TCNICAS Y MTODOS

Bsqueda, aislamiento y seleccin de microorganismos productores de

exopolisacridos.

DOCENTES
Dr. RAMREZ SAAD HUGO CESAR
Mtro. MADRID JIMNEZ LUIS MARIO

ALUMNOS: Aguilar Gonzlez Edgar Rigel, Corona Galvn Itzel Abigail, Prez Guzmn
Manuel, Regules Carrera Luis Daniel, Ruiz Serrano Orlando Gustavo
 Recoleccin de muestras de pulque y kfir

Colocar el pulque y el Kfir en un recipiente estril de 250 ml y etiquetarlo con la

fecha, lugar, hora de muestreo y observaciones que describen las caractersticas
en que se encontraba la muestra; tapar inmediatamente de forma hermtica y
transportarlo al laboratorio para su anlisis (NOM-110-SSA1-1994).
Preparacin de agua peptonada como diluyente.
Disolver 1 g de peptona, 8.5 g de NaCl en 1L de agua destilada y ajustar a pH 7
0.1 con NaOH 1 N. Esterilizar a 121 1,0C durante 15 minutos. Despus de la
esterilizacin, el pH y los volmenes finales de la solucin de trabajo debern ser
iguales a los iniciales (NOM-110-SSA1-1994).
Realizar 2 litros.
Preparacin y dilucin de muestras.
Para las 4 muestras de pulque (muestras lquidas): Agitar la muestra manualmente
hasta homogenizar. Tomar 1 ml de la muestra y llevar a volumen de 10 mL con el
diluyente, el cual debe encontrarse a una temperatura similar, se debe evitar el
contacto entre la pipeta y el diluyente.
Para las 2 muestras de kfir (muestras semislidas): Pesar 50 mg de la muestra por
analizar y llevar a volumen de 500 mL con el diluyente. Licuar la muestra.
Homogenizar mediante agitacin (NOM-110-SSA1-1994).

Realizar diluciones 10-1 hasta 10-6 del pulque y del Kfir. Tomar 1 ml de muestra y llevar a
volumen de 10 mL con el diluyente como se muestra en el Diagrama 1 y 2 (NOM-110-
SSA1-1994).

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 Diagrama 1. Preparacin y dilucin de muestras de pulque para anlisis microbiolgico.

Diagrama 2. Preparacin y dilucin de muestras de kfir para anlisis microbiolgico.

Preparacin y elaboracin de medios de cultivo.
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 Agar y caldo de piloncillo:
Agar
Disolver 150 g de piloncillo, 5 g de
extracto de malta, 5 g de extracto
de levadura, 15 g de K2HPO4,
0.01g de MnCl2 0.01 g/L de NaCl y
0.05 g de CaCl2 en 1 L de agua
destilada a pH 7,0.
El medio antes de ser esterilizado
se debe centrifugar por 15 min a
2500 rpm para eliminar ciertos
residuos slidos que contena el
piloncillo.
Agregar 20 ml de agar-agar.
Tapar el matraz con tapn de
algodn y calentar hasta disolver
totalmente, procurando agitar
repetidamente. Calentar hasta
ebullicin (por aprox. 2 min).
Esterilizar a 121 C durante 15 min.
Nota: Realizar por separado 500 ml y
500 ml en matraces erlenmeyer de 1 L
para evitar el derrame del medio de
cultivo en la autoclave.
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Agar y caldo lactosado
Agar
Disolver 13 g de caldo lactosado
Caldo
Disolver 37.5g de piloncillo, 1.25 g
de extracto de malta, 1.5 g de
extracto de levadura, 3.75 g de
K2HPO4, 2.5 mg de MnCl2 2.5 mg
de NaCl y 12.5 g de CaCl2 en 250
ml de agua destilada a pH 7,0.
El medio antes de ser esterilizado
se debe centrifugar por 15 min a
2500 rpm para eliminar ciertos
residuos slidos que contena el
piloncillo.
Tapar el matraz con tapn de
algodn y calentar hasta disolver
totalmente, procurando agitar
repetidamente. Calentar hasta
ebullicin (por aprox. 2 min).
Esterilizar a 121 C durante 15 min.
Nota: Realizar en un matraz
erlenmeyer de 500 ml para evitar el
derrame del medio de cultivo en la
autoclave.
Caldo
Disolver 3.25 g de caldo lactosado
 en 1L de agua destilada a pH 7. en 250 ml de agua destilada a pH
Agregar 20 ml de agar-agar. 7,0.
Tapar el matraz con tapn de Tapar el matraz con tapn de
algodn y calentar hasta disolver algodn y calentar hasta disolver
totalmente, procurando agitar totalmente, procurando agitar
repetidamente. Calentar hasta repetidamente. Calentar hasta
ebullicin (por aprox. 2 min). ebullicin (por aprox. 2 min).
Esterilizar a 121 C durante 15 min. Esterilizar a 121 C durante 15 min.

Nota: Realizar por separado 500 ml y Nota: Realizar en un matraz

500 ml en matraces erlenmeyer de 1 L erlenmeyer de 500 ml para evitar el
para evitar el derrame del medio de derrame del medio de cultivo en la
cultivo en la autoclave. autoclave.
Agar y caldo jarabe de maz

Agar Caldo
Preparar 200 ml de agar-agar y Disolver 200 ml de jarabe de maz
agregarle 800 ml de jarabe de maz y 50 ml de agua destilada a pH 7,0.
Tapar el matraz con tapn de
a pH 7,0.
Tapar el matraz con tapn de algodn y calentar hasta disolver
algodn y calentar hasta disolver totalmente, procurando agitar
totalmente, procurando agitar repetidamente. Calentar hasta
repetidamente. Calentar hasta ebullicin (por aprox. 2 min).
Esterilizar a 121 C durante 15 min.
ebullicin (por aprox. 2 min).
Esterilizar a 121 C durante 15 min.

Nota: P g i n a 4 | 10 Nota: Realizar en un matraz

Realizar por erlenmeyer de 500 ml para evitar el
separado 500 ml y 500 ml en matraces derrame del medio de cultivo en la
erlenmeyer de 1 L para evitar el derrame autoclave
del medio de cultivo en la autoclave.
Agar MRS

En un matraz de 200 mL, aadir 6.4 g de base para agar MRS. Disolver en 100 ml de
agua. Tapar el matraz con tapn de algodn y calentar hasta disolver totalmente,
procurando agitar repetidamente. Calentar y ebullir 1 minuto Colocar en Autoclave a
121C durante por 15 minutos a 15 lb de presin.

Agar Gelosa Sangre.

En un matraz Erlenmeyer de 200 mL, disolver 4 g de base para agar gelosa sangre en
100 mL de agua destilada. Tapar el matraz con tapn de algodn y calentar hasta disolver
totalmente, procurando agitar repetidamente. Calentar y ebullir 1 minuto Colocar en
Autoclave a 121C durante 15 minutos. Para la preparacin de agar gelosa sangre, enfri
la base a 45-50C y agregu 5% de sangre (5 mL aproximadamente).

Agar MacConkey.

En un matraz Erlenmeyer de 200 mL, aadir 5.4 g de base para agar MacConkey y 100
mL de agua destilada. Tapar el matraz con tapn de algodn y calentar hasta disolver
totalmente, procurando agitar repetidamente. Calentar y ebullir 1 minuto. Colocar en
Autoclave a 121C durante por 15 minutos a 15 lb de presin.

Tcnica de vertido en placa.

1. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin y la

adicin de medio de cultivo se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las bases de
las cajas con los datos pertinentes antes de inocular.

2.. Homogenizar el medio de cultivo y mezclar mediante movimientos de derecha a

izquierda, en el sentido de las manecillas del reloj y en sentido contrario, sobre una

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superficie lisa y horizontal. Agregar de 18 a 20 mL del medio fundido y mantenido a 45 C
Dejar solidificar.

3. Inocular 0.1 mL de la dilucin correspondiente en cada caja, mediante pipeta estril.

Para distribuir de manera homognea, extender el inculo utilizando una varilla estril (en
forma de escuadra o L) haciendo movimientos giratorios de manera perpendicular al
medio de cultivo, hasta lograr la completa incorporacin del inculo en el medio.
4. Incubar las cajas en posicin invertida durante el tiempo y a la temperatura que se
requiera, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, como se indica a
continuacin

4. Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo
de esterilidad.

5. Incubar de manera invertida las cajas con los diferentes Agares durante 24 horas a
37C.

6. Despus de la incubacin, contar las placas que se encuentren en el intervalo de 25 a

250 colonias, usando el contador de colonias y el registrador. Las placas de al menos una
de tres diluciones deben estar en el intervalo de 25 a 250.

7.Calcular la cuenta de UFC / ml de dicha dilucin y reportar, con la siguiente frmula:

1
(Cuenta)( )
UFC inculo
=
ml Factor de dilucin

Determinacin de exopolisacaridos con tincin rojo de congo:

Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y un inculo del cultivo bacteriano
con el asa de siembra estril.
Hacer el frotis, formando una pelcula homognea sobre el portaobjetos con el asa
de siembra. Dejar secar.
Fijar la preparacin, pasando a travs de la llama del mechero el portaobjetos.
Cubrir con una pelcula de colorante (Rojo de congo), dejar reposar durante 1
minuto. Lavar el exceso de colorante con agua.
Dejar secar al aire. Aadir una gota de aceite de inmersin. Observar con objetivo
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de inmersin (100 x) la coloracin rojiza de las colonias que presenten el
exopolisacrido. (Babel, et al., 2011)

Determinacin de exopolisacridos con etanol:

Centrifugar cada muestra a 3500 rpm, durante 15 minutos para eliminar la

biomasa. Al sobrenadante se le van a agregar 3 volmenes de etanol 96% v/v
 (1:3), dejar en reposo 12 horas, a 4C y centrifugar a 3500 rpm, durante 10
minutos. El sedimento es el exopolisacrido (Mata,2006).

Preparaciones para tincin de Gram

Antes de iniciar la tincin: lavar y desengrasar los portaobjetos y cubreobjetos, para ello
emplear jabn lquido y agua; enjuagar varias veces con alcohol al 95%. Ponerlos a secar
y flamearlos 2 a 3 veces.

Tincin de Gram

1. Etiquetar portaobjetos por uno de sus extremos con los nombres de los integrantes.

2. Preparar los frotes bacterianos a partir del cultivo obtenido en Agar piloncillo, agar leche
deslactosada y Agar jarabe de maz.

3. Fijar con calor haciendo movimientos ligeros oscilantes (horizontales) por en medio de
la flama azul del mechero.

4. Agregar cristal violeta en cantidad suficiente para cubrir el frote (2 a 3 gotas) y dejar
actuar 1 minuto.

5. Lavar con el mnimo de agua para eliminar el exceso de colorante.

6. Agregar lugol en cantidad suficiente para cubrir el frote (2 a 3 gotas) y dejar actuar 1
minuto.

7. Lavar con el mnimo de agua para eliminar el exceso de mordente.

8. Agregar alcohol acetona y dejar actuar 15-20 segundos.

9. Lavar con agua para eliminar el exceso de disolvente.

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10. Agregar safranina en cantidad suficiente hasta cubrir el frotis (2 o 3 gotas) y dejar
actuar 1 minuto.

11. Lavar con agua para eliminar el exceso del colorante de contraste.

12. Dejar secar la preparacin a temperatura ambiente.

13. Observar al microscopio con el objetivo de mayor aumento (100x), aadiendo de 1-2
gotas de aceite de inmersin haciendo contacto directo con el objetivo.
 14. Esquematizar las observaciones realizadas y describir las caractersticas
microscpicas de bacterias de acuerdo a la tincin de Gram.

Preparacin y elaboracin de pruebas bioqumicas

Caldo Urea: Esterilizar en autoclave el agua destilada y material de vidrio. Pesar

391.3 mg de base para caldo urea y disolverlos en 10 mL de agua. Pipetear 3 mL
de caldo en cada tubo de 13x100.
Agar hierro de Kligler: En un matraz de 100 mL, aadir 1.95 g de base para agar
hierro de Kligler. Disolver en 50 ml de agua. Calentar con agitacin hasta
ebullicin. Distribuir 15 mL en cada tubo de 18x100 y esterilizar. Para dejar enfriar
y solidificar, colocarlos en posicin inclinada para lograr el pico de flauta.
Agar Sulfuro Indol Movilidad (SIM): En un matraz de 20 mL, aadir 300 mg de
base para agar SIM. Disolver en 10 mL de agua. Calentar con agitacin frecuente
hasta ebullicin. Esterilizar y distribuir en tubos de 13x100. Pipetear 3 mL en cada
tubo

5. Colocar en Autoclave a 121C durante por 15 minutos a 15 lb de presin.

6. Antes de abrir la autoclave, asegurarse que baje la temperatura y que la presin interior
sea igual a la del exterior.

9. Dejar solidificar.

Prueba catalasa

Procedimiento: con una aguja de inoculacin o con un palillo de madera, transferir parte
del centro de una colonia a la superficie de un portaobjetos de vidrio. Agregar una gota de
perxido de hidrogeno al 3% y observar la formacin de burbujas.
Interpretacin: La aparicin rpida y sostenida de burbujas o de efervescencias constituye
una reaccin positiva. Como algunas bacterias tienen enzimas distintas a la catalasa que
pueden descomponer el perxido de hidrgeno, la formacin de unas pocas burbujas
pequeas despus de 20 a 30 segundos no se considera un resultado positivo.
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Determinacin del exopolisacrido dextrano.

Determinacin de dextrano por el mtodo gravimtrico:

 Consiste, primero, en la separacin del polmero del medio de cultivo por
centrifugacin a 15.000 rpm x 5 minutos; el sobrenadante se precipita con una relacin
1:1 de etanol (96%) y se decanta, observar a las 12 y despus a las 24 horas. Se
centrifuga la solucin (15.000 x 5 min) y se obtiene el pellet. (Rodrguez, et al., 2007)

Caracterizacin del polmero:

El polmero se somete a un proceso de hidrlisis cida con cido clorhdrico (2 N) a

80C. Para efectuar la hidrlisis se toman 0,5 mL de muestra a partir de una solucin
al 1% del polmero y se agreg cido clorhdrico. (Rodrguez, et al., 2007)

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