besar sampel yang digunakan pada penelitian ini menggunakan rumus

Solimun (2001):

75
 p = kelompok perlakuan (lima (5) kelompok)
n (p-1) 15
n = jumlah ulangan
Banyaknya ulangan pada penelitian ini adalah:

n(p-1) 15

n(5-1) 15

n 3,75 ~ 4

Dari perhitungan di atas, dibutuhkan ulangan sebanyak 4 hewan coba

pada 5 kelompok perlakuan, sehingga dibutuhkan 20 ekor tikus. Kelima

kelompok tersebut adalah kelompok A atau kelompok kontrol negatif yaitu tikus

yang tidak diberikan perlakuan cedera otak traumatik maupun catechins,

kelompok B atau kelompok kontrol positif yang menjadi model cedera otak

traumatik tanpa diberi catechins, kelompok C yaitu kelompok perlakuan yang

menjadi model cedera otak traumatik dan diberi catechins 513 mg/kgBB/hari

peroral, kelompok D yaitu kelompok perlakuan yang menjadi model cedera otak

traumatik dan diberi catechins 926 mg/kgBB/hari peroral, kelompok E yaitu

kelompok perlakuan yang menjadi model cedera otak traumatik dan diberi

catechins 1113 mg/kgBB/hari peroral. Karena terdapat 2 kelompok hari

pengamatan (hari ketiga dan hari ketujuh), maka total jumlah tikus yang

dibutuhkan adalah sebanyak 40 ekor.

4.4 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di beberapa laboratorium, yaitu di: Laboratorium

Fisiologi Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang untuk tempat

pemeliharaan hewan coba dan pembedahan, Laboratorium Patologi Anatomi

Rumah sakit Dr. Soetomo Surabaya untuk pembuatan blok parafin dan

pembuatan slide imunohistokimia, dan Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas

76
Kedokteran Universitas Brawijaya Malang untuk tempat pewrnaan slide

imunohistokimia dan pengamatan hasil imunohistokimia dengan mikroskop

binokuler. Penelitian ini dilaksanakan selama tiga bulan dari Juli sampai

September 2016.

4.5 Variabel Penelitian

4.5.1 Variabel Bebas

Variabel bebas pada penelitian ini adalah terapi catechins yang dibagi

dalam kelompok:

1. Kelompok A: merupakan kontrol negatif yang tidak dilakukan cedera otak

traumatik dan tidak diberi catechins (sham procedure) yang dikorbankan.

2. Kelompok B merupakan kelompok kontrol positif cedera otak traumatik yang

tidak mendapatkan catechins.

3. Kelompok C: merupakan kelompok perlakuan cedera otak traumatik yang

mendapatkan catechins dengan dosis 513 mg/kg/hari.

4. Kelompok D: merupakan kelompok perlakuan cedera otak traumatik yang

mendapatkan catechins dengan dosis 926 mg/kg/hari.

5. Kelompok E: merupakan kelompok perlakuan cedera otak traumatik yang

mendapatkan catechins dengan dosis 1113 mg/kg/hari.

Dosis catechins 513, 926 dan 1113 mg/kgBB/hari diberikan sesuai

dengan penelitian yang dilakukan oleh Suzuki et al. (2004) mengenai efek

catechins pada otak tikus iskemik.

4.5.2 Variabel Tergantung

Variabel tergantung terdiri dari ekspresi Bax, Bcl-2, rasio ekspresi Bcl-

2/Bax jaringan otak, serta hasil NSS.

77
4.6 Definisi Operasional Variabel

1. Model traumatic brain injury didefinisikan cedera otak jejas atau perlukaan

jaringan otak, bukan karena proses degeneratif atau bawaan lahir, melainkan

akibat penjatuhan beban. Model penjatuhan beban adalah dengan silinder

besi seberat 45 gram (diameter 0,4 cm) yang dijatuhkan dengan sudut 90

dari ketinggian 100 cm sebanyak 1 kali. Energi benturan sebesar 0,45 Joule

(Riawan et al., 2015). Pada model ini, tikus akan mengalami kontusio serebri

dan cedera otak ringan.

2. Catechins yang digunakan adalah isolat bahan aktif dari ekstrak teh hijau

(Camelia sinensis) galur GMB-4 dari Laboratorium Kimia Institut Teknologi

Bandung oleh Dr. Ciptati (Ratnawati et al., 2009). Bentuk dari isolat bahan

aktif ini adalah bubuk yang diencerkan air sebanyak 1 cc sebelum diberikan

pada tikus per oral melalui sonde. Terapi catechins diberikan setiap hari

dengan dosis 513, 926 dan 1113 mg/kgBB/hari (Suzuki et al., 2004). Lama

pemberian adalah 3 hari dan 7 hari.

3. Ekspresi Bcl-2 pada jaringan otak tikus wistar diukur melalui metode

imunohistokimia dengan menggunakan antibodi anti-Bcl-2 (polyclonal, 1:200

dilution, bs-4563R Bioss USA). Penghitungan rata-rata total neuron yang

mengekspresikan Bcl-2 per lapang pandang pada 10 lapang pandang (hot-

spot method). Neuron yang positif mengekspresikan Bcl-2 ditandai dengan

sitoplasma yang terwarnai coklat pada pemeriksaan imunohistokimia

(Raghupathi et al., 2003). Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop

binokuler merk Olympus BxS1 dengan pembesaran 400x.

4. Ekspresi Bax pada jaringan otak tikus wistar diukur melalui metode

imunohistokimia dengan menggunakan antibodi anti-Bax (polyclonal, 1:200

dilution, bs-0127M Bioss USA). Penghitungan rata-rata total neuron yang

mengekspresikan Bax per lapang pandang pada 10 lapang pandang (hot-spot

78
 method). Neuron yang positif mengekspresikan Bax ditandai dengan

sitoplasma yang terwarnai coklat pada pemeriksaan imunohistokimia

(Raghupathi et al., 2003). Pengamatan dilakukan menggunakan mikroskop

binokuler merk Olympus BxS1 dengan pembesaran 400x.

5. Rasio Bcl-2/Bax diukur dengan menghitung rerata neuron yang

mengekspresikan Bcl-2 dan Bax rerata neuron yang mengekspresikan Bax

pada tiap kelompok.

6. NSS diukur pada tikus terdiri dari 8 pemeriksaan dengan skor dengan skor
minimal (normal) 0 dan skor maksimal 10 yang menandakan keparahan

cedera otak traumatik (Tabel 4.1). (Wu, et al., 2010; Albert-Weienberger et

al., 2012).

4.7 Bahan dan Alat

4.7.1 Alat dan Bahan untuk Perawatan Hewan Coba

Alat yang digunakan adalah kandang berupa baskom dengan ukuran

20x30 cm dengan penutup kandang berupa jaring-jaring kawat sebanyak 10

buah, botol minum tikus 20 buah, timbangan analitik, handscoon dan pembersih

kandang. Satu kandang berisi 4 ekor tikus dengan 2 botol minum.

Bahan yang digunakan berupa sekam padi setebal 1,5-2 cm, makanan

tikus, dan air minum. Sekam padi dimasukkan kedalam kandang dan diganti

setiap hari. Makanan tikus terdiri dari makanan ayam jenis BR 1 lalu dicampur

tepung terigu dan sedikit air sehingga berbentuk pellet. Air minum dan pellet

diganti setiap hari.

79
4.7.2 Alat Model Cedera Otak Traumatik

Alat yang digunakan adalah alat pengatur ketinggian beban berupa

tabung dengan ketinggian 100 cm (gambar 4.1), silinder besi seberat 45 gram

dengan diameter 0,4 cm, lampu senter, benang wol untuk mengikat ekstremitas

tikus, papan untuk memfiksasi tikus, jarum pentul untuk mengaitkan benang wol,

dan fiksasi kepala tikus agar penjatuhan beban tepat pada sasaran.

Gambar 4.23 Alat untuk penjatuhan beban

Keterangan: a. Pengatur jarak alat dengan beban; b. Pengatur ketinggian; c. Tabung dengan
ketinggian 100 cm; d. Beban sebesar 45 gram.

4.7.3 Alat dan Bahan untuk Pemberian Terapi Catechins

Alat yang digunakan adalah handscoon, disposable spuit 5 mL, dan

sonde. Bahan yang digunakan adalah catechins dan air untuk melarutkan

catechins.

4.7.4 Alat dan Bahan Pembedahan

Alat yang digunakan adalah 2 buah gunting bedah, dua buah pinset, 2 set

jarum pentul, 2 buah steroform, 1 buah penggaris, kertas label, 1 buah termos

es, 1 bungkus kapas, 40 buah wadah plastik dengan tutup rapat, dan 40 buah

80
spuit 1 mL. Bahan yang digunakan adalah 3 botol Ketamine, 2 buah salep

Lidocaine 5%, benang chromic catgut 3-0 dengan jarum, 1 botol povidone iodine,

dan 1 botol alkohol, dan 200 mL buffer-formalin 10%,.

4.7.5 Pembuatan Slide Histopatologi

Alat yang digunakan adalah kaca obyek (object glass), kaca penutup

(cover glass), paraffin block, dan rotary mikrotom merek Leica. Bahan yang

digunakan adalah jaringan otak tikus Wistar.

4.7.6 Pemeriksaan Imunohistokimia Bcl-2

Alat yang dibutuhkan untuk pemeriksaan imunohistokimia antara lain

inkubator, chamber (suatu wadah dari plastik yang tahan panas), waterbath,

object glass dengan coating poly-L-Lysine slide, declocking chamber, hot plate,

timer, dan mikroskop Olympus dengan pembesaran 1000x. Untuk bahan yang

dibutuhkan antara lain immunostaining kit (Dako LSAB + System-HRP), antibodi

primer Bcl-2 (bs-4563R Bioss USA), xylol, etanol absolut, etanol 90 %, etanol 80

% H2O2, methanol, larutan DIVA, aquades steril, PBS (yang dibuat dari

NaH2PO4.2H2O 2,4 gram, Na2HPO4 1,2 gram, KH2PO4 0,7 gram, dan KCl 6,8

gram yang dilarutkan dalam aquades 1000 ml dan diukur pada pH 7,4), DAB (1

ml Betazoid DAB substrate buffer ditambah dengan 1-2 tetes DAB chromogen),

mayer haematoxylin, lithium carbonat jenuh, dan entelan.

4.7.7 Pemeriksaan Imunohistokimia Bax

Alat yang dibutuhkan untuk pemeriksaan imunohistokimia antara lain

inkubator, chamber (suatu wadah dari plastik yang tahan panas), waterbath,

object glass dengan coating poly-L-Lysine slide, declocking chamber, hot plate,

timer, dan mikroskop Olympus dengan pembesaran 1000x. Untuk bahan yang

81
dibutuhkan antara lain immunostaining kit (Dako LSAB + System-HRP), antibodi

primer Bax (bs-0127M Bioss USA), xylol, etanol absolut, etanol 90 %, etanol 80

% H2O2, methanol, larutan DIVA, aquades steril, PBS (yang dibuat dari

NaH2PO4.2H2O 2,4 gram, Na2HPO4 1,2 gram, KH2PO4 0,7 gram, dan KCl 6,8

gram yang dilarutkan dalam aquades 1000 ml dan diukur pada pH 7,4), DAB (1

ml Betazoid DAB substrate buffer ditambah dengan 1-2 tetes DAB chromogen),

mayer haematoxylin, lithium carbonat jenuh, dan entelan.

4.7.8 Alat Pemeriksaan Status Fungsional NSS

Gambar 4.24 Alat pengukuran NSS

Keterangan: A. platform berbentuk lingkaran berdiameter 30 cm untuk mengetes kemampuan tikus
keluar dari lingkaran dalam 2 menit; B. balok dengan penampang 7 mm x 7 mm untuk menilai
keseimbangan; D. platform balok dengan panjang 30 cm dengan variasi lebar 1 cm, 2 cm, dan 3
cm untuk mengetes kemampuan tikus berjalan di atas balok, D. platform sepanjang 30 cm
berbentuk silinder berdiameter 3 mm untuk menilai keseimbangan tikus pada dasar silinder.

Peralatan yang dibutuhkan untuk memeriksa NSS adalah alat NSS yang

terdiri dari: model ruangan dengan dasar lingkaran berdiameter 30 cm terbuka

pada bagian atas dan terdapat lubang pintu keluar, papan observasi berukuran

30 cm x 30 cm, forsep, balok keseimbangan berukuran 0,7 cm x 0,7 cm, tongkat

silinder berdiameter 0,3 cm, balok jalan berukuran panjang 30 cm dan 3 variasi

lebar, 3 cm, 2 cm dan 1 cm (gambar 4.2). Selain itu dibutuhkan stopwatch, dan

alarm.

82
4.8 Prosedur Penelitian

4.8.1 Pemeliharaan Tikus Wistar

Tikus wistar (Rattus novergicus galur wistar) jantan sebanyak 40 ekor

dipelihara di Laboratorium Farmakologi FKUB dalam kandang berukuran 30x30

cm (satu kandang berisi 4 ekor tikus). Tikus mengalami aklimatisasi selama 7

hari agar melakukan penyesuaian dengan lingkungan yang baru. Makan dan

minum diberikan dengan jumlah yang cukup untuk setiap kandangnya. Untuk

minum diberikan air yang diganti setiap harinya. Selama pelaksanaan penelitian,

tikus diperlakukan dengan hatihati dan memperhatikan kelayakan etik penelitian

dengan hewan coba.

4.8.2 Pembuatan Catechins

Teh hijau galur GMB-4 didapatkan dari Tea and Quinine Research Center

Gambung. Catechins diisolasi dari teh hijau galur GMB-4 dalam bentuk bubuk.

Prosedur isolasi tersebut dilakukan oleh Dr. Ciptati, M.S., M.Sc., Ph.D. pada

Departemen Kimia Fakultas MIPA, Institut Teknologi Bandung (Ratnawati et al.,

2009).

4.8.3 Model Cedera Otak Traumatik

Perlakuan cedera otak traumatik dilakukan sesuai penelitian yang

dilakukan oleh Riawan et al. (2015). Tikus dianestesi dengan Ketamin 44

mg/kgBB intramuskular, kemudian bulu kepala dicukur dan dibersihkan. Kulit

kepala diolesi krim Lidocain 5%, kemudian diinsisi hingga tampak kranium.

Silinder besi seberat 45 gram (diameter 0,4 cm) dijatuhkan dengan sudut 90 dari

ketinggian 100 cm sebanyak 1 kali. Benturan dengan energi 0,45 joule. Setelah

83
penjatuhan beban, kulit kepala dijahit kembali dengan benang chromic catgut 3-

0. Luka pada kulit kepala dirawat dan diberikan povidon iodine. Tikus diletakkan

di dalam kandang dan diobservasi hingga sadar kembali (gambar 4.3).

Gambar 4.25 Perlakuan cedera otak traumatik.

Keterangan: A.keempat ekstremitas tikus difiksasi; B. kulit kepala tikus diinsisi sagital sehingga
kranium tampak, kemudian dilakukan perlakuan cedera kepala dengan alat penjatuhan beban; C.
tampak tikus setelah dijatuhi beban; D. kulit kepala tikus dijahit kembali; E. gambaran hematom
pada kranium setelah cedera selama 3 hari setelah tikus dimatikan.

4.8.4 Pemberian Terapi Catechins

Catechins dalam bentuk bubuk dilarutkan dengan pelarut air. Terapi

catechins diberikan secara per oral melaui sonde setiap hari dengan dosis 513,

926 dan 1113 mg/kg BB/hari.

Gambar 4.26 Pemberian catechins dengan sonde.

Keterangan: Catechins yang berbentuk bubuk dilarutkan dengan 1 mL air dan dimasukkan dalam
spuit 5 mL yang dihubungkan dengan sonde, kemudian catechins diberikan peroral dengan
menggunakan sonde tersebut.

84
4.8.5 Pengukuran NSS

Gambar 4.27 Penilaian NSS

Keterangan: A. Penilaian kemampuan tikus untuk keluar dari lingkaran berdiameter 30 cm dalam
waktu 2 menit. B. Penilaian kemampuan keseimbangan pada papan berukuran 0,7x0,7 cm selama
10 detik. C. Penilaian kemampuan berjalan pada balok dengan lebar 3 cm, 2 cm, dan 1 cm. D.
Penilaian kemampuan tikus untuk bertahan pada tongkat silinder berdiameter 0,3 cm setidaknya
dengan 2 anggota gerak dalam waktu 30 detik.

NSS diukur sebanyak tiga kali untuk masing-masing tikus, yaitu (1)

sebelum perlakuan untuk memastikan tidak ada kecacatan pada tikus hewan

coba; (2) setelah pengaruh anestesi hilang, yaitu 1 jam setelah penjatuhan

beban; serta (3) setelah perlakuan sebelum hewan coba diterminasi (hari ketiga

dan ketujuh sesuai kelompok hari tikus). Penilaian NSS dijelaskan pada gambar

4.5 dan tabel 4.1.

Tabel 4.3 Penilaian NSS

Parameter Deskripsi
1. Keluar dari Tikus diletakkan pada platform
lingkaran lingkaran dengan diameter 30 cm
dan dihitung kemampuan keluar
dari papan dalam 2 menit
2. Perilaku Tikus diletakkan pada papan dan
mencari diamati adanya perilaku eksprorasi
dan mengendus pada papan
3. Monoparesis Terdapat gangguan dalam
atau menggerakkan satu (monoparesis)
hemiparesis atau dua anggota gerak
(hemiparesis). Pada normalnya,
tikus dapat menggenggam forsep
yang disentuhkan pada telapak
anggota gerak dan memegangnya
4. Berjalan lurus Tikus diletakkan pada permukaan
datar dan dilihat cara jalannya untuk
menilai kesadaran, inisisasi dan
Skor
0 = tikus dapat keluar dalam 2
menit
1 = tikus tidak keluar lingkaran
0 = terdapat perilaku mencari
1 = tidak ada perilaku mencari
0 = tikus dapat menggenggam
forsep
1 = tikus tidak dapat
menggenggam forsep
0 = tikus berjalan lurus
1 = tikus tidak berjalan lurus, baik
akibat kurang inisiasi atau

85
 kemampuan motorisnya
5. Refleks kejut Tikus dikejutkan dengan suara
tepukan, dan tampak refleks kejut
dengan melompat atau gerakan
menggerenyet
6. Balok Tikus diletakkan pada papan
keseimbangan berukuran 7 mm x 7 mm dan
diharapkan dapat seimbang pada
papan selama 10 detik
7. Berjalan pada Tes ini bertujuan untuk menilai
balok koordinasi motorik dan
keseimbangan. Terdiri dari papan
sepanjang 30 cm dengan lebar 3
cm, 2 cm, 1 cm
8. Keseimbangan Menilai keseimbangan dan
pada tongkat kekuatan genggaman dengan
silinder menggenggam stik dengan
diameter 3mm selama 30 detik
(Wu et al., 2010)
menyeret setidaknya satu anggota
gerak
0 = terdapat refleks kejut
1 = tidak ada respon
0 = tikus dapat seimbang
1 = tikus gagal seimbang
0 = tikus dapat melalui ketiga
balok
1 = tikus dapat melalui balok 3 cm
dan 2 cm
2 = tikus dapat melalui balok 3 cm
saja
3 = tikus tidak dapat melalui balok
0 = tikus dapat bertahan pada stik
silinder setidaknya pada 2
anggota gerak
1 = tikus tidak dapat bertahan

4.8.6 Pembedahan Tikus

Pembedahan tikus dilakukan dengan memberikan anestesi terlebih

dahulu. Anestesi diberikan dengan injeksi ketamine 44 mg/kgBB secara

intramuskular. Setelah tikus dipastikan tidak sadar (tidak menunjukkan gerakan

spontan), tikus diterminasi. Dilakukan pengambilan darah tikus dari aorta

abdominalis hingga tidak ada darah yang tersedot lagi. Kemudian dilakukan

pembedahan untuk mengambil jaringan otak tikus. Pembedahan tersebut

dilakukan dengan cara menggunting kranium dengan arah sagital dari kaudal

(oksipital) menuju ke rostral (frontal), tepat diantara kedua hemisfer otak tikus.

Selanjutnya dilakukan pembebasan otak tikus pada basis kranium dari jaringan

ikat sekitarnya. Bagian otak yang diambil adalah bagian serebrum.

Selanjutnya, jaringan otak dimasukkan kedalam botol yang telah diisi

larutan buffer formalin 10%. Botol yang berisi jaringan otak dan larutan formalin

tersebut selanjutnya ditutup rapat. Jaringan otak diambil dari sejajar vertex ke

anterior kemudian dibuat blok parafin. Slide dibuat dari jaringan pada blok parafin

86
(pengirisan preparat otak dan pembuatan slide dilakukan di Laboratorium

Patologi Anatomi Rumah Sakit Dr. Soetomo Surabaya). Potongan dilakukan

untuk pewarnaan imunohistokimia Bcl-2 dan Bax.

Gambar 4.28 Kranium tikus setelah pembedahan. a.Tampak hematom akibat

penjatuhan beban pada kranium. Lokasi penjatuhan pada verteks dengan hematom berada di
anterior dari lambda; b. Skema kranium tikus; c. Skema area otak tikus. Penjatuhan pada lingkaran
yang berwarna merah. Area somatosensorik berada pada area berwarna oranye dan hijau toska di
tepat anterior dari lokasi penjatuhan (lingkaran hitam)

4.8.7 Pembuatan Slide Histopatologi

Jaringan otak tikus yang telah dimasukkan dalam botol berisi buffer

formalin 10% harus segera diproses dalam waktu kurang dari 24 jam. Setelah itu,

jaringan otak dimasukkan ke Tissue Tex Processor selama 90 menit. Pada

Tissue Tex Processor, dilakukan proses dehidrasi dan clearing jaringan. Jaringan

diambil dari alat tersebut dan dilakukan block dengan menggunakan paraffin.

Setelah itu, jaringan otak dalam paraffin block dipotong menggunakan microtome

dengan ketebalan 2-3 m pada vertex. Hasil irisan dipindahkan dengan kuas

kedalam air hangat 38-400C untuk meluruskan kerutan halus yang ada. Irisan

yang terentang sempurna diambil dengan gelas obyek. Potongan terpilih

dikeringkan dan diletakkan diatas hot plate 38-400 sampai kering, selanjutnya

preparat dimasukkan dalam inkubator suhu 38-400C selama 24 jam.

87
4.8.8 Pemeriksaan Imunohistokimia

4.8.8.1 Deparafinisasi

Sebelum dideparafinasi, slide dipanaskan terlebih dahulu pada suhu 60C

selama 60 menit. Kemudian ditambah dengan larutan berikut ini secara

berurutan: xylol I, xylol II, dan xylol III, masing-masing selama 3 menit. Kemudian

slide dimasukkan dalam ethanol 100%, ethanol 90% dan berikutnya dalam

ethanol 80%, masing-masing selama 3 menit. Kemudian slide dimasukkan dalam

larutan H2O2 dalam methanol 0,5% (methanol 100 ml + H2O2 1,6 ml) selama 40

menit. Slide dicuci dengan air mengalir selama 3 menit.

4.8.8.2 Antigen Retrieval dengan Larutam DIVA

Slide direndam dengan antigen retrieval dalam larutan DIVA (180 ml

larutan akuades dan 20 ml larutan DIVA), kemudian dimasukkan ke dalam

declocking chamber. Kemudian slide didinginkan dalam suhu ruangan selama 30

menit. Slide kemudian dicuci dengan prediluted blocking serum (PBS) sebanyak

2 kali, masing-masing selama 5 menit.

4.8.8.3 Pewarnaan Imunohistokimia

Slide diletakkan ke dalam chamber, dan diberi pembatas dengan PAP

pen. Kemudian slide ditetesi dengan background sniper selama 15 menit.

Kemudian slide ditetesi dengan antibodi primer (Bax atau Bcl-2) dan diinkubasi

selama 1,5 jam. Selanjutnya slide dicuci dengan PBS sebanyak 2 kali, masing-

masing selama 5 menit. Kemudian antibodi sekunder diteteskan pada slide dan

diinkubasi selama 10 menit. Cuci kembali dengan PBS (2x5 menit). Kemudian

slide ditetesi dengan Trekavidin-Hrp label dan diinkubasi selama 10 menit.Slide

88
dicuci dengan PBS (2x5 menit). Selanjutnya slide ditetesi dengan DAB dan

diinkubasi selama 2-4 menit. Kemucian slide dicuci dengan air mengalir selama 5

menit. Lalu dilakukan counterstaining dengan meyer haematoxilin selama 3

menit dan direndam dalam lithium carbonate jenuh selama 7 menit. Slide kembali

dicuci dengan air mengalir selama 5 menit. Dehidrasi dengan alkohol 80%, 90%

dan kemudian dengan alkohol absolut, serta xylol I, II, dan III masing-masing

selama 3 menit. Terakhir, slide dilakukan mounting dengan entelan.

4.8.9 Prosedur Pembacaan Imunohistokimia

Penghitungan total sel yang mengekspresikan Bcl-2 dan Bax dilakukan

dengan metode hot-spot. Pada metode ini slide diamati dengan mikroskop

binokuler merk Olympus tipe BX51 dengan pembesaran 400x dan dilakukan

penghitungan sel yang positif pada 10 lapang pandang. Jumlah rerata sel yang

positif mengekspresikan Bcl-2 dan Bax, dengan sitoplasma yang terwarnai coklat

pada pemeriksaan imunohistokimia, dari 10 lapangan pandang tersebut dicatat

sebagai rerata ekspresi Bcl-2 dan Bax pada 1 sampel otak hewan coba. Sel yang

positif menunjukkan sitoplasma yang terwarnai coklat (Raghupathi et al., 2003)

Pengamatan dilakukan oleh peneliti dengan label pada slide yang menunjukkan

kelompok sampel yang diperiksa tidak diketahui oleh peneliti. Hasil pengamatan

dikonfirmasi oleh ahli patologi anatomi.

4.9 Alur Penelitian

Bagan alur penelitian dijelaskan pada gambar 4.5. dan 4.6.

Seleksi hewan coba (N=20), aklimatisasi selama 1 minggu

Pemeriksaan NSS sebelum penjatuhan beban
1. Hewan coba dianestesi

89
2. Kulit kepala diinsisi
3. dilakukan penjatuhan beban (kecuali pada tikus kontrol negatif)
4. kemudian luka dijahit kembali

Kelompok pemberian catechins selama 3 hari (N=20)
A3 (kontrol -) B3 (kontrol +) C3 (dosis 1) D3 (dosis 2) E3 (dosis 3)
N=4 N=4 N=4 N=4 N=4
tidak diberi tidak diberi catechins 513 catechins 926 catechins
catechins catechins mg/kgBB/hari mg/kgBB/hari 1113
mg/kgBB/hari

Pemeriksaan neurological severity score (NSS) pada hari ketiga

Tikus dikorbankan, kedua hemisfer serebri diambil dan dimasukkan ke dalam tabung
berisi buffer formalin 10%

Pembuatan slide, pewarnaan imunohistokimia, pembacaan slide

Analisis data
Gambar 4.29 Alur penelitian Kelompok Tikus Hari Ketiga

4.10 Analisis Data

Hasil penelitian ini dianalisa menggunakan program analisis statistik, IBM

SPSS (Statistical Products and Service Solutions) Statistics, version 22.0 for

windows. Dalam perhitungan hasil penelitian ini digunakan taraf kepercayaan

95% ( = 0.05).

Seleksi hewan coba (N=20), aklimatisasi selama 1 minggu

Pemeriksaan NSS sebelum penjatuhan beban
5. Hewan coba dianestesi
6. Kulit kepala diinsisi
7. dilakukan penjatuhan beban (kecuali pada tikus kontrol negatif)
8. kemudian luka dijahit kembali

Kelompok pemberian catechins selama 7 hari (N=20)
A3 (kontrol -) B3 (kontrol +) C3 (dosis 1) D3 (dosis 2) E3 (dosis 3)
N=4 N=4 N=4 N=4 N=4
tidak diberi tidak diberi catechins 513 catechins 926 catechins
catechins catechins mg/kgBB/hari mg/kgBB/hari 1113
mg/kgBB/hari

Pemeriksaan neurological severity score (NSS) pada hari ketiga

90
Tikus dikorbankan, kedua hemisfer serebri diambil dan dimasukkan ke dalam tabung
berisi buffer formalin 10%

Pembuatan slide, pewarnaan imunohistokimia, pembacaan slide

Analisis data
Gambar 4.30 Alur penelitian Kelompok Tikus Hari Ketujuh

Sebelum diuji statistik, data NSS dinilai terlebih dahulu apakah memiliki

sebaran normal dan homogen. Uji normalitas menggunakan uji Saphiro Wilk. Uji

homogenitas menggunakan uji Levene. Rerata hasil NSS masing-masing

kelompok pada hari ketiga maupun hari ketujuh akan dianalisis secara terpisah.

Jika sebaran data normal dan varian data homogen, digunakan uji hiptesis

Oneway ANOVA dan uji post hoc Tukey, sedangkan, jika tidak memenuhi

sebaran data normal dan varian homogen digunakan uji Kruskal Wallis.

Kemudian untuk menilai perlakuan yang menunjukkan perbedaan, dilakukan uji

Mann Whitney.

Sebelum dilakukan uji statistik, data dinilai sebaran dan varian datanya. Uji

normalitas sebaran data menggunakan uji Saphiro Wilk dan uji homogenitas

variasi data menggunakan uji Levene. Ekspresi Bcl-2 dan Bax baik hari ketiga

maupun hari ketujuh akan dianalisis secara terpisah. Jika sebaran data normal

dan varian data homogen, digunakan uji hipotesis Oneway ANOVA, dengan uji

post hoc Tukey. Jika sebaran data tidak normal dan atau variasi data tidak

homogen digunakan uji Kruskal Wallis dan uji Mann Whitney.

Rata-rata rasio ekspresi Bcl-2/Bax pada masing-masing kelompok juga

diukur normalitas dan homogenitasnya. Apabila data normal dan homogen,

digunakan uji hipotesis Oneway ANOVA, dengan uji post hoc Tukey. Jika tidak

memenuhi sebaran data normal dan varian homogen digunakan uji Kruskal

91
Wallis. Kemudian untuk menilai perlakuan yang menunjukkan perbedaan,

dilakukan uji Mann Whitney.

Pada data yang normal dan homogen, dilakukan uji korelasi Pearson untuk

mengetahui hubungan dosis pemberian catechins dengan rasio ekspresi Bcl-

2/Bax, serta untuk mengetahui hubungan dosis pemberian catechins dengan

NSS. Kemudian untuk dilakukan analisis regresi menilai kontribusi catechins

pada keragaman Bcl-2/Bax dan untuk menilai kontribusi catechins pada

keragaman NSS. Apabila data tidak normal atau tidak homogen, dilakukan uji

korelasi data Spearman untuk mengetahui kekuatan hubungan catechins dengan

rasio ekspresi Bcl-2/Bax.

92
 BAB 5

HASIL PENELITIAN

5.1 Overview Penelitian

Peneltian dilakukan pada bulan Juni hingga Agustus 2016 di

Laboratorium Fisiologi dan Laboratorium Patologi Anatomi Fakultas Kedokteran

Universitas Brawijaya, serta Laboratorium Patologi Anatomi Rumah Sakit Dr.

Soetomo Surabaya. Penelitian ini merupakan true experimental design secara in

vivo pada laboratorium dengan randomized post test only controlled group

design pada hewan coba tikus (Rattus norvegicus) galur wistar. Strategi

penelitian berupa penjatuhan beban pada jaringan otak tikus model cedera otak

traumatik, selanjutnya diukur rasio Bcl-2/Bax berdasarkan pengamatan ekspresi

Bcl-2 dan Bax dengan imunohistokimia, serta status fungsional tikus dengan

NSS.

Digunakan 40 ekor hewan coba tikus (Rattus norvegicus) galur wistar

yang terbagi menjadi 2 kelompok hari pengamatan (hari ketiga dan hari ketujuh).

Setiap kelompok hari pengamatan masing-masing dibagi menjadi 5 kelompok

perlakuan, sehingga total terdapat 10 kelompok. Tiap kelompok terdiri dari 4 ekor

tikus. Kelima kelompok tersebut adalah kelompok A atau kelompok kontrol

negatif (tikus yang tidak diberikan perlakuan cedera otak traumatik maupun

catechins), kelompok B atau kelompok kontrol positif (model cedera otak

traumatik tanpa diberi catechins), kelompok C (kelompok model cedera otak

traumatik dan diberi catechins 513 mg/kg/BB/hari peroral selama 3 dan 7 hari),

kelompok D (kelompok model cedera otak traumatik dan diberi catechins 926

mg/kg/BB/hari peroral selama 3 dan 7 hari), dan kelompok E (kelompok model

93
cedera otak traumatik dan diberi catechins 1113 mg/kg/BB/hari peroral selama 3

dan 7 hari).

Status fungsional tikus dievaluasi sebelum dan setelah perlakuan model

cedera otak traumatik dan setelah perlakuan selama 3 dan 7 hari. Pengamatan

ekspresi Bax dan Bcl-2 pada jaringan otak tikus wistar dilakukan setelah

perlakuan selama 3 dan 7 hari. Ekspresi Bax dan Bcl-2 dievaluasi dengan

menggunakan metode imunohistokimia. Setelah dilakukan pengecatan, jaringan

otak tikus wistar diamati menggunakan mikroskop dengan pembesaran 400x. Sel

yang mengekspresikan Bax akan menunjukkan sitoplasma berwarna coklat,

begitupula dengan sel yang mengekspresikan Bcl-2 akan menunjukkan

sitoplasma berwarna coklat. Pengukuran dilakukan dengan metode hot spot,

yaitu menghitung rerata sel yang mengekspresikan Bax dari 10 lapang pandang

dari tiap sampel, sehingga total lapang pandang yang dievaluasi adalah 10

(lapang pandang) x 4 (pengulangan) x 5 (kelompok) x 2 (hari pengamatan) = 400

lapang pandang. Metode yang sama dilakukan untuk pengukuran sel yang

mengekspresikan Bcl-2. Selanjutnya Bax dan Bcl-2 disajikan dalam bentuk rasio

Bcl-2/Bax.

Hasil pengamatan didokumentasikan, dicatat dan selanjutnya, dilakukan

analisis data menggunakan program analisis statistik, IBM SPSS (Statistical

Products and Service Solutions) versi 22.0 untuk windows. Dalam perhitungan

hasil penelitian ini digunakan taraf kepercayaan 95% ( = 0,05).

5.2 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Hasil NSS Tikus Wistar

Model Cedera Otak Traumatik

Evaluasi status fungsional otak tikus dilakukan dengan menggunakan

pengukuran NSS. NSS merupakan skala numerik, dengan 0 adalah nilai

94
terendah (derajat keparahan terkecil) dan 10 adalah nilai tertinggi (derajat

keparahan terbesar).

5.2.1 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Hasil NSS Tikus Wistar

Model Cedera Otak Traumatik Hari Ketiga

1 jam setelah cedera kepala, didapatkan NSS rata-rata dari tikus model

cedera otak traumatik berkisar antara 3-4 (cedera kepala ringan). Dari tabel 5.1

dan gambar 5.1, diketahui bahwa kelompok kontrol negatif memiliki NSS normal

dan kelompok kontrol positif memiliki rerata nilai terbesar pada hari ketiga.

Kelompok kontrol positif mengalami peningkatan NSS pada hari ketiga

dibandingkan NSS jam pertama, menunjukkan perburukan klinis. Semua

kelompok perlakuan yang diberi catechins mengalami penurunan nilai NSS,

menunjukkan perbaikan klinis. Tidak ada perbedaan NSS pada kelompok kontrol

negatif.

Tabel 5.4 Nilai Rerata dan Standar Deviasi NSS Tikus Model Cedera Otak
Traumatik pada Hari Ketiga
Hari 0 Hari-3
Kelompok Nilai Rerata Nilai Rerata N Signifikansi p.
Standar Deviasi Standar Deviasi
A3 00 00 4
B3 3.25 1.25 4.25 1.25 4
C3 3 0.82 1.75 0.5 4 0.000*
D3 4 1.41 3 0.81 4
E3 3.25 1.25 2.5 0.57 4
Keterangan:
1. Nilai rerata: hasil rerata dari 4 pengulangan
2. N: jumlah sampel
3. Kelompok A3 : tikus yang tidak diberikan perlakuan cedera otak traumatik
maupun catechins
4. Kelompok B3: model cedera otak traumatik tanpa diberi catechins
5. Kelompok C3:model cedera otak traumatik dan diberi catechins 513 mg/kg bb
perhari secara peroral selama 3 hari
6. Kelompok D3: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 926 mg/kg bb
perhari secara peroral selama 3 hari
7. Kelompok E3: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 1113 mg/kg bb
perhari secara peroral selama 3 hari
8. Nilai signifikansi p didapatkan melalui uji ANOVA, dimana p<0.05 menunjukkan
H0 ditolak dan terdapat beda antar perlakuan (*)

95
 Sebelum diuji statistik, dilakukan uji asumsi pada set data dengan uji

normalitas dan homogenitas. Pada hasil uji normalitas data menggunakan

Saphiro Wilk, didapatkan p=0.112 (p>0.05), sehingga data NSS hari ketiga

berdistribusi normal. Hasil pengujian homogenitas data Levene menunjukkan

nilai p=0.138 (p>0.05), sehingga data NSS hari ketiga diinterpretasikan memiliki

ragam data homogen. Karena syarat uji asumsi data terpenuhi, selanjutnya

dilakukan uji parametrik dengan one way ANOVA (tabel 5.1).

Tabel 5.5 Hasil Uji Post Hoc Tukey pada NSS Tikus Wistar Model Cedera
Otak Traumatik pada Hari Ketiga
Variable 1 Variable 2 Signifikansi Keterangan
A3 B3 0.000* Berbeda Signifikan
C3 0.034* Berbeda Signifikan
D3 0.000* Berbeda Signifikan
E3 0.002* Berbeda Signifikan
B3 C3 0.002* Berbeda Signifikan
D3 0.184 Tidak Berbeda Signifikan
E3 0.034* Berbeda Signifikan
C3 D3 0.184 Tidak Berbeda Signifikan
E3 0.632 Tidak Berbeda Signifikan
D3 E3 0.877 Tidak Berbeda Signifikan
Keterangan: A3: Kontrol Negatif; B3: Kontrol Positif; C3: catechins dosis 513
mg/kgBB/hari; D3: catechins dosis 926 mg/kgBB/hari; E3: catechins dosis 1113
mg/kgBB/hari.
*kelompok yang memiliki perbedaan yang bermakna (signifikan) (p<0.05)

Uji ANOVA NSS hari ketiga dilakukan untuk mengetahui adanya

perbedaan antara kelompok perlakuan yang diamati secara keseluruhan. Hasil

uji ANOVA menunjukkan nilai p=0.000 (p<0.05), sehingga disimpulkan terdapat

perbedaan signifikan NSS antara kelompok perlakuan yang diamati pada hari

ketiga. Untuk mengetahui kelompok mana yang berbeda secara spesifik,

dilakukan uji Post Hoc Tukey (tabel 5.2).

Dari tabel 5.2 dan gambar 5.1, diketahui bahwa kontrol negatif memiliki

perbedaan signifikan dengan semua kelompok perlakuan lainnya (p<0.05).

Kontrol positif memiliki perbedaan signifikan dengan kelompok perlakuan dosis

513 dan 1113 mg/kgBB/hari tetapi tidak memiliki perbedaan bermakna dengan

96
kelompok dosis 926 mg/kgBB/hari. Tidak terdapat perbedaan yang bermakna

antar kelompok dosis pemberian catechins.

Gambar 5.31 Keparahan cedera kepala berdasarkan NSS pada tikus model
cedera otak traumatik hari ketiga.
Keterangan: Grafik biru muda menunjukkan NSS 1 jam setelah cedera kepala,
sedangkan grafik biru tua menunjukkan NSS hari ketiga. Kelompok yang berbeda
signifikan berdasarkan uji ANOVA (p<0.05) ditandai dengan notasi yang berbeda.
Kelompok dengan rerata terkecil memiliki notasi huruf yang lebih awal. A: Kontrol Negatif;
B: Kontrol Positif; C: Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari; D: Catechins dosis 926
mg/kgBB/hari; E: Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari.

5.2.2 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Hasil NSS Tikus Wistar

Model Cedera Otak Traumatik pada Hari Ketujuh

Pada hari ketujuh, kelompok kontrol negatif tetap memiliki NSS normal.

Kontrol positif menunjukkan peningkatan NSS, menunjukkan adanya perberatan

klinis. Pada semua kelompok perlakuan yang diberikan catechins, terjadi

penurunan NSS, menunjukkan adanya perbaikan klinis. Penurunan nilai NSS

terbesar ditunjukkan pada kelompok yang diberi catechins dengan dosis terbesar

(1113 mg/kgBB/hari) (tabel 5.3 dan gambar 5.2).

Dilakukan uji asumsi pada set data sebelum diuji statistik untuk menilai

distribusi dan ragam data. Berdasarkan uji normalitas Saphiro Wilk didapatkan

hasil p=0.018 (p>0.05), sehingga disimpulkan distribusi data tidak normal.

97
Karena uji asumsi distribusi data tidak terpenuhi, maka dilakukan uji non

parametrik Kruskal Wallis untuk mengetahui adanya perbedaan antara kelompok

perlakuan yang diamati secara keseluruhan. Hasil uji beda Kruskal Wallis

menunjukkan nilai p=0.002 (p<0.05), sehingga disimpulkan terdapat perbedaan

yang signifikan antara kelompok perlakuan yang diamati terhadap NSS pada hari

ketujuh (tabel 5.3).

Tabel 5.6 Nilai Rerata dan Standar Deviasi NSS Tikus Model Cedera Otak
Traumatik pada Hari Ketujuh
Hari 0 Hari-7
Kelompo Nilai Rerata Nilai Rerata N Signifikans
k Standar Deviasi Standar Deviasi i
p.
A7 00 00 4
B7 3.25 0.5 5 0.82 4
C7 3.25 0.5 1.75 0.5 4 0.002*
D7 3.75 0.95 2.25 0.5 4
E7 4 1.63 1.25 0.5 4
Keterangan:
1. Nilai rerata: hasil rerata dari 4 pengulangan
2. N: jumlah sampel
3. Kelompok A7 : tikus yang tidak diberikan perlakuan cedera otak traumatik
maupun catechins
4. Kelompok B7: model cedera otak traumatik tanpa diberi catechins
5. Kelompok C7:model cedera otak traumatik dan diberi catechins 513 mg/kg bb
perhari secara peroral selama 7 hari
6. Kelompok D7: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 926 mg/kg bb
perhari secara peroral selama 7 hari
7. Kelompok E7: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 1113 mg/kg bb
perhari secara peroral selama 7 hari
8. Nilai signifikansi p didapatkan melalui uji Kruskal Wallis, dimana p<0.05
menunjukkan H0 ditolak dan terdapat beda antar perlakuan (*)

Untuk mengetahui kelompok mana yang berbeda signifikan secara statistik,

dilakukan uji Mann Whitney (tabel 5.4 dan gambar 5.2). Kelompok kontrol negatif

menunjukkan beda signifikan dengan kelompok-kelompok lainnya. Terdapat

perbedaan NSS yang signifikan antara kelompok model cedera otak traumatik

yang mendapat catechins, baik pada dosis 523, 926, maupun 1113 mg/kgBB/hari

dibandingkan yang tidak mendapat catechins (kontrol positif). Tidak ada

perbedaan NSS yang bermakna antara kelompok perlakuan yang mendapatkan

98
catechins dengan dosis 513 mg/kgBB/hari dengan dosis 926 mg/kgBB/hari,

maupun 1113 mg/kgBB/hari. Tetapi, terdapat perbedaan signifikan NSS antara

kelompok dosis 926 mg/kgBB/hari dengan dosis 1113 mg/kgBB/hari.

Tabel 5.7 Hasil Uji Mann Whitney NSS Tikus Wistar Model Cedera Otak
Traumatik pada Hari Ketujuh
Variabel 1 Variabel 2 Signifikansi Keterangan
A7 B7 0.013* Berbeda Signifikan
C7 0.011* Berbeda Signifikan
D7 0.011* Berbeda Signifikan
E7 0.011* Berbeda Signifikan
B7 C7 0.017* Berbeda Signifikan
D7 0.017* Berbeda Signifikan
E7 0.017* Berbeda Signifikan
C7 D7 0.186 Tidak Berbeda Signifikan
E7 0.186 Tidak Berbeda Signifikan
D7 E7 0.040* Berbeda Signifikan
Keterangan: A3: Kontrol Negatif; B3: Kontrol Positif; C3: catechins dosis 513
mg/kgBB/hari; D3: catechins dosis 926 mg/kgBB/hari; E3: catechins dosis 1113
mg/kgBB/hari.
* kelompok yang memiliki perbedaan yang bermakna (signifikan) (p<0.05)

Gambar 5.32 Grafik histogram rerata NSS tikus model cedera otak
traumatik hari ketujuh
Keterangan: Grafik warna oranye muda menunjukkan NSS 1 jam setelah cedera kepala,
sedangkan warna oranye tua menunjukkan NSS pada hari ketujuh. Kelompok dengan
beda yang signifikan berdasarkan uji Mann Whitney (p<0.05) ditandai dengan notasi
yang berbeda. Kelompok dengan rerata terkecil memiliki notasi huruf yang lebih awal.
Kelompok dengan rerata terkecil memiliki notasi huruf yang lebih awal. A: Kontrol Negatif;
B: Kontrol Positif; C: Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari; D: Catechins dosis 926
mg/kgBB/hari; E: Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari.

99
5.3 Hubungan Dosis Pemberian Catechins dengan NSS Tikus Wistar
Model Cedera Otak Traumatik

5.3.1 Hubungan Dosis Pemberian Catechins dengan NSS Tikus Wistar

Model Cedera Otak Traumatik Hari Ketiga

Pada kelompok 3 hari, dilakukan uji korelasi data parametrik Pearson

untuk mengetahui hubungan antara dosis pemberian catechins dengan NSS

pada hari ketiga. Uji korelasi Pearson menunjukkan nilai p=0.088, sehingga

disimpulkan tidak terdapat hubungan yang signifikan antara hasil NSS dengan

dosis pemberian catechins pada tikus model cedera otak traumatik pada hari

ketiga. Besar koefisien korelasi Pearson, (R)=-0.441, artinya hubungan antara

NSS dengan dosis pemberian catechins memiliki arah negatif dan kekuatan

0.441. Artinya, semakin tinggi dosis catechins, maka semakin rendah NSS pada

tikus model cedera otak traumatik. Koefisien korelasi sebesar 0.441

menunjukkan kekuatan korelasi sedang. Terakhir, dilakukan uji regresi linier, dan

didapatkan hasil nilai R2 = 0.194 dengan persamaan garis:

Y = nilai NSS
X = dosis catechins
Y = 3.642 - 0.001X
3.642 = konstanta
0.001 = koefisien regresi

Koefisien determinasi (R2) adalah ukuran ketepatan atau kecocokan garis

regresi. Selain itu, R2 juga dapat digunakan untuk mengukur besar proporsi

keragaman total yang dapat dijelaskan oleh garis regresi. Hasil pengujian nilai

R2=0.194 menjelaskan bahwa variasi dosis catechins berkontribusi dalam

keragaman variabel NSS sebesar 19.4%. 80.6% lainnya disumbangkan oleh

variabel lainnya yang tidak dimasukkan ke dalam persamaan ini. Besar koefisien

regresi adalah sebesar -0,001, artinya setiap peningkatan dosis 1 mg/kgBB/hari

catechins akan menurunkan NSS sebanyak 0,001.

100
5.3.2 Hubungan Dosis Pemberian Catechins dengan NSS Tikus Wistar
Model Cedera Otak Traumatik Hari Ketujuh

Pada kelompok hari ketujuh dilakukan uji korelasi data non parametrik

Spearman, untuk mengetahui hubungan antara dosis pemberian catechins

dengan NSS. Hasil uji korelasi Spearman menunjukkan nilai p = 0.001, maka

disimpulkan bahwa terdapat hubungan yang signifikan antara NSS dengan dosis

pemberian catechins pada tikus model cedera otak traumatik. Didapatkan

koefisien korelasi Spearman (R) sebesar -0.754. Artinya, dosis pemberian

catechins memiliki hubungan dengan arah negatif dan kekuatan korelasi kuat

terhadap NSS. Semakin tinggi dosis catechins, maka semakin rendah NSS pada

tikus model cedera otak traumatik.

5.4 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Ekspresi Bax pada Tikus

Wistar Model Cedera Otak Traumatik

Banyaknya neuron yang mengekspresikan Bax (sitoplasma terwarnai

coklat) dihitung menggunakan mikroskop pembesaran 400x sebanyak 10 lapang

pandang dengan pengulangan sebanyak 4 kali setiap kelompok. Selanjutnya

dilakukan analisis statistik.

5.4.1 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Ekspresi Bax pada Tikus

Wistar Model Cedera Otak Traumatik Hari Ketiga

Gambar 5.3 menunjukkan ekspresi Bax pada jaringan otak hari ketiga.

Didapatkan bahwa neuron yang mengekspresikan Bax memilki sitoplasma yang

berwarna coklat. Kelompok model cedera otak traumatik menunjukkan lebih

banyak sel yang mengekspresikan Bax, dibandingkan dengan kelompok tanpa

perlakuan cedera kepala. Rerata jumlah neuron yang mengekspresikan Bax

disajikan pada tabel 5.5 dan gambar 5.5.

101
 Uji prasyarat terlebih dahulu dilakukan untuk menilai distribusi dan varian

data ekspresi Bax. Berdasarkan uji normalitas (Saphiro Wilk), didapatkan nilai

signifikansi Bax pada hari ketiga sebesar 0.008 (<0.05), sehingga data tidak

berdistribusi normal. Pada uji homogenitas (Levene) Bax hari ketiga, didapatkan

nilai signifikansi 0.566 (>0.05), sehingga data memiliki ragam homogen. Karena

uji prasyarat tidak terpenuhi, selanjutnya dilakukan uji statistik non parametrik

menggunakan uji Kruskal Wallis (tabel 5.5).

Dari tabel 5.5 dan grafik pada gambar 5.5, diketahui bahwa kelompok

kontrol negatif memiliki ekspresi Bax yang paling kecil dan sebaliknya, kontrol

positif memiliki ekspresi Bax yang paling besar pada hari ketiga. Pada kelompok

kontrol positif terjadi peningkatan ekspresi Bax sebanyak 429.41% dibandingkan

kelompok kontrol negatif. Pada kelompok yang diberi catechins, terdapat

penurunan jumlah ekspresi Bax yang nyata dibandingkan kelompok kontrol

positif namun ekspresi Bax yang ditunjukkan relatif sama, baik pada dosis 513,

926, maupun 1113 mg/KgBB/hari, yaitu sebesar 37.43-42.91%.

Tabel 5.8 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Ekspresi Bax Jaringan Otak
Tikus Wistar Model pada Kepala Traumatik pada Hari Ketiga
Kelompo Signifikansi p
Nilai Rerata Standar Deviasi (sel/Lp) N
k
A3 4.925 1.05 4
B3 26.1 0.85 4
C3 15.3 0.85 4 0.002*
D3 16.325 0.86 4
E3 14.9 0.12 4
Keterangan:
1. Nilai rerata: jumlah semua hasil pemeriksaan dibagi dengan banyaknya sampel
pemeriksaan pada pengamatan 10 lapang pandang (sel/Lp).
2. N: jumlah sampel.
3. Kelompok A3: tikus yang tidak diberikan perlakuan cedera otak traumatik
maupun catechins pengamatan pada hari ketiga
4. Kelompok B3: model cedera otak traumatik tanpa diberi catechins pengamatan
pada hari ketiga
5. Kelompok C3:model cedera otak traumatik dan diberi catechins 513 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 3 hari
6. Kelompok D3: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 926 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 3 hari

102
 7. Kelompok E3: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 1113 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 3 hari
8. Nilai signifikansi p didapatkan melalui uji Kruskal Wallis, dimana p<0.05
menunjukkan H0 ditolak dan terdapat beda antar perlakuan (*).

Berdasarkan hasil uji beda Kruskall Wallis, didapatkan p-value sebesar

0.002. Karena p<0.05, maka Ho ditolak dan dapat disimpulkan bahwa terdapat

perbedaan yang signifikan antar perlakuan (tabel 5.5). Selanjutnya, dilakukan uji

uji Mann Whitney untuk mengetahui kelompok perlakuan yang menunjukkan

adanya perbedaan tersebut (tabel 5.6 dan gambar 5.5).

Tabel 5.9 Hasil Uji Mann Whitney Ekspresi Bax pada Neuron Tikus Model
Cedera Otak Traumatik pada Hari Ketiga
Variabel 1 Variabel 2 Signifikansi Keterangan
A3 B3 0.021* Berbeda Signifikan
C3 0.021* Berbeda Signifikan
D3 0.021* Berbeda Signifikan
E3 0.020* Berbeda Signifikan
B3 C3 0.021* Berbeda Signifikan
D3 0.021* Berbeda Signifikan
E3 0.020* Berbeda Signifikan
C3 D3 0.043* Berbeda Signifikan
E3 0.189 Tidak Berbeda Signifikan
D3 E3 0.020* Berbeda Signifikan
Keterangan: A3: Kontrol Negatif; B3: Kontrol Positif; C3: catechins dosis 513
mg/kgBB/hari; D3: catechins dosis 926 mg/kgBB/hari; E3: catechins dosis 1113
mg/kgBB/hari.
* kelompok yang memiliki perbedaan yang bermakna (signifikan) (p<0.05).
Berdasarkan uji Mann Whitney pada hari ketiga, didapatkan beda

signifikan (p<0.05) ekspresi Bax pada kelompok kontrol dengan semua kelompok

perlakuan (tabel 5.6). Pada kelompok perlakuan, tidak ada beda signifikan antara

kelompok yang mendapatkan catechins dosis 926 mg/kgBB/hari dengan

kelompok catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari (p>0.05).

5.4.2 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Ekspresi Bax pada Tikus

Wistar Model Cedera Otak Traumatik Hari Ketujuh

Seperti pada hari ketiga, kelompok kontrol negatif memiliki rerata ekspresi

Bax yang paling sedikit dan sebaliknya kelompok kontrol positif memiliki ekspresi

Bax yang paling banyak. Peningkatan ekspresi Bax pada kontrol positif sebesar

103
226.25% dibandingkan kontrol negatif. Pada kelompok yang diberikan catechins,

ekspresi Bax terbesar pada dosis catechins terkecil (513 mg/kgBB/hari). Dengan

pemberian catechins, terjadi penurunan ekspresi Bax sebesar 18.63-28.82%

dibandingkan kontrol positif (gambar 5.5).

Gambar 5.33 Ekspresi Bax dengan pewarnaan imunohistokimia pada

korteks serebri tikus cedera otak traumatik pada hari ketujuh. Neuron dengan
ekspresi Bax positif ditunjukkan dengan panah merah (sitoplasma berwarna coklat),
sedangkan neuron dengan ekspresi Bax negatif ditunjukkan dengan panah putih
(sitoplasma berwarna biru). Garis skala pada pojok kanan bawah menunjukkan 25 m.
A7 (kontrol negatif); B7 (kontrol positif); C7 (dosis catechins 513 mg/kgBB); D7 (dosis
catechins 926 mg/kgBB); E7 (dosis catechins 1113 mg/kgBB).
Tabel 5.10 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Ekspresi Bax Jaringan Otak
Tikus Wistar Model pada Kepala Traumatik pada Hari Ketujuh
Kelompo Signifikansi p
Nilai Rerata Standar Deviasi (sel/Lp) N
k
A7 5.175 0.33 4
B7 16.9 1.1 4
C7 13.75 0.31 4 0.001*
D7 12.925 0.095 4
E7 12.025 0.095 4
Keterangan:
1. Nilai rerata: jumlah semua hasil pemeriksaan dibagi dengan banyaknya sampel
pemeriksaan pada pengamatan 10 lapang pandang (sel/Lp)
2. N: jumlah sampel
3. Kelompok A7: tikus yang tidak diberikan perlakuan cedera otak traumatik
maupun catechins pengamatan pada hari ketujuh

104
 4. Kelompok B7: model cedera otak traumatik tanpa diberi catechins pengamatan
pada hari ketujuh
5. Kelompok C7:model cedera otak traumatik dan diberi catechins 513 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 7 hari
6. Kelompok D7: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 926 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 7 hari
7. Kelompok E7: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 1113 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 7 hari
8. Nilai signifikansi p didapatkan melalui uji Kruskal Wallis, dimana p<0.05
menunjukkan H0 ditolak dan terdapat beda antar perlakuan (*)
Sebelum dilakukan uji statistik, dilakukan uji prasyarat terlebih dahulu

untuk menilai distribusi dan varian data rerata ekspresi Bax pada hari ketujuh.

Pada uji normalitas Shapiro Wilk didapatkan nilai signifikansi 0.008 (<0.05),

sehingga data ekspresi Bax hari ketujuh tidak berdistribusi normal. Berdasarkan

uji homogenitas Levene didapatkan nilai signifikansi sebesar 0.137 (>0.05)

sehingga data ekspresi Bax hari ketujuh memiliki ragam homogen. Karena uji

persyaratan normalitas tidak terpenuhi, selanjutnya digunakan uji statistik non

parametrik Kruskall Wallis.

Berdasarkan hasil uji beda Kruskall Wallis, didapatkan p-value sebesar

0.001 (tabel 5.7). Karena p <0,05, maka Ho ditolak dan disimpulkan terdapat

perbedaan yang signifikan antar perlakuan. Selanjutnya, dilakukan uji

perbandingan berganda Mann Whitney untuk mengetahui kelompok spesifik

yang menunjukkan adanya perbedaan tersebut. Berdasarkan uji Mann Whitney,

didapatkan perbedaan signifikan ekspresi Bax pada semua kelompok hari

ketujuh (p<0.05) (tabel 5.8 dan gambar 5.5).

Tabel 5.11 Hasil Uji Mann Whitney pada Ekspresi Imunohistokimia Bax pada
Neuron Post Cedera OtakTraumatik Ketujuh
Variabel 1 Variabel 2 Signifikansi Keterangan
A7 B7 0.021* Berbeda Signifikan
C7 0.021* Berbeda Signifikan
D7 0.020* Berbeda Signifikan
E7 0.020* Berbeda Signifikan
B7 C7 0.021* Berbeda Signifikan
D7 0.020* Berbeda Signifikan
E7 0.020* Berbeda Signifikan
C7 D7 0.020* Berbeda Signifikan
E7 0.020* Berbeda Signifikan

105
 D7 E7 0.019* Berbeda Signifikan
Keterangan: A3: Kontrol Negatif; B3: Kontrol Positif; C3: catechins dosis 513
mg/kgBB/hari; D3: catechins dosis 926 mg/kgBB/hari; E3: catechins dosis 1113
mg/kgBB/hari.
* kelompok yang memiliki perbedaan yang bermakna (signifikan) (p<0.05).

Gambar 5.5 merupakan grafik histogram yang menunjukkan besar

ekspresi Bax pada hari ketiga dan ketujuh. Kelompok kontrol negatif

menunjukkan ekspresi Bax yang paling sedikit dan kelompok kontrol positif

menunjukkan ekspresi Bax yang paling banyak. Baik kelompok kontrol negatif

maupun positif berbeda signifikan dengan semua kelompok (ditunjukkan dengan

notasi yang berbeda dengan notasi kelompok lainnya). Pada hari ketujuh,

ekspresi Bax lebih sedikit dibandingkan hari ketiga pada kelompok kontrol positif.

Dengan pemberian catechins, terdapat penurunan ekspresi Bax, tetapi

penurunan ekspresi Bax tidak dapat mencapai jumlah ekspresi Bax pada

kelompok kontrol negatif. Penurunan ekspresi Bax pada kelompok perlakuan

yang diberi catechins pada hari ketiga lebih besar dibandingkan hari ketujuh

terhadap kelompok kontrol positif.

Gambar 5.34 Grafik histogram rata-rata ekspresi imunohistokimia Bax pada

neuron post cedera kepala traumatik kelompok kontrol dan perlakuan pada
hari ketiga dan ketujuh
Keterangan:

106
Grafik biru menunjukkan kelompok hari ketiga dan grafik oranye menunjukkan kelompok
hari ketujuh. A: Kontrol Negatif; B: Kontrol Positif; C: catechins dosis 513 mg/kgBB/hari;
D: catechins dosis 926 mg/kgBB/hari; E: catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari.
Kelompok yang menunjukkan beda yang signifikan (p<0.05) berdasarkan uji Mann
Whitney ditandai dengan notasi yang berbeda sesuai hasil pada tabel 5.6 dan 5.8.
Kelompok dengan rerata terkecil memiliki notasi huruf yang lebih awal.

5.5 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Ekspresi Bcl-2 pada Tikus

Wistar Model Cedera Otak Traumatik

Banyaknya neuron yang mengekspresikan Bcl-2 (sitoplasma terwarnai

coklat) dihitung menggunakan mikroskop pembesaran 400x sebanyak 10 lapang

pandang untuk tiap slide (gambar 5.4 untuk ekspresi Bcl-2 hari ketiga dan

gambar 5.6 untuk ekspresi Bcl-2 hari ketujuh). Selanjutnya, tiap kelompok

dihitung reratanya dan dianalisis statistik.

5.5.1 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Ekspresi Bcl-2 pada Tikus

Wistar Model Cedera Otak Traumatik Hari Ketiga

Pada hari ketiga, didapatkan ekspresi Bcl-2 menurun dengan perlakuan

cedera otak traumatik, terutama pada kontrol negatif. Dengan pemberian

catechins, tampak adanya peningkatan ekspresi Bcl-2 pada neuron (gambar

5.6).

107
Gambar 5.35 Ekspresi Bcl-2 dengan pewarnaan imunohistokimia pada
korteks serebri tikus cedera otak traumatik pada hari ketiga. Neuron dengan
ekspresi Bcl-2 ditunjukkan dengan panah merah, (sitoplasma neuron yang
mengekspresikan Bcl-2 terwarnai coklat) sedangkan neuron tanpa ekspresi Bax
ditunjukkan dengan panah putih (sitoplasma berwarna biru). Garis skala pada pojok
kanan bawah menunjukkan 25 m. A3 (kontrol negatif); B3 (kontrol positif); C3 (dosis
catechins 513 mg/kgBB); D3 (dosis catechins 926 mg/kgBB); E3 (dosis catechins 1113
mg/kgBB).

Sebelum uji statistik, dilakukan uji prasyarat untuk menilai distribusi dan

variasi data ekspresi Bcl-2 pada hari ketiga. Hasil dari uji normalitas Shapiro Wilk

didapatkan nilai signifikansi sebesar 0.260 (>0.05) sehingga data Bcl-2 hari

ketiga berdistribusi normal. Berdasarkan uji homogenitas Levene didapatkan nilai

signifikansi sebesar 0.878 (>0.05), sehingga data ekspresi Bcl-2 hari ketiga

memiliki ragam homogen. Karena uji prasyarat terpenuhi, selanjutnya uji statistik

dilakukan menggunakan uji parametrik one way ANOVA.

Tabel 5.12 Nilai Rata-rata dan Standar Deviasi Ekspresi Bcl-2 Jaringan Otak
Tikus Wistar Model pada Kepala Traumatik pada Hari Ketiga
Kelompok Nilai Rerata Standar Deviasi (Sel/Lp) N Signifikansi p

108
 A3 16 4.25 4
B3 7.95 2.24 4
C3 11.225 3.5 4 0.066
D3 12.225 3.8 4
E3 12.075 3.13 4
Keterangan:
1. Nilai rerata: jumlah semua hasil pemeriksaan dibagi dengan banyaknya sampel
pemeriksaan pada pengamatan 10 lapang pandang (sel/Lp)
2. N: jumlah sampel
3. Kelompok A3: tikus yang tidak diberikan perlakuan cedera otak traumatik
maupun catechins pengamatan pada hari ketiga
4. Kelompok B3: model cedera otak traumatik tanpa diberi catechins pengamatan
pada hari ketiga
5. Kelompok C3:model cedera otak traumatik dan diberi catechins 513 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 3 hari
6. Kelompok D3: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 926 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 3 hari
7. Kelompok E3: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 1113 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 3 hari
8. Nilai signifikansi p didapatkan melalui uji one way ANOVA pada hari ketiga dimana p>0.05
menunjukkan H0 diterima dan tidak terdapat beda signifikan antar perlakuan

Uji beda one way ANOVA menunjukkan p-value sebesar 0.066 (p0.05),

sehingga tidak terdapat perbedaan signifikan antar perlakuan (tabel 5.9).

Peningkatan ekspresi Bcl-2 dengan pemberian catehins tidak berbeda bermakna

secara statistik. Karena tidak terdapat perbedaan signifikan, uji analisa statistik

berhenti pada tahapan ini.

5.5.2 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Ekspresi Bcl-2 pada Tikus

Wistar Model Cedera Otak Traumatik Hari Ketujuh

Pada hari ketujuh, rerata tertinggi ekspresi Bcl-2 adalah pada kelompok

kontrol negatif dan terendah pada kontrol positif (tabel 5.10). Penurunan rerata

ekspresi Bcl-2 pada kelompok kontrol positif terjadi sebesar 21,29%

dibandingkan dengan kontrol negatif (gambar 5.8). Dengan pemberian catechins,

terjadi peningkatan ekspresi Bcl-2 sebesar 18,63-28,82% pada hari ketujuh.

109
Gambar 5.36 Ekspresi Bcl-2 dengan pewarnaan imunohistokimia pada
korteks serebri tikus cedera otak traumatik pada hari ketujuh. Neuron dengan
ekspresi Bcl-2 positif ditunjukkan dengan panah merah (sitoplasma neuron yang
mengekspresikan Bcl-2 terwarnai coklat), sedangkan neuron tanpa ekspresi Bcl-2 negatif
ditunjukkan dengan panah putih (sitoplasma berwarna biru). Garis skala pada pojok
kanan bawah menunjukkan 25 m. A7 (kontrol negatif); B7 (kontrol positif); C7 (dosis
catechins 513 mg/kgBB); D7 (dosis catechins 926 mg/kgBB); E7 (dosis catechins 1113
mg/kgBB).

Sebelum dilakukan uji statistik, dilakukan uji prasyarat untuk menilai

distribusi dan variasi data ekspresi Bcl-2 hari ketujuh. Hasil dari uji normalitas

(Shapiro Wilk) menunjukkan nilai signifikansi 0.010 (<0.05), sehingga data

ekspresi Bcl-2 hari ketujuh tidak berdistribusi normal. Berdasarkan uji

homogenitas (Levene), didapatkan nilai signifikansi 0.970 (>0.05), sehingga data

Bcl-2 hari ketujuh memiliki ragam homogen. Karena uji persyaratan tidak

terpenuhi, selanjutnya dilakukan uji statistik dengan uji non parametrik Kruskal

Wallis.

Berdasarkan hasil uji Kruskal Wallis, didapatkan p-value sebesar 0.677

(tabel 5.10). Karena p-value > 0.05, maka Ho diterima dan dapat disimpulkan

bahwa tidak terdapat perbedaan yang signifikan antar perlakuan. Karena tidak

110
terdapat perbedaan yang signifikan maka uji analisa statistik berhenti pada

tahapan ini.

Tabel 5.13 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Ekspresi Bcl-2 Jaringan Otak
Tikus Wistar Model pada Kepala Traumatik pada Hari Ketujuh
Kelompok Nilai Rerata Standar Deviasi (Sel/Lp) N Signifikansi p
A7 15.5 4.74 4
B7 12.2 3.18 4
C7 14.125 4.29 4 0.677
D7 12.875 4.62 4
E7 13 4.18 4
Keterangan:
1. Nilai rerata: jumlah semua hasil pemeriksaan dibagi dengan banyaknya sampel
pemeriksaan pada pengamatan 10 lapang pandang (sel/Lp).
2. N: jumlah sampel
3. Kelompok A7: tikus yang tidak diberikan perlakuan cedera otak traumatik
maupun catechins pengamatan pada hari ketujuh
4. Kelompok B7: model cedera otak traumatik tanpa diberi catechins pengamatan
pada hari ketujuh
5. Kelompok C7:model cedera otak traumatik dan diberi catechins 513 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 7 hari
6. Kelompok D7: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 926 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 7 hari
7. Kelompok E7: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 1113 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 7 hari
8. Nilai signifikansi p didapatkan melalui uji Kruskal Wallis pada hari ketujuh,
dimana p>0.05 menunjukkan H0 diterima dan tidak terdapat beda signifikan
antar perlakuan

Gambar 5.8 menunjukkan rata-rata ekspresi Bcl-2 pada hari ketiga dan

ketujuh. Terdapat penurunan ekspresi Bcl-2 pada kelompok kontrol positif

dibandingkan kelompok kontrol negatif sebesar 50,31% pada hari ketiga. Dengan

pemberian catechins, rata-rata ekspresi Bcl-2 meningkat sebanyak 41,2-53,8%

pada hari ketiga. Penurunan ekspresi Bcl-2 pada hari ketiga lebih besar

dibandingkan dengan hari ketujuh. Penurunan ekspresi Bcl-2 pada kelompok

kontrol positif hari ketujuh dibandingkan kelompok kontrol negatif hanya sebesar

21,3%. Dengan pemberian catechins, rata-rata ekspresi Bcl-2 meningkat

sebanyak 18,6-28,8% pada hari ketujuh. Pada hari ketiga, semakin besar dosis,

semakin besar peningkatan ekspresi Bcl-2. Pada hari ketujuh, ekspresi Bcl-2

pada kelompok catechins dosis 926 mg/kgBB lebih besar daripada dosis 513

111
mg/kgBB/hari. Tetapi, ekspresi Bcl-2 kelompok catechins dosis 1113

mg/kgBB/hari lebih kecil dibandingkan dosis 926 mg/kgBB/hari. Namun, semua

perbedaan tersebut tidak signifikan secara statistik.

Gambar 5.37 Grafik histogram rata-rata ekspresi imunohistokimia Bcl-2

pada neuron post cedera kepala traumatik kelompok kontrol dan perlakuan
pada hari ketiga dan ketujuh
Keterangan: A: Kontrol Negatif; B: Kontrol Positif; C: Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari;
D: Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari; E: Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari.
Pada ekspesi Bcl-2 hari ketiga dan ketujuh, tidak ada kelompok yang memiliki beda
signifikan (p0.05) sehingga ditunjukkan dengan notasi yang sama.

5.6 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax

pada Tikus Model Cedera Otak Traumatik

Dilakukan analisis terhadap rasio ekspresi Bcl-2 terhadap Bax untuk

mengetahui pengaruh pemberian catechins terhadap proses apoptosis pada jalur

apoptosis intrinsik yang diregulasi oleh famili Bcl-2. Bcl-2 merupakan protein anti

apoptosis dan Bax merupakan protein pro apoptosis. Dari hasil rata-rata ekspresi

Bcl-2 dan Bax pada neuron dengan menggunakan metode imunohistokimia

diatas, hasil rata-rata Bcl-2 terhadap Bax diukur pada masing-masing kelompok

dan disajikan dalam bentuk rasio Bcl-2/Bax.

112
5.6.1 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax
pada Tikus Model Cedera Otak Traumatik pada Hari Ketiga

Hasil pengamatan rasio ekspresi Bcl-2/Bax pada jaringan otak tikus

model cedera otak traumatik pada kelompok tiga hari ditunjukkan pada tabel 5.7

berikut ini. Dari tabel 5.11, diketahui bahwa pada hari ketiga, kelompok kontrol

negatif memiliki rasio ekspresi Bcl-2/Bax yang paling tinggi dan kelompok kontrol

positif sebaliknya, yang paling rendah. Pada kontrol positif, rasio ekspresi Bcl-

2/Bax berkurang sebesar 91.17% dibandingkan kontrol negatif (gambar 5.9).

Pada kelompok yang diberikan catechins, terjadi gradasi peningkatan rasio

ekspresi Bcl-2/Bax sesuai dengan kenaikan dosisnya (513, 926 dan 1113

mg/KgBB/hari). Terjadi peningkatan rasio ekspresi Bcl-2/Bax sebesar 143,33-

169,17% dibandingkan kontrol positif. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi

dosis catehins yang diberikan, maka dukungan terhadap aktivitas anti

apoptosisnya semakin meningkat, walaupun kenaikan nilai yang ditunjukkan

tidak terlihat nyata.

Sebelum dilakukan uji statistik, dilakukan diuji prasyarat untuk menilai

apakah data rasio Bcl-2/Bax hari ketiga berdistribusi normal dan homogen. Dari

uji normalitas (Shapiro Wilk) didapatkan nilai signifikansi 0.000 (<0.05), sehingga

data rasio Bcl-2/Bax hari ketiga tidak berdistribusi normal. Uji homogenitas

menunjukkan nilai signifikansi sebesar 0.012 (<0.05), sehingga data rasio Bcl-

2/Bax hari ketiga tidak homogen. Karena uji syarat normalitas dan homogenitas

tidak terpenuhi, maka selanjutnya dilakukan uji statistik non parametrik Kruskal

Wallis.

Hasil uji Kruskall Wallis menunjukkan p-value sebesar 0.005 (tabel 5.11).

Karena p-value <0.05, maka Ho ditolak dan disimpulkan bahwa terdapat

perbedaan signifikan antar kelompok perlakuan. Selanjutnya, dilakukan uji

113
perbandingan berganda Mann Whitney untuk mengetahui kelompok perlakuan

spesifik yang menunjukkan adanya perbedaan tersebut (tabel 5.12 dan gambar

5.9).

Tabel 5.14 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax
Neuron Tikus Post Cedera Otak Traumatik hari Ketiga
Kelomp Nilai Rerata Standar N Signifikansi p
ok Deviasi
A3 3.4025 1.46 4
B3 0.3025 0.09 4
C3 0.7275 0.21 4 0.005*
D3 0.7475 0.22 4
E3 0.8075 0.20 4
Keterangan:
1. Nilai rerata: jumlah semua hasil pemeriksaan Bcl-2 dibagi dengan rerata semua
hasil pemeriksaan Bax pada masing-masing kelompok
2. N: jumlah sampel.
3. Kelompok A3: tikus yang tidak diberikan perlakuan cedera otak traumatik
maupun catechins pengamatan pada hari ketiga
4. Kelompok B3: model cedera otak traumatik tanpa diberi catechins pengamatan
pada hari ketiga
5. Kelompok C3:model cedera otak traumatik dan diberi catechins 513 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 3 hari
6. Kelompok D3: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 926 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 3 hari
7. Kelompok E3: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 1113 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 3 hari
8. Nilai signifikansi p didapatkan melalui uji Kruskal Wallis, dimana p<0.05
menunjukkan H0 ditolak dan terdapat beda antar perlakuan (*).

Tabel 5.15 Hasil Uji Mann Whitney pada Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax pada Otak
Tikus Cedera Otak Traumatik pada Hari Ketiga
Variabel 1 Variabel 2 Signifikansi Keterangan
A3 B3 0.021* Berbeda Signifikan
C3 0.021* Berbeda Signifikan
D3 0.021* Berbeda Signifikan
E3 0.021* Berbeda Signifikan
B3 C3 0.021* Berbeda Signifikan
D3 0.021* Berbeda Signifikan
E3 0.021* Berbeda Signifikan
C3 D3 0.663 Tidak Berbeda Signifikan
E3 0.386 Tidak Berbeda Signifikan
D3 E3 0.386 Tidak Berbeda Signifikan
Keterangan: A3: Kontrol Negatif; B3: Kontrol Positif; C3: catechins dosis 513
mg/kgBB/hari; D3: catechins dosis 926 mg/kgBB/hari; E3: catechins dosis 1113
mg/kgBB/hari
*kelompok yang memiliki perbedaan yang bermakna (signifikan) (p<0.05)

Dari hasil uji Mann Whitney pada tabel 5.12, dapat diketahui bahwa

kelompok kontrol positif dan kontrol negatif memiliki perbedaan yang signifikan

114
dengan semua kelompok perlakuan lainnya. Terdapat perbedaan bermakna

antara kelompok cedera kepala yang mendapatkan catechins dibandingkan yang

tidak mendapatkan catechins pada hari ketiga. Tetapi, tidak ada perbedaan

bermakna rasio Bcl-2/Bax baik pada pemberian catechins dosis 513, 926,

maupun 1113 mg/kgBB/hari.

5.6.2 Pengaruh Pemberian Catechins terhadap Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax

pada Tikus Model Cedera Otak Traumatik pada Hari Ketujuh

Hasil pengamatan rasio ekspresi Bcl-2/Bax pada jaringan otak tikus

model cedera otak traumatik pada kelompok tujuh hari ditunjukkan pada tabel

5.13 dan gambar 5.9. Pada hari ketujuh, kelompok kontrol negatif memiliki rasio

ekspresi Bcl-2/Bax tertinggi, sedangkan kelompok kontrol positif memiliki rasio

ekspresi Bcl-2/Bax terendah. Terdapat penurunan rasio ekspresi Bcl-2/Bax

sebesar 76,70% pada kontrol positif dibandingkan kontrol negatif. Sementara itu,

pada kelompok yang diberikan catechins, menunjukkan nilai yang relatif sama,

antara satu sama lain, baik pada dosis 513, 926, maupun 1113 mg/KgBB/hari.

Dengan pemberian catechins selama 7 hari, terdapat peningkatan rasio ekspresi

Bcl-2/Bax sebesar 64,94-67,61% (gambar 5.9).

Dilakukan uji prasyarat pada data rasio Bcl-2/Bax hari ketujuh untuk

menilai apakah berdistribusi dan ragam data sebelum diuji statistik. Hasil dari uji

normalitas (Shapiro Wilk) menunjukkan nilai signifikansi pada sebesar 0.000 (<

0.05), sehingga data rasio Bcl-2/Bax hari ketujuh tidak berdistribusi normal.

Berdasarkan uji homogenitas (Levene) didapatkan nilai signifikansi sebesar

0.068 (>0.05), sehingga data rasio Bcl-2/Bax hari ketujuh memiliki ragam

homogen. Karena uji persyaratan normalitas tidak terpenuhi, dilakukan uji

statistik menggunakan uji non parametrik Kruskal Wallis.

115
 Berdasarkan hasil uji Kruskall Wallis, didapatkan p-value sebesar 0.013

(tabel 5.13). Karena p-value <0.05, maka Ho ditolak dan dapat disimpulkan

terdapat perbedaan signifikan antar perlakuan. Selanjutnya, dilakukan uji

perbandingan berganda Mann Whitney untuk mengetahui perlakuan mana yang

menunjukkan adanya perbedaan tersebut.

Tabel 5.16 Nilai Rerata dan Standar Deviasi Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax
Neuron Tikus Post Cedera Otak Traumatik hari Ketujuh
Kelomp Nilai Rerata Standar N Signifikansi p
ok Deviasi
A7 3.04 1.11 4
B7 0.71 0.15 4
C7 1.03 0.33 4 0.013*
D7 0.99 0.36 4
E7 1.077 0.34 4
Keterangan:
1. Nilai rerata: jumlah semua hasil pemeriksaan Bcl-2 dibagi dengan rerata semua
hasil pemeriksaan Bax pada masing-masing kelompok
2. N: jumlah sampel.
3. Kelompok A7: tikus yang tidak diberikan perlakuan cedera otak traumatik
maupun catechins pengamatan pada hari ketujuh
4. Kelompok B7: model cedera otak traumatik tanpa diberi catechins pengamatan
pada hari ketujuh
5. Kelompok C7:model cedera otak traumatik dan diberi catechins 513 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 7 hari
6. Kelompok D7: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 926 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 7 hari
7. Kelompok E7: model cedera otak traumatik dan diberi catechins 1113 mg/kgBB
perhari secara peroral selama 7 hari
8. Nilai signifikansi p didapatkan melalui uji Kruskal Wallis, dimana p<0.05
menunjukkan H0 ditolak dan terdapat beda antar perlakuan (*).

Tabel 5.17 Hasil Uji Mann Whitney pada Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax pada Otak
Tikus Cedera Otak Traumatik pada Hari Ketujuh
Variabel 1 Variabel 2 Signifikansi Keterangan
A7 B7 0.021* Berbeda Signifikan
C7 0.021* Berbeda Signifikan
D7 0.021* Berbeda Signifikan
E7 0.021* Berbeda Signifikan
B7 C7 0.083 Tidak Berbeda Signifikan
D7 0.083 Tidak Berbeda Signifikan
E7 0.083 Tidak Berbeda Signifikan
C7 D7 0.468 Tidak Berbeda Signifikan
E7 0.468 Tidak Berbeda Signifikan
D7 E7 0.386 Tidak Berbeda Signifikan
Keterangan: A7: Kontrol Negatif; B7: Kontrol Positif; C7: catechins dosis 513
mg/kgBB/hari
D7: catechins dosis 926 mg/kgBB/hari; E7: catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari.
*kelompok yang memiliki perbedaan yang bermakna (signifikan) (p<0.05)

116
 Dari hasil uji Mann Whitney pada tabel 5.14, diketahui bahwa hanya

kelompok kontrol negatif yang memiliki perbedaan signifikan dengan kelompok

lainnya. Pada hari ketujuh, sudah tidak ada perbedaan bermakna antara

kelompok cedera kepala yang tidak mendapatkan catechins dibandingkan

dengan kelompok yang mendapatkan catechins baik dosis 513, 926, maupun

1113 mg/kgBB/hari.

Gambar 5.38 Grafik histogram rasio ekspresi imunohistokimia Bcl-2/Bax

pada neuron post cedera kepala traumatik kelompok kontrol dan perlakuan
pada hari ketiga dan ketujuh
Keterangan: A: Kontrol Negatif; B: Kontrol Positif; C: Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari;
D: Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari; E: Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari
Kelompok yang menunjukkan beda yang signifikan (p<0.05) berdasarkan uji Mann
Whitney ditandai dengan notasi yang berbeda sesuai hasil pada tabel 5.12 dan 5.14.
Kelompok dengan rerata terkecil memiliki notasi huruf yang lebih awal.

117
 Pada gambar 5.9 tampak grafik histogram yang menunjukkan rata-rata

rasio ekspresi Bcl-2/Bax. Perlakuan cedera otak traumatik pada tikus wistar

menurunkan rasio Bcl-2/Bax dengan signifikan. Tampak penurunan rasio Bcl-

2/Bax pada hari ketiga lebih banyak dibandingkan dengan hari ketujuh. Dengan

pemberian catechins, tampak peningkatan rasio ekspresi Bcl-2/Bax meskipun

tidak dapat mencapai rasio normal tanpa cedera otak traumatik. Peningkatan

rasio Bcl-2/Bax pada hari ketiga berbeda signifikan antara kelompok yang

diberikan catechins dibandingkan dengan kontrol positif. Tetapi, sudah tidak ada

perbedaan signifikan rasio Bcl-2/Bax pada tikus model cedera otak traumatik

yang mendapat catechins dibandingkan yang tidak mendapat catechins pada

hari ketujuh.

5.7 Hubungan Dosis Catechins dengan Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax

5.7.1 Hubungan Dosis Catechins dengan Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax pada

Hari Ketiga

Uji korelasi Spearman dilakukan untuk mengetahui hubungan antara

dosis pemberian catechins dengan rasio ekspresi Bcl-2/Bax pada hari ketiga.

Hasil uji korelasi Spearman, menunjukkan nilai p=0.002, sehingga terdapat

hubungan yang signifikan antara rasio ekspresi Bcl-2/Bax dengan dosis

pemberian catechins pada tikus model cedera otak traumatik. Koefisien korelasi

Spearman (R) sebesar 0.710 menunjukkan bahwa rasio ekspresi Bcl-2/Bax

dengan dosis pemberian catechins memiliki hubungan dengan arah positif dan

kekuatan korelasi kuat. Artinya, semakin tinggi dosis catechins, maka semakin

tinggi pula rasio ekspresi Bcl-2/Bax pada jaringan otak tikus model cedera otak

traumatik.

118
5.7.2 Hubungan Dosis Catechins dengan Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax pada
Hari Ketujuh

Untuk mengetahui hubungan antara dosis pemberian catechins dengan

rasio ekspresi Bcl-2/Bax pada hari ketujuh dilakukan uji korelasi Spearman. Hasil

uji korelasi Spearman menunjukkan nilai p=0.047, sehingga disimpulkan terdapat

hubungan yang signifikan antara rasio ekspresi Bcl-2/Bax dengan dosis

pemberian catechins pada tikus model cedera otak traumatik. Besar koefisien

korelasi Spearman (R)=0.504, artinya hubungan antara rasio ekspresi Bcl-2/Bax

dengan dosis pemberian catechins memiliki arah positif dan kekuatan korelasi

sedang. Artinya, semakin tinggi dosis catechins, semakin tinggi pula rasio

ekspresi Bcl-2/Bax pada jaringan otak tikus model cedera otak traumatik pada

hari ketujuh.

5.8 Hubungan Rasio Ekspresi Bcl2/Bax dengan Hasil NSS pada Tikus
Wistar Model Cedera Otak Traumatik

Pada bagian ini, dilakukan uji statistik untuk mengetahui korelasi besar

rasio Bcl-2/Bax dengan status fungsional otak (NSS) pada tikus model cedera

otak traumatik. Karena pada uji prasyarat didapatkan set data tidak berdistribusi

normal (Lampiran 3), dilakukan uji korelasi non parametrik Spearman (tabel

5.15).

Tabel 5.18 Hasil Uji Korelasi Spearman Rasio Ekspresi Bcl-2/Bax dan NSS
Variabel Variabel 2 Kelomp Hari Ketiga Hari Ketujuh
1 ok p. R p. R
A konsta Konsta konst konst
n n an an
B 0.010* - 0.001 -0.738
Rasio Bcl-
NSS 0.623 *
2/Bax
C 0.225 -0.775 0.225 -0.775
D 0.963 -0.037 0.225 -0.775
E 0.553 -0.447 0.225 -0.775

Berdasarkan tabel 5.15 di atas, pada cedera traumatik didapatkan

hubungan signifikan (p<0.05) antara NSS dengan rasio ekspresi Bcl-2/Bax, baik

119
pada hari ketiga (p=0.010) maupun hari ketujuh (p=0.001). Sehingga, H0 diterima

dan disimpulkan bahwa peningkatan ekspresi Bcl-2/Bax berhubungan signifikan

dengan penurunan NSS pada tikus wistar model cedera otak traumatik. Tetapi,

tidak didapatkan hubungan signifikan antara peningkatan NSS dengan rasio

penurunan ekspresi Bcl-2/Bax dengan pemberian catechins.

120
 BAB 6

PEMBAHASAN

Penelitian ini dilakukan untuk mengamati pengaruh catechins terhadap

peningkatan rasio ekspresi Bcl-2/Bax pada tikus Wistar dengan cedera otak

traumatik. Cedera otak traumatik dilakukan dengan model penjatuhan beban

(weight-drop), dimana terjadi cedera mekanik tertutup pada jaringan otak

(Cernak, 2005). Bentuk cedera yang terjadi adalah cedera fokal. Metode ini

sudah pernah dilakukan oleh Riawan et al. (2015) di Universitas Brawijaya

Malang.

Dilakukan penjatuhan beban berupa tabung silinder berdiameter 0,4 cm

dengan massa 45 gram. Beban dijatuhkan tegak lurus dari ketinggian 100 cm

sebanyak satu kali. Energi benturan adalah sebesar 0.45 joule. Beban dijatuhkan

pada garis tengah kepala tikus Wistar. Dengan metode ini didapatkan kontusio

serebri fokal dan cedera kepala ringan (Riawan et al., 2015). Metode penjatuhan

beban merupakan salah satu model cedera otak traumatik yang sering

digunakan. Untuk membentuk cedera otak fokal, digunakan alas yang tidak

fleksibel. Kelebihan dari model ini adalah, keparahan cedera dapat diatur

berdasarkan berat beban dan ketinggian penjatuhan yang berbeda. Kelemahan

model ini adalah tingginya mortalitas karena apnea, terutama pada binatang

dengan cedera otak berat. Untuk mengatasi kelemahan itu, digunakan binatang

dengan berat dan usia tertentu (Albert-Weissenberger and Sirn, 2010).

Cedera otak sekunder merupakan proses metabolik berkelanjutan setelah

cedera otak primer (Werner and Engelhard, 2007). Pada cedera otak traumatik

terjadi gangguan regulasi aliran darah, edema serebri, dan kegagalan energi,

121
yang menyebabkan terjadinya iskemia (Erdman et al., 2011; McAllister, 2011;

Prins et al., 2013). Dilepaskan glutamat yang menyebabkan perubahan

homeostasis ion pada sel serta diinduksinya respon inflamasi pada jaringan saraf

yang menyebabkan kerusakan berlanjut (Bell, 2007; Werner and Engelhard,

2007; Erdman et al., 2011; McAllister, 2011; Prins et al., 2013). Terjadi

peningkatan ion kalsium di dalam sel yang menginduksi menginduksi

mengaktifkan enzim NOS yang memproduksi NO yang berlebihan. Proses

inflamasi juga mengaktifkan iNOS. Peningkatan iNOS ini berlangsung selama 7

hari (Prins et al., 2013). NO yang berlebihan menghambat uptake glutamat oleh

astrosit (Calabrese et al., 2004; Gahm et al., 2005). Dampak lain dari NO yang

berlebihan adalah merusak DNA sel secara langsung, menghambat respirasi

mitokondria dan mengaktifkan regulasi mediator pro apoptosis seperti p53, Bax

dan caspase. Kerusakan DNA mengaktifkan enzim PARP yang bertujuan

memperbaiki DNA. Terapi aktivasi PARP membutuhkan banyak energi,

sedangkan pada area inti cedera otak traumatik sudah terjadi kegagalan energi

berat, sehingga alih-alih terjadi perbaikan DNA, justru terjadi kekurangan energi

semakin besar (Gahm et al., 2005; Bell, 2007).

Area inti segera mengalami nekrosis setelah cedera otak traumatik

(McAllister, 2011), sedangkan apoptosis pada area penumbra terjadi dalam

waktu yang lebih lambat. Proses kematian terprogram juga berhubungan dengan

terjadinya prognosis buruk pada cedera otak sehingga proses ini perlu dihambat

(Stoica and Faden, 2010). Nekrosis diduga berkontribusi pada sepertiga

kematian sel pada cedera kepala, sepertiga lainnya disebabkan oleh apoptosis

yang tergantung caspase, sedangkan sepertiga yang terakhir disebabkan oleh

apoptosis yang tidak tergantung caspase (Zhang et al., 2005).

122
 Jalur apoptosis intrinsik diatur oleh famili Bcl-2 yang terdiri dari protein pro

apoptosis dan protein anti apoptosis. Radikal bebas, stress oksidatif, Ca 2+

berlebihan, dan NO berlebihan dapat mengaktifkan Bax, protein pro apoptosis

dari famili Bcl-2 (Slemmer et al., 2004; Gahm et al., 2005; Kasan, 2006; Sneyder

et al., 2009). Bax menyebabkan terbentuknya pori pada mitokondria yang

melepaskan sitokrom c. Aktivitas Bax ini terhambat apabila Bax, ataupun protein

famili Bcl-2 inisiator apoptosis lainnya, berikatan dengan protein famili Bcl-2 anti

apoptosis (Czabotar et al., 2014).

Di samping aktivasi jalur intrinsik, pada cedera otak traumatik juga

diaktifkan jalur apoptosis ekstrinsik melalui sitokin pro inflamasi. Terjadi aktivasi

caspase 8 yang kemudian mengaktifkan Bid menjadi tBid. tBid dapat

mengaktifkan protein Bcl-2 pro apoptosis jalur intrinsik, misalnya Bax dan Bak.

Sehingga, aktivasi jalur ekstrinsik juga dapat mengaktifkan jalur intrinsik

(Czabotar et al., 2014).

Pada penelitian ini, peneliti bermaksud untuk menilai pengaruh catechins

pada fase akut cedera kepala, terutama pada jalur apoptosis intrinsik melalui

pengukuran rasio Bcl-2/Bax. Pada penelitian ini, Bax dipilih dibandingkan

subgrup Bcl-2 pro apoptosis lainnya, misalnya Bak, karena Bak tidak berperan

penting dalam menginduksi apoptosis pada populasi neuron. Bcl-2 merupakan

bagian dari rasio Bcl-2/Bax yang diduga merupakan reostat terjadinya apoptosis

(Shacka and Roth, 2006)

Penelitian ini merupakan bagian dari penelitian berkelompok, dimana

pada kelompok penelitian juga diukur kadar caspase 3, sebagai efektor dari jalur

apoptosis yang melibatkan caspase (Novitasari et al., 2017); caspase 8, sebagai

caspase yang terlibat pada jalur ekstrinsik (Hariningsih et al., 2017); dan

123
pengamatan apoptosis dengan metode TUNEL (Utami et al., 2017). NFB dan

TNF juga diukur untuk menilai pengaruh apoptosis jalur ekstrinsik melalui

pelepasan mediator inflamasi (Hariningsih et al., 2017; Utami et al., 2017). Selain

itu, BDNF juga diukur untuk menilai pengaruh neuroproteksi catechins terhadap

cedera otak traumatik (Novitasari et al., 2017).

Pemilihan terapi untuk cedera otak traumatik diharapkan dapat bekerja

pada multipel target spesifik. Target optimal terapi adalah pada jalur apoptosis.

Puncak apopotosis adalah pada hari 1-3 setelah cedera. Selain itu, terapi

diharapkan tidak hanya spesifik untuk neuron, tetapi juga dapat menghambat

neurotoksisitas melalui mikroglia, serta dapat bekerja pada sel lain, misalnya

oligodendrosit, astrosit, dan endotel (Stoica and Faden, 2010).

Catechins merupakan bahan yang terkandung dalam teh hijau yang telah

diketahui memiliki banyak manfaat pada berbagai organ tubuh pada manusia.

Pada cedera kepala, efek antioksidan dan antiinflamasi catechins diharapkan

dapat memperbaiki keluaran fungsional dari binatang coba. Sebagai anti

oksidan, konsumsi catechins selama tujuh hari dapat menurunkan konsentrasi 8-

OhdG dan malondialdehyd (MDA) pada urine, F2-isoprostane, dan PCOOH pada

plasma (Yashin et al., 2012). Sebagai anti inflamasi, Catechins diduga mampu

menekan aktivasi NFB, sehingga sitokin sitokin proinflamasi, seperti TNF- dan

IL-1, tidak mengalami peningkatan ekspresi (Paterniti et al., 2009). Pada cedera

medula spinalis, efek antiinflamasi EGCG dan catechins ditunjukkan dengan

hambatan pada jalur NFB dan AP-1 (Ekawati et al., 2012). Secara jangka

panjang, cedera otak traumatik juga berhubungan penyakit neurodegeneneratif

(misalnya Alzheimer, parkinson, dan ensefalopati kronik) (Erdman et al., 2011).

Banyak penelitian yang menghubungkan antara penggunaan jangka panjang

124
catechins untuk menghambat proses degeneratif (Sutherland et al., 2006;

Erdman et al., 2011).

Pada penelitian ini digunakan catechins dengan dosis 513, 926, dan 113

mg/kg/hari sesuai dengan dosis penelitian yang dilakukan oleh Suzuki et al.

(2004). Catechins yang diberikan merupakan klon GMB-4. Catechins merupakan

senyawa flavonoid terbanyak dari Camellia sinensis. Pada klon GMB-4,

catechins terkandung sebanyak 14-16% (Ratnawati, et al., 2009). Selain

catechins, pada Camellia sinensis, juga mengandung theaflavins, thearubigenes,

flavonols, dan caffein (Gramza et al., 2005; Sutherland et al., 2006). Melalui

metode ekstraksi pada Fakultas Kimia, Institut Teknologi Bandung ini, didapatkan

catechins dalam bentuk murni (Ratnawati, et al., 2009) Bentuk terbanyak dari

catechins adalah EGCG, selain itu juga didapatkan EGC, EC, C, GC, dan ECG

(Gramza et al., 2005; Sutherland et al., 2006). Dari catechins yang dikonsumsi,

hanya sebanyak 7% EGCG yang terukur pada plasma (Yashin et al., 2012), dan

hanya 10% dari kadar plasma yang didapatkan di otak (Smith, 2011).

Terdapat penelitian sebelumnya mengenai pemberian EGCG pada tikus

cedera otak traumatik. Tikus cedera otak traumatik mengalami peningkatan

dengan ekspresi 8-OHdG, 4-HNE, dan kadar MDA pada hari 1, 3, dan 7. 8-

OHdG tidak didapatkan pada tikus kontrol negatif. 8-OHdG adalah penanda

kerusakan DNA neuron dan glia akibat spesies oksigen reaktif. Hal itu medukung

adanya proses apoptosis otak melalui jalur kerusakan DNA pada cedera otak

traumatik. 4-HNE adalah hasil dari peroksidasi lipid pada neuron maupun glia

akibat radikal bebas. MDA diproduksi oleh radikal bebas pada membran neuron

melalui pemecahan asam lemak polyunsaturated, serta merupakan indeks untuk

menentukan keparahan dari peroksidasi lipid. Pemberian EGCG selama 1

minggu sesudah cedera dapat menurunkan jumlah sel dengan ekspresi 8-OHdG,

125
4-HNE, dan kadar MDA. Pada hari ke-7, kadar MDA otak tikus cedera sudah

tidak berbeda dibandingkan kontrol negatif (Itoh et al., 2013). Hal itu mendukung

bahwa EGCG memiliki efek sebagai antioksidan dan dapat bekerja pada sistem

saraf pusat. Produksi berlebihan dari radikal bebas dan oksigen reaktif

merupakan salah satu jalur yang memicu terjadinya apoptosis pada cedera

kepala traumatik. Proses apoptosis tersebut dapat berlangsung melalui aktivasi

jalur mitokondria maupun jalur kinase signaling (Bell, 2007; Werner and

Engelhard, 2007; Erdman et al., 2011; McAllister, 2011; Prins et al., 2013).

Penelitian ini dilakukan untuk membuktikan pengaruh terapi catechins

dalam meningkatkan rasio ekspresi Bcl-2/Bax pada tikus Wistar yang dilakukan

cedera otak traumatik. Bcl-2 dan Bax merupakan protein famili Bcl-2 yang

bekerja berlawanan. Bcl-2 bersifat anti apoptosis dan Bax bersifat pro apoptosis

(Czabotar et al., 2014). Faktor kunci dari regulasi apoptosis adalah tingginya

rasio Bcl-2/Bax akan membuat sel resisten terhadap stimulus apoptosis dan

rendahnya rasio tersebut akan memacu apoptosis (Vaskivuo et al., 2002; Zhang

et al., 2005). Diharapkan dengan meningkatnya rasio ekspresi Bcl-2/Bax, tikus

menjadi lebih resisten terhadap apoptosis, akibatnya perburukan cedera akibat

cedera otak sekunder dapat dihambat, atau bahkan dicegah.

Keparahan cedera otak tertutup pada binatang coba dinilai dengan

menggunakan NSS (Xiong et al., 2014). Pada NSS, dinilai kemampuan binatang

coba untuk dapat keluar dari ruangan berbentuk lingkaran, adanya perilaku

mencari, adanya paresis, kemampuan untuk berjalan lurus, kemampuan untuk

berdiri pada balok sempit berdiameter 7 mm, kemampuan berjalan pada balok

sempit dengan lebar 1 cm, 2 cm, dan 3 cm, dan kemampuan untuk bertahan

menggantung pada tongkat silinder (Wu et al., 2010). Pada penelitian ini, NSS

126
diukur untuk menilai perbaikan keparahan klinis cedera otak traumatik pada tikus

yang diberikan catechins dibandingkan yang tidak mendapatkan catechins.

6.1 Penurunan NSS Tikus Model Cedera Otak Traumatik setelah

Pemberian Catechins

Pada penelitian ini, didapatkan bahwa tidak ada penurunan signifikan

NSS tikus model cedera otak traumatik yang mendapatkan catechins dengan

dosis 926 mg/kgBB/hari dibandingkan yang tidak mendapat catechins pada hari

ketiga, sedangkan pada kelompok tikus model cedera otak traumatik yang

mendapatkan catechins dengan dosis 513 dan 1113 mg/kgBB/hari mengalami

penurunan NSS yang signifikan. Pada hari ketujuh, terdapat penurunan

signifikan NSS pada tikus yang mendapatkan catechins baik dosis 513, 926,

maupun 1113 mg/kgBB/hari dibandingkan yang tidak mendapat catechins. Hal ini

sesuai dengan penelitian sebelumnya dimana perbaikan fungsional setelah

cedera kepala tampak pada hari ketujuh (Albert-Weienberger et al., 2012).

Faktor yang berpengaruh besar terhadap kondisi klinis pada hari ketiga antara

lain adalah saat itu merupakan puncak terjadinya edema otak (Clark et al., 2015).

Sehingga, perbaikan keluaran klinis pada cedera otak traumatik sebaiknya

diamati pada hari ketujuh. Pada penelitian ini, dosis perlakuan terkecil (513

mg/kgBB/hari) sudah dapat menunjukkan penurunan NSS yang signifikan

dibandingkan yang tidak mendapatkan catechins.

Pada penelitian sebelumnya, model cedera otak traumatik ringan

biasanya mengalami perbaikan status fungsional spontan dalam 7 hari (Albert-

Weienberger et al., 2012). Pada penelitian ini tidak didapatkan perbaikan

spontan pada kelompok yang tidak mendapatkan catechins, justru terjadi

perberatan klinis. Penurunan status fungsional ini dapat terjadi karena beberapa

127
hal, antara lain perluasan perdarahan intrakranial (Choudhry et al., 2013) dan

proses neuroinflamasi tertunda (Tsai et al., 2013). Selain itu, pada dua minggu

awal cedera, terjadi edema otak. Perluasan edema juga dapat menurunkan

fungsi klinis dari hewan coba. Edema biasanya berkurang setelah sawar darah

otak menutup setelah dua minggu (Finnie, 2013).

6.2 Peningkatan Dosis Catechins Berhubungan dengan Penurunan NSS

pada Tikus Model Cedera Otak Traumatik

Pada hari ketiga, penurunan NSS tidak berhubungan dengan peningkatan

dosis catechins. Hal ini didukung oleh uji regresi dimana variasi dosis catechins

hanya mempengaruhi sebesar 19,4% terhadap nilai NSS pada hari ketiga.

Sehingga, variasi dosis catechins bukan merupakan faktor dominan yang

mempengaruhi penurunan NSS pada cedera otak traumatik pada hari ketiga.

Faktor-faktor yang mempengaruhi perbaikan klinis digolongkan menjadi faktor

sebelum cedera dan faktor sesudah cedera. Faktor sebelum cedera antara lain

usia, status psikologis, nutrisi, dan penyakit penyerta. Variasi faktor sebelum

cedera diminimalisir dengan pemilihan tikus dengan usia seragam dan

aklimatisasi sebelum perlakuan. Faktor sesudah cedera antara lain kejang,

infeksi, reorganisasi neuron, peningkatan tekanan intrakranial (karena edema

dan hematom), serta rehabilitasi fungsional. Faktor yang berpengaruh besar

terhadap kondisi klinis pada hari ketiga antara lain adalah saat itu merupakan

puncak terjadinya edema otak (Clark et al., 2015). Oleh karena itu, setelah

puncak edema otak berlalu pada hari ketujuh, didapatkan peningkatan dosis

catechins berhubungan kuat dengan penurunan NSS. Berdasarkan parameter

NSS, terjadi perbaikan klinis tikus berdasarkan waktu dan dosis catechins.

128
6.3 Peningkatan Rasio Bcl-2/Bax Tikus Model Cedera Otak Traumatik
setelah Pemberian Catechins

Berdasarkan penelitian sebelumnya, tikus Bax (-/-) dengan cedera otak

traumatik menunjukkan ekspresi caspase 3 dan jumlah neuron apoptosis yang

lebih sedikit dibandingkan dengan tikus normal dengan perlakuan cedera otak

traumatik. Defisiensi Bax juga meningkatkan stimulasi neuron progenitor pada

hipothalamus sehingga meningkatkan neuroplastisitas (Schoch et al., 2012). Hal

itu menunjukkan peran Bax dalam menginduksi apoptosis.

Berdasarkan penelitian dari Raghupathi et al. (2003), didapatkan bahwa

neuron yang mengekspresikan Bax meningkat sebesar 25% dibandingkan

kontrol negatif pada 24 jam setelah cedera otak traumatik. Ekspresi Bax kembali

normal pada 7 hari setelah cedera pada hipokampus, tetapi tetap meningkat

pada korteks temporal dan occipital (Raghupathi et al., 2003). Pada penelitian ini,

didapatkan ekspresi Bax meningkat antara kontrol positif terhadap kontrol negatif

pada hari ketiga (429%) dan hari ketujuh (226%). Dengan pemberian catechins,

terjadi penurunan ekspresi Bax dibandingkan kontrol positif. Tidak didapatkan

perbedaan penurunan Bax bermakna dengan pemberian catechins dosis 926

mg/kgBB/hari dengan dosis 1113 mg/kgBB/hari.

Terjadi penurunan ekspresi Bcl-2 pada hari ketiga dan hari ketujuh tetapi

penurunan ekspresi Bcl-2 tidak berbeda bermakna secara statistik. Berdasarkan

penelitian sebelumnya, ekspresi Bcl-2 dan Bcl-xL mengalami penurunan lebih

awal (6-24 jam), dibandingkan dengan peningkatan ekspresi Bax (3-7 hari).

Penurunan ekspresi Bcl-2 dapat berlangsung selama 3 hingga 7 hari setelah

cedera kepala traumatik (Strauss, Narayan and Raghupathi, 2004). Puncak

penurunan ekspresi Bcl-2 setelah cedera kepala terjadi pada 24 jam setelah

cedera, Penurunan Bcl-2 pada beberapa jam setelah cedera, diikuti dengan

129
terjadinya apoptosis neuron yang nyata di tempat yang sama setelah 24 jam. Hal

itu menunjukkan penurunan Bcl-2 mempengaruhi terjadinya apoptosis neuron

(Raghupathi et al., 2003). Hasil berbeda didapatkan pada penelitian Lin et al.

(2012) dimana terjadi peningkatan kadar Bcl-2 setelah cedera kepala dengan

puncak pada 2 jam setelah cedera, lalu kadar Bcl-2 menurun bertahap dan

mengalami puncak kedua pada 24 jam setelah cedera. Peningkatan Bcl-2

teramati hingga hari ke 5. Meskipun terjadi peningkatan ekspresi Bcl-2, tetapi

rasio Bcl-2/Bax tetap berkurang dibandingkan kontrol dengan puncak penurunan

rasio pada 6 jam setelah cedera kepala, dan mencapai puncaknya lagi pada 3

hari setelah cedera (Lin et al., 2012).

Pada penelitian lain, juga didapatkan hasil bahwa pada hari ke-1 dan ke-3

hanya sedikit neuron yang mengekspresikan Bcl-2 setelah cedera kepala.

Dengan pemberian EGCG selama 1 minggu setelah cedera kepala, lebih banyak

neuron yang mengekspresikan Bcl-2 pada hari ke-1 dan ke-3. Sedangkan pada

hari ketujuh, hanya sedikit Bcl-2 yang terekspresi, tidak berbeda dengan

kelompok kontrol. Peningkatan ssDNA yang menunjukkan adanya apoptosis juga

mengalami puncak pada hari ke-3. Pada hari ketujuh, ekspresi ssDNA sudah

mengalami penurunan tetapi masih berbeda bermakna dibandingkan kontrol

negatif (Itoh et al., 2013).

Pada hari ketiga dan ketujuh, kelompok kontrol negatif memiliki rasio

ekspresi Bcl-2/Bax yang paling tinggi dan sebaliknya pada kelompok kontrol

positif. Terdapat peningkatan rasio Bcl-2/Bax yang bermakna antara kelompok

trauma yang mendapatkan catechins dibandingkan yang tidak. Hasil ini

mendukung penelitian sebelumnya bahwa pada hari ketiga, model cedera otak

traumatik penjatuhan beban mengalami peningkatan ekspresi Bax dan

130
penurunan ekspresi Bcl-2, seperti pada cedera otak traumatik model perkusi

cairan lateral dan controlled cortical impact lateral (Strauss et al., 2004).

Pada hari ketujuh, sudah tidak ada perbedaan bermakna rasio ekspresi

Bcl-2/Bax antara kelompok trauma kepala yang mendapatkan catechins

dibandingkan yang tidak. Tiga hari pertama merupakan waktu krusial untuk terapi

cedera kepala (Stoica and Faden, 2010). Oleh karena itu, pemberian terapi untuk

cedera otak traumatik harus diberikan segera, karena puncak apoptosis

berlangsung pada hari ketiga.

Tiga hari pertama setelah cedera kepala merupakan waktu krusial dimana

terdapat puncak kematian sel akibat cedera sekunder dan merupakan target

pemberian terapi yang memodulasi proses apoptosis (Mao et al., 2014). Pada

tiga hari dan tujuh hari pemberian catechins, peningkatan ekspesi Bcl-2/Bax

masih berbeda signifikan dengan kontrol negatif. Hal itu menunjukkan bahwa

pemberian catechins tidak dapat membuat rasio Bcl-2/Bax seperti normal. Pada

hari ketujuh, ekspresi Bcl-2/Bax antara kelompok kontrol positif dan kelompok

yang mendapatkan catechins sudah tidak berbeda bermakna, meskipun secara

jumlah, rasio ekspresi Bcl-2/Bax pada kelompok yang diberikan catechins lebih

besar dibandingkan kontrol positif. Walaupun secara statistik peningkatan dosis

catechins tetap berkorelasi searah dengan peningkatan rasio ekspresi Bcl-2/Bax

pada hari ketiga dan hari ketujuh, namun peningkatannya tidak signifikan pada

dosis yang diberikan pada penelitian.

Peningkatan rasio Bax/Bcl-2 pada suatu jaringan tidak langsung memicu

suatu sel untuk mengalami apoptosis, tetapi sel lebih sensitif terhadap induksi

jalur kematian. Peningkatan Bax juga tidak secara langsung memicu kematian

131
sel, tetapi sel dengan ekspresi Bax lebih rentan terhadap stimulus kematian dan

lebih sulit untuk pulih dari iskemia (Krajewski et al., 1995).

Rasio Bcl-2/Bax meningkat bermakna pada kelompok yang diberikan

catechins pada hari ketiga dan tidak meningkat bermakna pada kelompok

catechins pada hari ketujuh. Akan tetapi, ekspresi Bax tetap memiliki beda

bermakna pada kelompok yang mendapatkan catechins baik pada hari ketiga

maupun hari ketujuh, seperti halnya hasil pengukuran caspase 3 dan TUNEL

pada penelitian Novitasari et al. (2017) dan Utami et al. (2017) yang merupakan

bagian dari kelompok penelitian ini. Tidak berbeda bermaknanya hasil rasio Bcl-

2/Bax pada hari ketujuh dapat disebabkan karena pada hasil penelitian ini,

catechins tidak mempengaruhi rasio ekspresi Bcl-2. Diduga, peningkatan Bcl-2

sudah terjadi sebelum 3 hari, saat pengamatan pada penelitian ini. Dugaan lain,

peningkatan Bax lebih berpengaruh terhadap terjadinya apoptosis dibandingkan

penurunan Bcl-2 pada tikus model cedera otak traumatik. Selain itu, dari

kelompok penelitian ini juga didapatkan penurunan ekspresi caspase 8 pada hari

ketiga dan ketujuh (Hariningsih et al., 2017). Berdasarkan hasil tersebut, dugaan

lain yang menyebabbkan penurunan apoptosis adalah melalui aktivitas jalur

ekstrinsik yang ditunjukkan melalui peningkatan caspase 8 yang mengaktifkan

langsung caspase 9 atau secara tidak langsung dengan mengaktifkan Bid yang

memicu aktivasi Bax pada jalur intrinsik.

6.4 Peningkatan Dosis Catechins berhubungan dengan Peningkatan

Rasio Bcl-2/Bax pada Tikus Model Cedera Otak Traumatik

Pada penelitian ini didapatkan bahwa baik pada hari ketiga maupun hari

ketujuh, semakin besar dosis catechins, maka semakin besar pula rasio ekspresi

Bcl-2/Bax. Kenaikan rasio Bcl-2/Bax menunjukkan peningkatan aktivitas anti

132
apoptosis. Catechins terbukti dapat meningkatkan ekspresi Bcl-2 dan

menurunkan ekspresi Bax pada tikus model cedera otak traumatik. Hal ini

mendukung bahwa EGCG, yang merupakan kandungan terbesar dari catechins,

dapat menghambat ekspresi gen pro apoptosis, sehingga terjadi rasio Bcl-2/Bax

meningkat. Peningkatan rasio Bcl-2/Bax menyebabkan sel lebih resisten

terhadap apoptosis. Efek catechins terhadap apoptosis yang diregulasi oleh

famili protein Bcl-2 diduga melalui penghambatan pembentukan NO dan

penghambatan pada mediator pro inflamasi (Sutherland et al., 2006).

6.5 Peningkatan Rasio Bcl-2/Bax Sebanding dengan Penurunan Hasil

NSS

Pada penelitian ini, didapatkan peningkatan rasio Bcl-2/Bax berhubungan

dengan penurunan NSS pada cedera otak traumatik. Secara teori, hubungan

rasio Bcl-2/Bax dan NSS adalah tidak langsung. Rasio Bcl-2/Bax merupakan

penanda kecenderungan terjadinya apoptosis. Penurunan rasio Bcl-2/Bax akan

mengaktifkan caspase melalui jalur apoptosis intrinsik (Czabotar et al., 2014).

Apoptosis pada neuron yang secara langsung mempengaruhi status fungsional

klinis dari tikus model (Xiong et al., 2014).

Hilangnya Bax pada mencit delesi tidak serta merta memberi garansi

perbaikan fungsional dari mencit. Pada penelitian sebelumnya, didapatkan

adanya neuron dengan akson atrofi meskipun apoptosis dihambat (Shacka and

Roth, 2006). Untuk memastikan hambatan apoptosis dengan pemberian

catechins juga bermanifestasi dengan perbaikan klinis, dilakukan pengukuran

NSS. NSS merupakan parameter klinis yang digunakan untuk menilai perbaikan

fungsional pada tikus. Penurunan NSS menunjukkan perbaikan keparahan

cedera (Wu et al., 2010).

133
 Pada penelitian ini, didapatkan peningkatan bermakna rasio ekspresi Bcl-

2/Bax pada hari ketiga dan penurunan bermakna ekspresi Bax pada hari ketiga

dan ketujuh dengan pemberian catechins. Untuk menilai apakah peningkatan

rasio Bcl-2/Bax dapat menurunkan apoptosis, diperlukan pemeriksaan antara lain

caspase 3 dimana sudah menjadi point of no return dari apoptosis atau

gambaran fragmentasi DNA dengan TUNEL atau dengan pengukuran ssDNA.

Didapatkan penurunan bermakna ekspresi caspase 3 antara tikus dengan

cedera otak traumatik yang mendapatkan catechins dengan yang tidak

mendapatkan catechins, baik pada hari ketiga maupun hari ketujuh (Novitasari et

al., 2017). Hasil ini didukung dengan penurunan bermakna jumlah sel apoptosis

dengan pemberian terapi catechins (Utami et al., 2017). Semakin besar dosis

catechins, semakin kecil ekspresi caspase 3, baik hari ketiga maupun hari

ketujuh (Novitasari et al., 2017). Pada pengukuran TUNEL yang dilakukan pada

kelompok penelitian ini, baik pada hari ketiga maupun ketujuh, peningkatan dosis

catechins berbanding lurus dengan penurunan sel apoptosis pada tikus model

cedera otak traumatik (Utami et al., 2017).

Secara klinis juga terjadi perbaikan NSS pada kelompok yang

mendapatkan catechins. Oleh karena itu, perbaikan klinis NSS diduga

disebabkan karena penurunan jumlah neuron apoptosis, melalui jalur yang

dimediasi caspase. Salah satunya adalah jalur apoptosis intrinsik yang diatur

oleh famili Bcl-2.

6.6 Keterbatasan Penelitian

Keterbatasan penelitian ini adalah, pertama, catechins diberikan sekali

sehari dengan peroral. Beberapa jenis catechins memiliki waktu paruh pendek,

134
belum dilakukan pengukuran kadar masing-masing kandungan catechins pada

teh hijau GMB-4. Selanjutnya, perlu diuji lebih lanjut mengenai besar dosis dan

interval terapi yang optimal. Kedua, penelitian ini hanya mengukur satu variabel

dari anggota famili Bcl-2 pro apoptosis (Bax) dan satu anggota famili Bcl-2 anti

apoptosis (Bcl-2). Dengan semakin banyaknya anggota famili Bcl-2 yang

diketahui, dimungkinkan penelitian lanjutan untuk menilai anggota famili Bcl-2

manakah yang paling berpengaruh sebagai prediktor pro apoptosis maupun anti

apoptosis. Keterbatasan ketiga, tidak dilakukan double staining Bax dan Bcl-2

pada 1 preparat tetapi Bax dan Bcl-2 diukur masing-masing pada preparat yang

berbeda, sehingga diduga dapat terjadi bias. Kelemahan keempat, tikus yang

dilakukan berusia dewasa muda. Meskipun tujuan pemakaian tikus dewasa

muda adalah karena populasi ini yang paling sering mengalami cedera kepala,

tetapi faktor neuroplastisitas pada tikus muda dapat mempengaruhi hasil

penelitian.

135
 BAB 7

KESIMPULAN

7.1 Kesimpulan

Dari penelitian ini dapat disimpulkan bahwa:

1. Terdapat penurunan NSS bermakna pada tikus model cedera otak traumatik

yang diberi catechins dibandingkan tikus model cedera otak traumatik yang

tidak diterapi catechins pada pengamatan hari ketiga dan ketujuh

2. Peningkatan dosis catechins tidak berhubungan dengan penurunan NSS

pada tikus cedera otak traumatik pada hari ketiga dan peningkatan dosis

catechins berhubungan dengan penurunan NSS pada tikus cedera otak

traumatik ketujuh.

3. Terdapat peningkatan rasio ekspresi Bcl-2/Bax bermakna pada jaringan otak

tikus model cedera otak traumatik yang diterapi dengan catechins

dibandingkan tikus dengan cedera otak traumatik yang tidak diterapi

catechins pada pengamatan hari ketiga, tetapi tidak terdapat perbedaan pada

hari ketujuh.

4. Peningkatan dosis catechins berhubungan dengan peningkatan rasio

ekspresi Bcl-2/Bax pada jaringan otak tikus cedera otak traumatik pada

pengamatan hari ketiga dan ketujuh.

5. Kenaikan rasio ekspresi Bcl2/Bax berhubungan dengan penurunan hasil NSS

pada tikus cedera otak traumatik pada hari ketiga dan ketujuh.

7.2 Saran

Terdapat beberapa hal yang perlu dilakukan sebagai tindak lanjut

penelitian ini. Hal tersebut antara lain:

136
1 Perlu dilakukan pengukuran kadar catechins dan masing-masing komponen

catechins pada darah dan otak.

2 Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk menentukan jalur apoptosis yang

paling dipengaruhi oleh catechins.

3 Pengukuran parameter apoptosis lebih awal, karena beberapa parameter,

seperti Bcl-2 sudah kembali normal setelah hari ketiga.

4 Metode imunohistokimia untuk menilai ekspresi Bax dan Bcl-2 sebaiknya

dilakukan dengan double staining, agar tampak jelas masing-masing neuron

yang mengekspresikan protein tersebut.

5 Perlu dilakukan pengamatan pada sel lain di otak selain neuron, yaitu astrosit,

mikroglia, oligodendrosit dan endotel otak.

6 Perlu dilakukan pengukuran parameter untuk menilai stress oksidatif.
7 Perlu dilakukan pengujian dosis yang optimal sebagai terapi cedera otak

traumatik dan perlu dilakukan uji toksisitas.

8 Perlu menggunaan tikus dengan usia lebih seragam dan pada rentang usia

dewasa untuk menghindari faktor neuroplastisitas yang masih baik pada tikus

muda.

137
 DAFTAR PUSTAKA

Albert-Weissenberger, C. and Sirn, A.L. (2010). Experimental traumatic brain

injury, Experimental & translational stroke medicine. 2 (1): 16. doi:
10.1186/2040-7378-2-16.

Albert-Weienberger, C., Vrrallyay, C., Raslan, F., Kleinschnitz, C. and Sirn, A.

(2012) An experimental protocol for mimicking pathomechanism of
traumatic brain injury in mice, Experimental & Translational Stroke
Medicine. 4 (1).

Araya-Farias, M., Gaudreau, A., Rozoy, E. and Bazinet, L. (2014). Rapid HPLC-
MS method for the simultaneous determination of tea catechins and
folates, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 62(19): 42414250.
doi: 10.1021/jf4053258.

Aritonang, S. (2007). Hubungan kadar gula darah dengan outcome cedera

kepala tertutup derajat sedang-berat dengan gambaran brain CT Scan
dalam batas normal. Universitas Diponegoro.

Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan Kementerian Kesehatan

Republik Indonesia (2013). Riset Kesehatan Dasar.

Baehr, M. and Frotscher, M. (2012). Duus Topical Diagnosis in Neurology. 5th

edn. Thieme Medical Publisher.

Bayir, H., Kagan, V. E., Borisenko, G. G., Tyurina, Y. Y., Janesko, K. L., Vagni, V.
A., Billiar, T. R., Williams, D. L. and Kochanek, P. M. (2005). Enhanced
oxidative stress in iNOS-deficient mice after traumatic brain injury: support
for a neuroprotective role of iNOS, J Cereb Blood Flow Metab. 25: 673
684.

Bell, J. D. (2007). Molecular Cross Talk in Traumatic Brain Injury, 27 (9): 2153
2154. doi: 10.1523/JNEUROSCI.4929-06.2007.

Burton, D. and Aisen, M. (2006). Traumatic Brain Injury, in Kurlan (ed.) Rogers
Handbook of Secondary Dementia. New York: Taylor & Francis Group.

Calabrese, V., Stella, G., Butterfield, A. and Scapagnini, G. (2004). Redox

regulation in neurodegeneration and longevity: role of the heme
oxygenase and HSP70 systems in brain stress tolerance, Antioxidant and
Redox Signaling. 6 (5): 895913.

Capruso, D. X. and Levin, H. S. (2006). Neurobehavioral outcome of head

trauma, in Evans, R. W. (ed.) Neurology and Trauma. 2nd edn. Oxford
University Press.

Cernak, I. (2005) Animal models of head trauma, NeuroRx: the journal of the
American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2 (3): 410422.
doi: 10.1602/neurorx.2.3.410.

138
Chacko, S. M., Thambi, P. T., Kuttan, R. and Nishigaki, I. (2010). Beneficial
effects of green tea: a literature review, Chinnese Medicine. 5 (13).

Chaturvedi, R. and Mishra, V. K. (2012). Studies on nutrient uptake and culture

conditions for synthesis of caffeine, (+)-catechine, (-)-epicatechin and (-)-
epigallocatechin gallate in anther derived haploid cell lines of tea
[Camellia sinensis (L)], J Biotechnol Biomater. 2 (6).

Choudhry, O. J., Prestigiacomo, C. J., Gala, N., Slasky, S. and Sifri, Z. C. (2013).
Delayed neurological deterioration after mild head injury: cause, temporal
course, and outcomes, Neurosurgery, 73 (5): 753760. doi:
10.1227/NEU.0000000000000105.

Clark, R. S. B., Jenkins, L., Bayir, H. and Kochanek, P. M. (2015). Biochemical,

Cellular, and Molecular Mechanisms of Neuronal Death and Secondary
Brain Injury in Critical Care, in Jean-Louis, V., Abraham, E., Kochanek, P.,
Moore, F., and Fink, M. (eds) Textbook of Critical Care. 6th edn.
Philadelphia: Elsevier. Available at: http://clinicalgate.com/biochemical-
cellular-and-molecular-mechanisms-of-neuronal-death-and-secondary-
brain-injury-in-critical-care/.

Coronado, V. G., Xu, L., Basavaraju, S. V, McGuire, L. C., Wald, M. M., Faul, M.
D., Guzman, B. R. and Hemphill, J. D. (2011). Surveillance for traumatic
brain injury-related deaths--United States, 1997-2007. Morbidity and
mortality weekly report. Surveillance summaries. doi: 2011-723-
011/21044.

Czabotar, P. E., Lessene, G., Strasser, A. and Adams, J. M. (2014). Control of

apoptosis by the BCL - 2 protein family: implications for physiology and
therapy, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 15 (1): 4963. doi: 10.1038/nrm3722.

DeKosky, S. T., Blennow, K., Ikonomovic, M. D. and Gandy, S. (2013). Acute and
chronic traumatic encephalopathies: pathogenesis and biomarkers.
Nature Reviews Neurology. 9 (4): 192200. doi:
10.1038/nrneurol.2013.36.

Dietrich, W. D. and Bramlett, H. M. (2015). Basic Neuroscience of Trauma, in

Daroff, R. B., Jancovic, J., Mazziotta, J. C., and Pomeroy, S. L. (eds)
Bradleys Neurology in Clinical Practice. 7th edn. Elsevier, pp. 850859.

Dinsmore, J. (2013). Traumatic brain injury: an evidence-based review of

management. Critical Care & Pain.: 17. doi: 10.1093/bjaceaccp/mkt010.

Ekawati, K., Naniek, W., Mimiek, M. and Syarifatun, K. (2012). Pengaruh

konsentrasi ekstrak etanolik daun teh hijau (Camellia Sinesis L.) dalam
sediaan krim terhadap sifat fisik dan aktivitas antibakteri, Sains medika
journal of health and medicine, 4 (2).

Elmore, S. (2007). Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic

pathology. 35 (4): 495516. doi: 10.1080/01926230701320337.

Erdman, J., Oria, M. and Pillsbury, L. (eds) (2011) Nutrition and Traumatic Brain
Injury: Improving Acute and Subacute Health Outcome in Military

139
 Personnel. Washington: The National Academies Press.

Faria, A., Mateus, N. and Calhau, C. (2012). Flavonoid transport across blood-
brain barrier: implication for their direct neuroprotective actions, Nutrition
and Aging. 1: 8997.

Farooqui, A. A. (2012). Phytochemicals, Signal Transduction, and Neurological

Disorders. New York: Springer.

Finnie, J. W. (2013). Neuroinflammation: Beneficial and detrimental effects after

traumatic brain injury, Inflammopharmacol. 21 (4): 309320. doi:
10.1007/s10787-012-0164-2.

Flierl, M. A., Stahel, P. F., Beauchamp, K. M., Morgan, S. J., Smith, W. R. and
Shohami, E. (2009) Mouse close head injury model induced by a weight-
drop device, Nature Protocols, 4: 13281337.

Gahm, C., Holmin, S. and Mathiesen, T. (2005). Nitric oxide synthase expression
after human brain contusion, Neurosurgery. 50: 13191326.

Ghobrial, I. M., Witzig, T. E. and Adjei, A. A. (2005). Targeting apoptosis pathways

in cancer therapy, CA Cancer J Clin. 55: 178194.

Gramza, A., Korczak, J. and Amarowicz, R. (2005). Tea Polyphenols Their

Antioxidant Properties and Biological Activity a Review, Pol. J. Food
Nutr. Sci. 14 (3): 219235.

Hansson, M. J., Mansson, R., Morota, S., Uchino, H., Kallur, T. and Sumi, T.
(2008). Calcium-induced generation of reactiveoxygen species in brain
mitochondrias mediated by permeability transition., Free Radic Biol Med.
45 (3): 284294.

Hariningsih, M.A., Ratnawati, R., Dalhar, M. (2016). Pengaruh Pemberian

Catechins terhadap Ekspresi Nuklear Factor Kappa B (NFKB) dan
Caspase 8 pada Tikus Jantan Rattus norvegicus Model Cedera Otak
Traumatik Fokal [Tesis]. Universitas Brawijaya.

Hongmei, Z. (2012). Extrinsic and Intrinsic Apoptosis Signal Pathway Review, in

Ntuli, T. (ed.) Apoptosis and Medicine. InTech, pp. 322. doi:
10.5772/50129.

Huang, P. (2004). Nitric oxide and cerebral ischemic preconditioning, Cell

Calcium. 36 (34), 323329.

Huang, Y. B., Tsai, M. J., Wu, P. C., Tsai, Y. H., Wu, Y. H. and Fang, J. Y. (2011).
Elastic liposomes as carries for oral delivery and the brain distriburion of
(+)-catechin. Journal of Drug Targeting, Journal of Drug Targeting, 19
(8):709718.

Igney, F. H. and Krammer, P. H. (2002). Death and anti death: resistence to

apoptosis, Nature review, 2: 277288.

Itoh, T., Tabuchi, M., Mizuguchi, N., Imano, M., Tsubaki, M., Nishida, S.,

140
 Hashimoto, S., Matsuo, K., Nakayama, T., Ito, A., Munakata, H. and
Satou, T. (2013). Neuroprotective effect of (-)-epigallocatechin-3-gallate in
rats when administered pre- or post-traumatic brain injury, J Neurol
Transm. 12:, 767783. doi: 10.1007/s00702-012-0918-4.

Jger, A. K. and Saaby, L. (2011) Flavonoids and the CNS, Molecules. 16 (2):
14711485. doi: 10.3390/molecules16021471.

Jung, J. S., Kwak, B. K., Reddy, A. M., Ha, B. C., Shim, H. J., Byun, J. S., Kang,
S. H. and Park, E. S. (2013). Characterization of protothromotic cerebral
infarction model at sensorimotor area of functional map in rat, Journal of
neurological science, 30 (4): 617628.

Kasan, U. (2006). Cedera Kepala Patofisiologi Penanganan dan Biomolekuler.

Surabaya: Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga.

Kaufmann, S. H. and Hengartner, M. O. (2001). Programmed cell death: alive

and well in the millineum, Trend Cell Biol. 11: 526534.

Khalatbary, A. R. (2014). Natural polyphenols and spinal cord injury, Iranian

Biomedical Journal. 18 (3): 120129. doi: 10.6091/ibj.1278.2014.

Khalatbary, A. R. and Ahmadvand, H. (2011). Anti-Inflammatory Effect of the

Epigallocatechin Gallate Following Spinal Cord Trauma in Rat, IBJ. 15
(1&2):. 3137.

Krajewski, S., May, J. K., Krajewska, M., Sikorska, M. and Mossakowski, M. J.

(1995) Upregulation of Bax protein levels in neurons following cerebral
ischemia, J Neurosci. 15 (10): 6364658.

Kumar, V., Abbas, A. K., Fausto, N. and Mitchell, R. (2010). Neoplasia, in

Robbins & Cotran Pathologic Basis of Disease. 8th edn. Saunders
Elsevier, pp. 249342.

Lin, X., Li, M., Shang, A., Hu, Y., Yang, X., Ye, L., Bian, S., Wang, Z. and Zhou, D.
(2012). Neuroglobin expression in rats after traumatic brain injury, Neural
Regen Res, 7 (25): 19601966.

Lorenz, M. (2013). Cellular targets for the beneficial actions of tea polyphenols,
Am J Clin Nutr, 98 (suppl): 1642S-1650S.

Maas, A. I. R., Stocchetti, N. and Bullock, R. (2008). Moderate and severe

traumatic brain injury in adults, The Lancet Neurology. 7 (8): 728741.
doi: 10.1016/S1474-4422(08)70164-9.

Manach, C., Williamson, G., Morand, C., Scalbert, A. and Remesy, C. (2005).
Bioavailability and bioefficacy of polyphenols in human, Am J Clin Nutr. 81
(suppl): 230S242S.

Mandel, S. and Youdim, M. B. H. (2004). Catechin polyphenols:

Neurodegeneration and neuroprotection in neurodegenerative diseases,
Free Radical Biology and Medicine. 37 (3): 304317. doi:
10.1016/j.freeradbiomed.2004.04.012.

141
Mao, W., Yi, X., Qin, J., Tian, M. and Jin, G. (2014). CXCL12 inhibits cortical
neuron apoptosis by increasing the ratio of Bcl-2/Bax after traumatic brain
injury, International Journal of Neuroscience. 124 (4): 281290.

McAllister, T. W. (2011). Neurobiological consequences of traumatic brain injury,

Dialogues in Clinical Neuroscience. 13 (3): 287300.

Mohamed, R. H., Karam, R. A. and Amer, M. G. (2011). Epicatechin attenuates

doxorubicin-induced brain toxicity: Critical role of TNF-, iNOS and NF-B,
Journal of Brain Research Bulletin. 86 (12): 2228. doi:
10.1016/j.brainresbull.2011.07.001.

Nijhawan, D., Honarpour, N. and Wang, X. (2000). Apoptosis in neural

development and disease, Annu Rev Neurosci, 23: 7387.

Novitasari, A., Ratnawati, R., Rianawati, S.B (2016). Pengaruh Pemberian

Catechins terhadap Ekspresi Brain Derived Neurotrophic Factor (BDNF)
dan Caspase 3 pada Tikus Jantan Rattus norvegicus Model Cedera Otak
Traumatik Fokal [Tesis]. Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

Patarroyo, S. and Vargas, V. (2013). Apoptosis and Activation-Induced Cell

Death, in Rudner, J. (ed.) Apoptosis. Intechopen, pp. 7394. doi:
10.1007/978-0-387-89626-7.

Paterniti, I., Genovese, T., Crisafulli, C., Mazzon, E., Di Paola, R., Galuppo, M.,
Bramanti, P. and Cuzzocrea, S. (2009). Treatment with green tea extract
attenuates secondary inflammatory response in an experimental model of
spinal cord trauma, Naunyn-Schmiedebergs Archives of Pharmacology.
380 (2): 179192. doi: 10.1007/s00210-009-0414-z.

Paxinos, G. and Watson, C. (1997). The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates.

3rd edn. San Diego: Academic Press.

Paxinos, G. and Watson, C. (2006). The Rat Brain in Stereotactic Coordinates.

6th edn. San Diego: Academic Press. Available at: http://labs.gaidi.ca/rat-
brain-atlas/.

PERDOSSI (2006). Konsensus Nasional Penanganan Trauma Kapitis dan

Trauma Spinal. Jakarta: Perhimpunan Dokter Spesialis Saraf Indonesia.

Prins, M., Greco, T., Alexander, D. and Giza, C. C. (2013). The pathophysiology
of traumatic brain injury at a glance, Disease models & mechanisms. 6:
130715. doi: 10.1242/dmm.011585.

Raghupathi, R., Strauss, K. I., Zhang, C., Reed, J. C. and Mcintosh, T. K. (2003).
Temporal alteration in cellular Bax:Bcl2 ratio following traumatic brain
injury in rat, J. Neurotrauma. 20 (5): 421435. doi:
10.1089/089771503765355504.Temporal.

Ratnawati, R.; Ciptati; Satuman (2009) Isolasi EGCG dari Teh Hijau Klon GMB4
Jawa Barat. Laporan Progam Insentif Riset Dasar, RISTEK Kementerian
Negara Riset dan Teknologi.

142
Riawan, W., Alfiantya, P. F., Adianingsih, O. R., Zulkarnaen, Jazmi, A. F. and
Hemas, S. A. (2015) Analysis of the histopathology, TNF- of microglia
cells expression, NRG-I/ erbB oligodendrocyte, and Ki67/ apoptosis of
dentate gyrus rattus norvegicus brain after acute traumatic brain injury,
Indonesian Journal of Cancer Chemoprevention, 6(1), pp. 2029.

Roozenbeek, B., Maas, A. I. R. and Menon, D. K. (2013). Changing patterns in

the epidemiology of traumatic brain injury, Nature Reviews Neurology. 9
(4): 231236. doi: 10.1038/nrneurol.2013.22.

dos Santos Silva, D., de Oliveira Brito, J. P., Ibiapina, J. O., Lima, M. F. M. B., de
Vasconcelos Medeiros, A. R. G., e Queiroz, B. H. C., Paiva, A. L. C. and
de Melo Guedes, V. O. (2012). Closed head injury in rats:
Histopathological aspects in an experimental weight drop model, Acta
Cirrgica Brasileira, 27(4), pp. 290294.

Schoch, K. M., Madathil, S. K. and Saatman, K. E. (2012). Genetic Manipulation

of Cell Death and Neuroplasticity Pathways in Traumatic Brain Injury,
Neurotherapeutics, 9 (2): 323337. doi: 10.1007/s13311-012-0107-z.

Selladurai, B. and Reilly, P. (2007). Initial Management of Head Injury: A

Comprehensive Guide. McGraw-Hill Medical.

Shacka, J. J. and Roth, K. A. (2006). Bcl-2 family and the central nervous system:
from rheostat to real complex, Cell Death Differ. 13 (8): 12991304.

Slemmer, J. E., Weber, J. T. and de Zeuw, C. (2004). Cell Death, Glial Protein
Alterations and Elevated s-100b Release in Cerebellar Cell Cultures
Following Mechanically Induced Trauma, Brain research. 1021:159166.

Smith, T. J. (2011). Green tea polyphenols in drug discovery a success or

failure?, Expert Opin Drug Discov. 6 (6): 589595.

Solimun. Metode penelitian kuantitatif. Bandung: Alfabeta; 2001. p.65-68

Stoica, B. A. and Faden, A. I. (2010). Cell death mechanisms and modulation in

traumatic brain injury, Neurotherapeutics. 7 (1): 312.

Strauss, K. I., Narayan, R. K. and Raghupathi, R. (2004). Common patterns of

Bcl-2 family gene expression in two traumatic brain injury models,
Neurotox. Res. 6 (4): 333342. doi: 10.1007/BF03033444.

Susanti, E., Ciptati, Ratnawati, R., Aulanniam and Rudijanto, A. (2015).

Qualitative analysis of catechins from green tea GMB-4 clone using HPLC
and LC-MS/MS, Asian Pac J Trop Biomed. 5 (12): 10461050.

Sutherland, B. A., Rahman, R. M. A. and Appleton, I. (2006). Mechanism of action

of green tea cathechins, with a focus on ischemia-induced
neurodegeneration, Journal of National Biochemistry. 17: 291306.

Suzuki, M., Tabuchi, M., Ikeda, M., Umegaki, K. and Tomita, T. (2004). Protective
effects of green tea catechins on cerebral ischemic damage, Med Sci
Monit. 10 (6): BR 166-174.

143
Tamm, I., Schriever, F. and Dorken, B. (2001). Apoptosis: implications of basic
research for clinical oncology, Lancet Oncol. 2: 3342.

Taylor, R.C., Cullen, S.P. and Martin, S.J. (2008). Apoptosis: controlled demolition
at the cellular level. Nature reviews Molecular cell biology. 9 (3): 231241.

Tsai, Y.D., Liliang, P.C., Cho, C.L., Chen, J.S., Lu, K., Liang, C.L. and Wang, K.
W. (2013). Delayed neurovascular inflammation after mild traumatic brain
injury in rats, Brain Injury, 27 (3): 361365. doi:
10.3109/02699052.2012.750738

Utami, S.D., Ratnawati, R., Dalhar, M. (2016). Pengaruh Pemberian Catechins

terhadap Ekspresi TNF- dan Apoptosis Jaringan Otak dan Keluaran
Klinis Tikus Jantan Rattus norvegicus Model Cedera Otak Traumatik
Fokal [Tesis]. Universitas Brawijaya.

Valdevelde, M., Higgins, R. and Oevermann, A. (2012). Veterinary

Neuropathology: Essentials of Theory and Practice. West Sussex: Wiley-
Blackwell.

Vaskivuo, T. E., Stenbck, F. and Tapanainen, J. S. (2002). Apoptosis and

apoptosis-related factors Bcl-2, Bax, tumor necrosis factor-alpha, and NF-
kappaB in human endometrial hyperplasia and carcinoma, Cancer, 95 (7):
14631471. doi: 10.1002/cncr.10876.

Vauzour, D. (2012). Dietary polyphenols as modulators of brain functions:

Biological actions and molecular mechanisms underpinning their
beneficial effects, Oxidative Medicine and Cellular Longevity. doi:
10.1155/2012/914273.

Werner, C. and Engelhard, K. (2007). Pathophysiology of traumatic brain injury,

British Journal of Anaesthesia, 99 (1): 49. doi: 10.1093/bja/aem131.

Wu, Q., Huang, Y., Dhital, S., Sharma, S. K., Chen, A. C., Whalen, M. J. and
Hamblin, M. R. (2010). Low laser therapy for traumatic brain injury, Proc.
Of SPIE. 7552.

Xiong, Y., Mahmood, A. and Chopp, M. (2014). Animal models of traumatic brain
injury, Nature Reviews Neuroscience. 14 (2): 128142.

Yashin, A., Nemzer, B. and Yashin, Y. (2012). Bioavailability of tea components,

Journal of food research, 1 (2): 281290.

Zhang, B., Wang, B., Cao, S. and Wang, Y. (2015). Epigallocatechin-3-Gallate

(EGCG) Attenuates Traumatic Brain Injury by Inhibition of Edema
Formation and Oxidative Stress, Korean J Physiol Pharmacol. 19: 491
497.

Zhang, X., Chen, Y., Jenkins, L. W., Kochanek, P. M. and Clark, R. S. B. (2005).
Bench-to-bedside review: Apoptosis/programmed cell death triggered by
traumatic brain injury, Critical care, 9 (1): 6675. doi: 10.1186/cc2950.

144
LAMPIRAN
LAMPIRAN 1. KETERANGAN LAIK ETIK

145
LAMPIRAN 2. LEMBAR PERMINTAAN KONSULTASI SLIDE PENELITIAN

146
LAMPIRAN 3. UJI NORMALITAS DAN HOMOGENITAS

1. Bax
a. Uji Normalitas
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Bax_3hari .253 20 .002 .860 20 .008
a. Lilliefors Significance Correction
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic Df Sig. Statistic df Sig.
Bax_7hari .274 20 .000 .859 20 .008
a. Lilliefors Significance Correction
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
perbandingan Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Bax K- 3 .236 4 . .966 4 .815
K+ 3 .250 4 . .927 4 .577
513 mg/kgBB/hari 3 .250 4 . .963 4 .797
926 mg/kgBB/hari 3 .231 4 . .924 4 .562
1113 mg/kgBB/hari 3 .250 4 . .945 4 .683
K- 7 .220 4 . .980 4 .900
K+ 7 .250 4 . .958 4 .765
513 mg/kgBB/hari 7 .314 4 . .854 4 .240
926 mg/kgBB/hari 7 .283 4 . .863 4 .272
1113 mg/kgBB/hari 7 .283 4 . .863 4 .272
a. Lilliefors Significance Correction

b. Uji Homogenitas
Test of Homogeneity of Variances
Bax_3hari
Levene Statistic df1 df2 Sig.
.763 4 15 .566
Test of Homogeneity of Variances
Bax_7hari
Levene Statistic df1 df2 Sig.
2.064 4 15 .137

147
2. Bcl-2
a. Uji Normalitas
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic Df Sig. Statistic df Sig.
*
Bcl_2_3hari .139 20 .200 .942 20 .260
*. This is a lower bound of the true significance.
a. Lilliefors Significance Correction
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Bcl_2_7hari .204 20 .028 .866 20 .010
a. Lilliefors Significance Correction
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
perbandingan Statistic df Sig. Statistic df Sig.
Bcl_2 K- 3 .250 4 . .864 4 .274
K+ 3 .259 4 . .904 4 .450
513 mg/kgBB/hari 3 .255 4 . .833 4 .177
926 mg/kgBB/hari 3 .253 4 . .847 4 .216
1113 mg/kgBB/hari 3 .256 4 . .838 4 .189
K- 7 .257 4 . .833 4 .176
K+ 7 .255 4 . .836 4 .184
513 mg/kgBB/hari 7 .260 4 . .826 4 .158
926 mg/kgBB/hari 7 .254 4 . .840 4 .196
1113 mg/kgBB/hari 7 .250 4 . .858 4 .255
a. Lilliefors Significance Correction

b. Uji Homogenitas
Test of Homogeneity of Variances
Bcl_2_3hari
Levene Statistic df1 df2 Sig.
.292 4 15 .878
Test of Homogeneity of Variances
Bcl_2_7hari
Levene Statistic df1 df2 Sig.
.127 4 15 .970

5. Rasio Bcl-2/Bax Hari Ketiga

a. Uji Normalitas
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
RasioBclBax_3hari .333 20 .000 .679 20 .000
a. Lilliefors Significance Correction
b. Uji Homogenitas
Test of Homogeneity of Variances
RasioBclBax_3hari
Levene Statistic df1 df2 Sig.
4.707 4 15 .012

6. Rasio Bcl-2/Bax Hari Ketujuh

a. Uji Normalitas
Tests of Normality
148
 Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic df Sig. Statistic df Sig.
RasioBclBax_7hari .265 20 .001 .727 20 .000
a. Lilliefors Significance Correction

b. Uji Homogenitas
Test of Homogeneity of Variances
RasioBclBax_7hari
Levene Statistic df1 df2 Sig.
2.744 4 15 .068

7. NSS Hari Ketiga dan Ketujuh

a. Uji Normalitas
Tests of Normality
Kolmogorov-Smirnova Shapiro-Wilk
Statistic Df Sig. Statistic df Sig.
NSS3_0 .219 20 .013 .905 20 .052
NSS3_3 .175 20 .108 .923 20 .112
NSS7_0 .285 20 .000 .867 20 .010
NSS7_3 .190 20 .058 .906 20 .054
NSS7_7 .261 20 .001 .880 20 .018
a. Lilliefors Significance Correction

b. Uji Homogenitas
Test of Homogeneity of Variances
NSS3_3
Levene Statistic df1 df2 Sig.
2.054 4 15 .138

149
LAMPIRAN 3. UJI BEDA DAN UJI LANJUTAN EKSPRESI BAX
1. Bax Hari Ketiga
a. Uji Kruskal Wallis
Ranks
Perlakuan N Mean Rank
Bax_3hari kontrol negatif 4 2.50
kontrol positif 4 18.50
513 mg/kgbb/hari 4 9.88
926 mg/kgbb/hari 4 14.25
1113 mg/kgbb/hari 4 7.38
Total 20
Test Statisticsa,b
Bax_3hari
Chi-Square 17.423
Df 4
Asymp. Sig. .002
a. Kruskal Wallis Test
b. Grouping Variable: perlakuan
b. Uji Mann-Whitney
Kontrol Negatif dengan Kontrol Positif
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_3hari kontrol negatif 4 2.50 10.00
kontrol positif 4 6.50 26.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_3hari kontrol negatif 4 2.50 10.00
513 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_3hari kontrol negatif 4 2.50 10.00
926 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
150
 Total 8
Test Statisticsa
Bax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_3hari kontrol negatif 4 2.50 10.00
1113 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.323
Asymp. Sig. (2-tailed) .020
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Positif dengan Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_3hari kontrol positif 4 6.50 26.00
513 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Positif dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_3hari kontrol positif 4 6.50 26.00
926 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
151
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Positif dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_3hari kontrol positif 4 6.50 26.00
1113 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.323
Asymp. Sig. (2-tailed) .020
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_3hari 513 mg/kgbb/hari 4 2.75 11.00
926 mg/kgbb/hari 4 6.25 25.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_3hari
Mann-Whitney U 1.000
Wilcoxon W 11.000
Z -2.021
Asymp. Sig. (2-tailed) .043
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .057b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_3hari 513 mg/kgbb/hari 4 5.63 22.50
1113 mg/kgbb/hari 4 3.38 13.50
Total 8
Test Statisticsa
Bax_3hari
Mann-Whitney U 3.500
Wilcoxon W 13.500
Z -1.315
Asymp. Sig. (2-tailed) .189
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .200b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari
Ranks
152
 Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_3hari 926 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
1113 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.323
Asymp. Sig. (2-tailed) .020
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

2. Bax Hari Ketujuh

a. Uji Kruskal Wallis
Ranks
Perlakuan N Mean Rank
Bax_7hari kontrol negative 4 2.50
kontrol positif 4 18.50
513 mg/kgbb/hari 4 14.50
926 mg/kgbb/hari 4 10.50
1113 mg/kgbb/hari 4 6.50
Total 20
Test Statisticsa,b
Bax_7hari
Chi-Square 18.313
Df 4
Asymp. Sig. .001
a. Kruskal Wallis Test
b. Grouping Variable: perlakuan

b. Uji Mann-Whitney
Kontrol Negatif dengan Kontrol Positif
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_7hari kontrol negatif 4 2.50 10.00
kontrol positif 4 6.50 26.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari
Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_7hari kontrol negatif 4 2.50 10.00
513 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00

153
 Total 8
Test Statisticsa
Bax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari
Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_7hari kontrol negatif 4 2.50 10.00
926 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.323
Asymp. Sig. (2-tailed) .020
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_7hari kontrol negatif 4 2.50 10.00
1113 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.323
Asymp. Sig. (2-tailed) .020
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Positif dengan Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_7hari kontrol positif 4 6.50 26.00
513 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309

154
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Positif dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_7hari kontrol positif 4 6.50 26.00
926 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.323
Asymp. Sig. (2-tailed) .020
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Positif dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_7hari kontrol positif 4 6.50 26.00
1113 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.323
Asymp. Sig. (2-tailed) .020
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_7hari 513 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
926 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.323
Asymp. Sig. (2-tailed) .020
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

155
 Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_7hari 513 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
1113 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.323
Asymp. Sig. (2-tailed) .020
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
Bax_7hari 926 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
1113 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
Bax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.337
Asymp. Sig. (2-tailed) .019
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

156
LAMPIRAN 4. UJI BEDA DAN UJI LANJUTAN EKSPRESI BCL-2
1. Bcl-2 Hari Ketiga
a. Uji ANOVA
ANOVA
Bcl_2_3hari
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 132.017 4 33.004 2.766 .066
Within Groups 178.973 15 11.932
Total 310.989 19

2. Bcl-2 Hari Ketujuh

a. Uji Kruskal Wallis
Ranks
Perlakuan N Mean Rank
Bcl_2_7hari kontrol negative 4 13.63
kontrol positif 4 8.88
513 mg/kgbb/hari 4 12.00
926 mg/kgbb/hari 4 8.25
1113 mg/kgbb/hari 4 9.75
Total 20
a,b
Test Statistics
Bcl_2_7hari
Chi-Square 2.321
Df 4
Asymp. Sig. .677
a. Kruskal Wallis Test
b. Grouping Variable: perlakuan

157
LAMPIRAN 5. UJI BEDA DAN UJI LANJUTAN RASIO EKSPRESI BCL-2/BAX

1. Rasio Bcl-2/Bax Hari Ketiga

a. Uji Kruskal Wallis
Ranks
perlakuan N Mean Rank
RasioBclBax_3hari kontrol negatif 4 18.50
kontrol positif 4 2.50
513 mg/kgbb/hari 4 9.38
926 mg/kgbb/hari 4 10.13
1113 mg/kgbb/hari 4 12.00
Total 20
Test Statisticsa,b
RasioBclBax_3hari
Chi-Square 15.058
Df 4
Asymp. Sig. .005
a. Kruskal Wallis Test
b. Grouping Variable: perlakuan

b. Uji Mann Whitney

Kontrol Negatif dengan Kontrol Positif
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_3hari kontrol negatif 4 6.50 26.00
kontrol positif 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
RasioBclBax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_3hari kontrol negatif 4 6.50 26.00
513 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8

Test Statisticsa
RasioBclBax_3hari
Mann-Whitney U .000

158
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari
Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_3hari kontrol negatif 4 6.50 26.00
926 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
RasioBclBax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_3hari kontrol negatif 4 6.50 26.00
1113 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
a
Test Statistics
RasioBclBax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Positif dengan Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_3hari kontrol positif 4 2.50 10.00
513 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
Total 8

Test Statisticsa
RasioBclBax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

159
Kontrol Positif dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_3hari kontrol positif 4 2.50 10.00
926 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
Total 8
a
Test Statistics
RasioBclBax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
Kontrol Positif dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_3hari kontrol positif 4 2.50 10.00
1113 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
Total 8
a
Test Statistics
RasioBclBax_3hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_3hari 513 mg/kgbb/hari 4 4.13 16.50
926 mg/kgbb/hari 4 4.88 19.50
Total 8

Test Statisticsa
RasioBclBax_3hari
Mann-Whitney U 6.500
Wilcoxon W 16.500
Z -.436
Asymp. Sig. (2-tailed) .663
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .686b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_3hari 513 mg/kgbb/hari 4 3.75 15.00
1113 mg/kgbb/hari 4 5.25 21.00

160
 Total 8
Test Statisticsa
RasioBclBax_3hari
Mann-Whitney U 5.000
Wilcoxon W 15.000
Z -.866
Asymp. Sig. (2-tailed) .386
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .486b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_3hari 926 mg/kgbb/hari 4 3.75 15.00
1113 mg/kgbb/hari 4 5.25 21.00
Total 8
Test Statisticsa
RasioBclBax_3hari
Mann-Whitney U 5.000
Wilcoxon W 15.000
Z -.866
Asymp. Sig. (2-tailed) .386
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .486b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
2. Rasio Bcl-2/Bax Hari Ketujuh
a. Uji Kruskal Wallis
Ranks
Perlakuan N Mean Rank
RasioBclBax_7hari kontrol negatif 4 18.50
kontrol positif 4 4.00
513 mg/kgbb/hari 4 10.00
926 mg/kgbb/hari 4 8.63
1113 mg/kgbb/hari 4 11.38
Total 20
a,b
Test Statistics
RasioBclBax_7hari
Chi-Square 12.680
Df 4
Asymp. Sig. .013
a. Kruskal Wallis Test
b. Grouping Variable: perlakuan

b. Uji Mann Whitney

Kontrol Negatif dengan Kontrol Positif
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_7hari kontrol negatif 4 6.50 26.00
kontrol positif 4 2.50 10.00
Total 8
a
Test Statistics
RasioBclBax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000

161
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_7hari kontrol negatif 4 6.50 26.00
513 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
RasioBclBax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_7hari kontrol negatif 4 6.50 26.00
926 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8

Test Statisticsa
RasioBclBax_7h
ari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_7hari kontrol negatif 4 6.50 26.00
1113 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
RasioBclBax_7hari
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.309
Asymp. Sig. (2-tailed) .021
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.
162
Kontrol Positif dengan Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_7hari kontrol positif 4 3.00 12.00
513 mg/kgbb/hari 4 6.00 24.00
Total 8
Test Statisticsa
RasioBclBax_7hari
Mann-Whitney U 2.000
Wilcoxon W 12.000
Z -1.732
Asymp. Sig. (2-tailed) .083
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .114b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Positif dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_7hari kontrol positif 4 3.00 12.00
926 mg/kgbb/hari 4 6.00 24.00
Total 8

Test Statisticsa
RasioBclBax_7h
ari
Mann-Whitney U 2.000
Wilcoxon W 12.000
Z -1.732
Asymp. Sig. (2-tailed) .083
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .114b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Positif dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_7hari kontrol positif 4 3.00 12.00
1113 mg/kgbb/hari 4 6.00 24.00
Total 8
Test Statisticsa
RasioBclBax_7hari
Mann-Whitney U 2.000
Wilcoxon W 12.000
Z -1.732
Asymp. Sig. (2-tailed) .083
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .114b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks

163
RasioBclBax_7hari 513 mg/kgbb/hari 4 5.13 20.50
926 mg/kgbb/hari 4 3.88 15.50
Total 8
Test Statisticsa
RasioBclBax_7hari
Mann-Whitney U 5.500
Wilcoxon W 15.500
Z -.726
Asymp. Sig. (2-tailed) .468
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .486b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_7hari 513 mg/kgbb/hari 4 3.88 15.50
1113 mg/kgbb/hari 4 5.13 20.50
Total 8
a
Test Statistics
RasioBclBax_7hari
Mann-Whitney U 5.500
Wilcoxon W 15.500
Z -.726
Asymp. Sig. (2-tailed) .468
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .486b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
RasioBclBax_7hari 926 mg/kgbb/hari 4 3.75 15.00
1113 mg/kgbb/hari 4 5.25 21.00
Total 8
Test Statisticsa
RasioBclBax_7hari
Mann-Whitney U 5.000
Wilcoxon W 15.000
Z -.866
Asymp. Sig. (2-tailed) .386
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .486b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

164
LAMPIRAN 7. UJI BEDA DAN UJI LANJUTAN NSS
1. NSS Hari Ketiga
a. Uji ANOVA
ANOVA
NSS3_3
Sum of Squares df Mean Square F Sig.
Between Groups 39.700 4 9.925 17.515 .000
Within Groups 8.500 15 .567
Total 48.200 19

b. Uji Tukey
Multiple Comparisons
Dependent Variable: NSS3_3
Tukey HSD
95%
Confidence
Mean Difference Interval
(I) perlakuan (J) perlakuan (I-J) Std. Error Sig. Lower Bound
kontrol negatif kontrol positif -4.250* .532 .000 -5.89
513 mg/kgbb/hari -1.750* .532 .034 -3.39
926 mg/kgbb/hari -3.000* .532 .000 -4.64
1113 mg/kgbb/hari -2.500* .532 .002 -4.14
kontrol positif kontrol negatif 4.250* .532 .000 2.61
513 mg/kgbb/hari 2.500* .532 .002 .86
926 mg/kgbb/hari 1.250 .532 .184 -.39
1113 mg/kgbb/hari 1.750* .532 .034 .11
513 mg/kgbb/hari kontrol negatif 1.750* .532 .034 .11
kontrol positif -2.500* .532 .002 -4.14
926 mg/kgbb/hari -1.250 .532 .184 -2.89
1113 mg/kgbb/hari -.750 .532 .632 -2.39
926 mg/kgbb/hari kontrol negatif 3.000* .532 .000 1.36
kontrol positif -1.250 .532 .184 -2.89
513 mg/kgbb/hari 1.250 .532 .184 -.39
1113 mg/kgbb/hari .500 .532 .877 -1.14
1113 mg/kgbb/hari kontrol negatif 2.500* .532 .002 .86
kontrol positif -1.750* .532 .034 -3.39
513 mg/kgbb/hari .750 .532 .632 -.89
926 mg/kgbb/hari -.500 .532 .877 -2.14

Multiple Comparisons
165
Dependent Variable: NSS3_3
Tukey HSD
95% Confidence Interval
(I) perlakuan (J) perlakuan Upper Bound
kontrol negatif kontrol positif -2.61
513 mg/kgbb/hari -.11
926 mg/kgbb/hari -1.36
1113 mg/kgbb/hari -.86
kontrol positif kontrol negatif 5.89
513 mg/kgbb/hari 4.14
926 mg/kgbb/hari 2.89
1113 mg/kgbb/hari 3.39
513 mg/kgbb/hari kontrol negatif 3.39
kontrol positif -.86
926 mg/kgbb/hari .39
1113 mg/kgbb/hari .89
926 mg/kgbb/hari kontrol negatif 4.64
kontrol positif .39
513 mg/kgbb/hari 2.89
1113 mg/kgbb/hari 2.14
1113 mg/kgbb/hari kontrol negatif 4.14
kontrol positif -.11
513 mg/kgbb/hari 2.39
926 mg/kgbb/hari 1.14
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.

c. Uji Regresi
Variables Entered/Removeda
Variables Variables
Model Entered Removed Method
1 dosisb . Enter
a. Dependent Variable: NSS3_3
b. All requested variables entered.
Model Summary
Adjusted R
Model R R Square Square Std. Error of the Estimate
1 .441a .194 .137 1.119
a. Predictors: (Constant), dosis
ANOVAa
Model Sum of Squares df Mean Square F Sig.
1 Regression 4.224 1 4.224 3.374 .088b
Residual 17.526 14 1.252
Total 21.750 15
a. Dependent Variable: NSS3_3
b. Predictors: (Constant), dosis
Coefficientsa
Standardized
Unstandardized Coefficients Coefficients
Model B Std. Error Beta t Sig.
1 (Constant) 3.642 .502 7.248 .000
dosis -.001 .001 -.441 -1.837 .088
a. Dependent Variable: NSS3_3

166
2. NSS Hari Ketujuh
a. Uji Kruskal Wallis
Ranks
Perlakuan N Mean Rank
NSS7_7 kontrol negatif 4 2.50
kontrol positif 4 18.50
513 mg/kgbb/hari 4 10.63
926 mg/kgbb/hari 4 13.00
1113 mg/kgbb/hari 4 7.88
Total 20
a,b
Test Statistics
NSS7_7
Chi-Square 17.124
Df 4
Asymp. Sig. .002
a. Kruskal Wallis Test
b. Grouping Variable: perlakuan

b. Uji Mann Whitney

Kontrol Negatif dengan Kontrol Positif
Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
NSS7_7 kontrol negatif 4 2.50 10.00
kontrol positif 4 6.50 26.00
Total 8
Test Statisticsa
NSS7_7
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.477
Asymp. Sig. (2-tailed) .013
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari

Ranks
Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
NSS7_7 kontrol negatif 4 2.50 10.00
513 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
Total 8
Test Statisticsa
NSS7_7
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.530
Asymp. Sig. (2-tailed) .011
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari

Ranks

167
 Perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
NSS7_7 kontrol negatif 4 2.50 10.00
926 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
Total 8
Test Statisticsa
NSS7_7
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.530
Asymp. Sig. (2-tailed) .011
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Negatif dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
NSS7_7 kontrol negatif 4 2.50 10.00
1113 mg/kgbb/hari 4 6.50 26.00
Total 8
Test Statisticsa
NSS7_7
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.530
Asymp. Sig. (2-tailed) .011
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Positif dengan Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
NSS7_7 kontrol positif 4 6.50 26.00
513 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
NSS7_7
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.381
Asymp. Sig. (2-tailed) .017
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Positif dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
NSS7_7 kontrol positif 4 6.50 26.00
926 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
NSS7_7
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.381
Asymp. Sig. (2-tailed) .017
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b

168
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Kontrol Positif dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
NSS7_7 kontrol positif 4 6.50 26.00
1113 mg/kgbb/hari 4 2.50 10.00
Total 8
Test Statisticsa
NSS7_7
Mann-Whitney U .000
Wilcoxon W 10.000
Z -2.381
Asymp. Sig. (2-tailed) .017
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .029b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
NSS7_7 513 mg/kgbb/hari 4 3.63 14.50
926 mg/kgbb/hari 4 5.38 21.50
Total 8
Test Statisticsa
NSS7_7
Mann-Whitney U 4.500
Wilcoxon W 14.500
Z -1.323
Asymp. Sig. (2-tailed) .186
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .343b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Catechins dosis 513 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
NSS7_7 513 mg/kgbb/hari 4 5.50 22.00
1113 mg/kgbb/hari 4 3.50 14.00
Total 8
Test Statisticsa
NSS7_7
Mann-Whitney U 4.000
Wilcoxon W 14.000
Z -1.323
Asymp. Sig. (2-tailed) .186
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .343b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

Catechins dosis 926 mg/kgBB/hari dengan Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Ranks
perlakuan N Mean Rank Sum of Ranks
NSS7_7 926 mg/kgbb/hari 4 6.13 24.50
1113 mg/kgbb/hari 4 2.88 11.50
Total 8

169
 Test Statisticsa
NSS7_7
Mann-Whitney U 1.500
Wilcoxon W 11.500
Z -2.055
Asymp. Sig. (2-tailed) .040
Exact Sig. [2*(1-tailed Sig.)] .057b
a. Grouping Variable: perlakuan
b. Not corrected for ties.

170
LAMPIRAN 8. UJI KORELASI

1. Rasio Bcl-2/Bax 3 Hari

Correlations
dosis RasioBclBax_3hari
Spearman's rho dosis Correlation Coefficient 1.000 .710**
Sig. (2-tailed) . .002
N 16 16
RasioBclBax_3hari Correlation Coefficient .710** 1.000
Sig. (2-tailed) .002 .
N 16 16
**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

2. Rasio Bcl-2/Bax 7 Hari

Correlations
RasioBclBax_7h
dosis ari
Spearman's rho dosis Correlation Coefficient 1.000 .504*
Sig. (2-tailed) . .047
N 16 16
RasioBclBax_7hari Correlation Coefficient .504* 1.000
Sig. (2-tailed) .047 .
N 16 16
*. Correlation is significant at the 0.05 level (2-tailed).

3. NSS 3 Hari
Correlations
dosis NSS3_3
dosis Pearson Correlation 1 -.441
Sig. (2-tailed) .088
N 16 16
NSS3_3 Pearson Correlation -.441 1
Sig. (2-tailed) .088
N 16 20

4. NSS 7 Hari
Correlations
dosis NSS7_7
Spearman's rho dosis Correlation Coefficient 1.000 -.754**
Sig. (2-tailed) . .001
N 16 16
NSS7_7 Correlation Coefficient -.754** 1.000
Sig. (2-tailed) .001 .
N 16 20
**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

171
LAMPIRAN 9. UJI KORELASI RASIO EKSPRESI BCL-2/BAX DENGAN NSS
a. Kontrol Negatif
Correlations
NSS3_3 RasioBclBax_3hari
Spearman's rho NSS3_3 Correlation Coefficient . .
Sig. (2-tailed) . .
N 4 4
RasioBclBax_3hari Correlation Coefficient . 1.000
Sig. (2-tailed) . .
N 4 4
Correlations
NSS7_7 RasioBclBax_7hari
Spearman's rho NSS7_7 Correlation Coefficient . .
Sig. (2-tailed) . .
N 4 4
RasioBclBax_7hari Correlation Coefficient . 1.000
Sig. (2-tailed) . .
N 4 4
b. Kontrol Positif
Correlations
NSS3_3 RasioBclBax_3hari
Spearman's rho NSS3_3 Correlation Coefficient 1.000 -.623**
Sig. (2-tailed) . .010
N 16 16
RasioBclBax_3hari Correlation Coefficient -.623** 1.000
Sig. (2-tailed) .010 .
N 16 16

**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).

Correlations
NSS7_7 RasioBclBax_7hari
Spearman's rho NSS7_7 Correlation Coefficient 1.000 -.738**
Sig. (2-tailed) . .001
N 16 16
RasioBclBax_7hari Correlation Coefficient -.738** 1.000
Sig. (2-tailed) .001 .
N 16 16
**. Correlation is significant at the 0.01 level (2-tailed).
c. Catechins Dosis 513 mg/kgBB/hari
Correlations
NSS3_3 RasioBclBax_3hari
Spearman's rho NSS3_3 Correlation Coefficient 1.000 -.775
Sig. (2-tailed) . .225
N 4 4
RasioBclBax_3hari Correlation Coefficient -.775 1.000
Sig. (2-tailed) .225 .
N 4 4
Correlations
NSS7_7 RasioBclBax_7hari
Spearman's rho NSS7_7 Correlation Coefficient 1.000 -.775
Sig. (2-tailed) . .225
N 4 4
RasioBclBax_7hari Correlation Coefficient -.775 1.000
Sig. (2-tailed) .225 .
N 4 4

172
d. Catechins Dosis 926 mg/kgBB/hari
Correlations
NSS3_3 RasioBclBax_3hari
NSS3_3 Pearson Correlation 1 -.037
Sig. (2-tailed) .963
N 4 4
RasioBclBax_3hari Pearson Correlation -.037 1
Sig. (2-tailed) .963
N 4 4
Correlations
NSS7_7 RasioBclBax_7hari
Spearman's rho NSS7_7 Correlation Coefficient 1.000 -.775
Sig. (2-tailed) . .225
N 4 4
RasioBclBax_7hari Correlation Coefficient -.775 1.000
Sig. (2-tailed) .225 .
N 4 4

e. Catechins dosis 1113 mg/kgBB/hari

Correlations
NSS3_3 Bcl_2_3hari
Spearman's rho NSS3_3 Correlation Coefficient 1.000 -.447
Sig. (2-tailed) . .553
N 4 4
Bcl_2_3hari Correlation Coefficient -.447 1.000
Sig. (2-tailed) .553 .
N 4 20
Correlations
NSS7_7 RasioBclBax_7hari
Spearman's rho NSS7_7 Correlation Coefficient 1.000 .775
Sig. (2-tailed) . .225
N 4 4
RasioBclBax_7hari Correlation Coefficient .775 1.000
Sig. (2-tailed) .225 .
N 4 4

173
LAMPIRAN 10. DATA AWAL

Bax Bcl-2 Bcl-2 / Bax NSS 3hari NSSS 7 hari

H-3 H-7 H-3 H-7 H-3 H-7 H0 H3 H0 H3 H7
4.00 4.80 22.00 22.20 5.5 4.62
0 0 0 0 0 0
5.00 5.10 13.30 12.20 2.6 2.39
6 0 0 0 0 0
K-
5.80 5.60 12.70 12.10 2.1 2.16
9 0 0 0 0 0
4.90 5.20 16.00 15.50 3.2 2.98
6 0 0 0 0 0
25.70 18.20 11.10 16.70 0.4 0.92
3 3 3 5 5
3
25.90 17.00 6.00 9.90 0.2 0.58
2 4 3 6 4
3
K+
26.70 15.50 6.80 10.00 0.2 0.64
5 6 4 6 6
5
26.10 16.90 7.90 12.20 0.3 0.72
3 4 3 6 5
0
15.80 13.50 16.20 20.20 1.0 1.50
2 1 4 3 1
2
15.40 14.20 8.70 11.10 0.5 0.78
4 2 3 2 2
513 6
mg/kgbb 14.70 13.60 8.80 11.10 0.6 0.82
3 2 3 2 2
0
15.30 13.70 11.20 14.10 0.7 1.03
3 2 3 2 2
3
16.60 13.00 17.60 19.40 1.0 1.50
3 3 5 3 2
6
16.80 13.00 9.70 9.50 0.5 0.73
6 4 3 2 3
926 8
mg/kgbb 15.60 12.80 9.40 9.70 0.6 .76
3 2 3 3 2
0
16.30 12.90 12.20 12.90 0.7 1.00
4 3 4 3 2
5
1113 15.10 12.10 16.50 18.90 1.0 1.56
3 2 6 4 2
mg/kggbb 9
14.70 12.10 9.80 10.30 0.6 0.85
2 2 2 1 1
7
14.90 11.90 9.90 9.80 0.6 0.82 5 3 4 3 1
6
174
14.90 12.00 12.10 13.00 0.8 1.08
3 3 4 3 1
1

175
 RIWAYAT HIDUP

Annisa Nurul Arofah lahir di Malang, 13 Agustus 1986, anak dari bapak Hemawan Setyo Bhakti

dan ibu Indah Serinurani Effendi. Penulis menyelesaikan pendidikan di MIN 1 Malang pada tahun

1998, SMP Negeri 3 Malang pada tahun 2001, SMA Negeri 3 Malang pada tahun 2004, dan

Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga pada tahun 2010. Penulis saat ini sedang

menyelesaikan Program Pendidikan Dokter Spesialis Ilmu Penyakit Saraf dan Program Studi Ilmu

Biomedik Pasca Sarjana Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya Malang.

176