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Universidad Nacional Autnoma de

Mxico

FACULTAD DE CIENCIAS

Biologa Molecular De la Clula I

PRCTICA 5
ELECTROFORESIS

Grupo: 5314

Integrantes:
Colin Hidalgo Eduardo Eleuterio.
Domnguez Mora Martha Paloma.
Gutirrez Garca Mariana.
Quintero Vallejo Daniel.
Ruiz Molina Gabriel Dario.

Profesor: Vega Garcia Vanessa.

Fecha en que se realiz la prctica: de Abril del 2017

Fecha de entrega: de Abril del 2017
Resumen.

Se realiz una electroforesis de protenas en un gel de poliacrilamida con distintas soluciones de

leche: leche diluida al 1:4; sobrenadante (de la purificacin de la casena); y casena, con el fin de
determinar los pesos de diferentes protenas, basndose en el marcador de peso y en la distancia que
migr. Se utiliz la regresin lineal del marcador de peso molecular para interpolar los datos de las
protenas problema y obtener sus pesos moleculares. Ya con esos pesos moleculares y obteniendo los
residuos de aminocidos, en la discusin se analiza de qu protenas se puede tratar, comparando esos
datos con los presentados en la literatura. Se obtuvieron varias protenas de cada muestra problema,
destacando por sus purificidad: la casena. con un nmero pequeo de bandas en comparacin con las
otras.

Antecedentes

Los mtodos de separacin se basan en diferentes caractersticas de las protenas tales como
solubilidad, tamao o carga, entre otras. Una de las tcnicas ms utilizadas por su facilidad y
efectividad es la electroforesis.

La electroforesis es la migracin de solutos inicos bajo la influencia de un campo elctrico; Estas

partculas migran hacia el ctodo o nodo (electrodos - y +), en dependencia de una combinacin de
su carga, peso molecular y estructura tridimensional. Es de destacar que a escala analtica, los
mtodos electroforticos son de alta sensibilidad, poder de resolucin y versatilidad, y sirven como
mtodo de separacin de mezclas complejas de cidos nucleicos, protenas y otras biomolculas,
donde aportan un potente criterio de pureza.

La velocidad de migracin (v) de la partcula es directamente proporcional al producto de su carga

efectiva (q) y el gradiente de potencial elctrico (E) e inversamente proporcional al coeficiente de
friccin (f) relativo a la talla y forma de la molcula, o sea, a la resistencia que le ofrece el medio.

V=qE/f

La velocidad de migracin electrofortica depende de la densidad de carga de la molcula (relacin

carga / peso), del voltaje aplicado y de la porosidad del gel de electroforesis. El voltaje no se puede
incrementar indiscriminadamente porque se genera un excesivo calor. En contraste, al aplicar bajo
voltaje puede ocurrir una pobre separacin, por causa de la difusin por tiempo muy prolongado de la
corrida electrofortica (Chvez,1990).

La mayora de las macromolculas (protenas, cidos nucleicos y polisacridos) poseen determinada

carga elctrica con grupos aninicos y catinicos capaces de disociarse. La carga neta de la partcula
est dada por el pH del medio y puede ser modificada por la interaccin con pequeas molculas de
iones u otras macromolculas. De lo anterior se deduce que el pH influye sobre la velocidad de
migracin de las molculas. En el punto isoelctrico de la biomolcula, pH al cual su carga neta es 0,
esta no migra. Por debajo del punto isoelctrico tiene carga neta positiva y migra hacia el ctodo, y
por encima del punto isoelctrico tienen carga neta negativa y migra hacia el nodo (Nochumson,
1985).

Existen muchos tipos de electroforesis, los mtodos electroforticos zonales son tiles para lograr la
separacin de componentes de mezclas complejas. Se aplican pequeas cantidades de la disolucin de
protenas a un soporte slido, que se impregna con una solucin de tampn. Los soportes son en
general polmeros y forman un gel poroso que restringe el movimiento de las molculas a travs del
medio durante la electroforesis y disminuyen los flujos de conveccin del solvente (Campell, 1995).
 La electroforesis de protenas en geles con una matriz de poliacrilamida es sin duda alguna una de las
tcnicas ms ampliamente usada para caracterizar mezclas complejas de protenas. La electroforesis
en poliacrilamida es un mtodo conveniente, rpido y econmico a nivel de muestra pues se requieren
slo cantidades del orden de microgramos de protena. Son qumicamente inertes, transparentes y
estables en un amplio rango de pHs, temperatura y fuerza inica y se caracteriza por su capacidad de
separar molculas de tamao considerable tales como DNA, RNA y protenas.

Algunas caractersticas destacables de la electroforesis en geles de poliacrilamida son :

a) Los geles de poliacrilamida se forman por la polimerizacin de la acrilamida por accin de un

agente entrecruzador, la bis-acrilamida en presencia de un iniciador y un catalizador. Como iniciador
se suele utilizar TEMED (N,N,N,N'-tetrametilnediamina) y como catalizador el in persulfato (S2O8 -
) que se aade en forma de persulfato amnico.

b) Las soluciones de acrilamida se desgasifican pues el oxgeno es un inhibidor de la polimerizacin.

Adems, durante la polimerizacin se libera calor que podra provocar la formacin de burbujas en el
seno del gel.

c) La velocidad de polimerizacin viene determinada por la concentracin de persulfato (catalizador)

y TEMED (iniciador).

d) La porosidad del gel la determina las proporciones relativas de poliacrilamida y bis-acrilamida,

siendo menor el poro cuanta ms bisacrilamida vs. acrilamida se use.

e) El porcentaje total de acrilamida/bisacrilamida determina el rango de separacin del gel.

Habitualmente los geles se denominan en funcin del % de acrilamida/bisacrilamida que contienen.
As, la mayora de las protenas se separan bien en el rango de 5 a 10%. Un menor porcentaje (mayor
tamao de poro) es mejor para separar protenas de gran tamao.

En funcin del estado de las protenas (nativo o desnaturalizado) a lo largo del proceso electrofortico
stas se clasifican en electroforesis nativas o desnaturalizantes.

Una electroforesis desnaturalizante, es la que somete a las protenas a migracin asegurando la

completa desnaturalizacin (prdida de la estructura tridimensional). En esta situacin la migracin es
proporcional a la carga y al tamao de la molcula pero no a su forma. El agente desnaturalizante ms
empleado es el sodiododecilsulfato o SDS, un detergente.

Las ventajas de usar geles de poliacrilamida son:

1. alta resolucin (1x10^6 Da)

2. Acepta molculas relativamente grandes
3. Hay una interaccin mnima de la molcula que migra con la matriz del gel
4. el gel tiene una estabilidad fsica

La desventaja es que el monmero de acrilamida es neurotxico, debe manejarse con mucha

precaucin y nunca desecharla sin polimerizar.

El fundamento de esta electroforesis radica en su capacidad desnaturalizante utilizando geles

discontinuos (separador y concentrador), los cuales confieren una carga negativa y un agente reductor
a la muestra en estudio, de manera que, gracias al uso de un detergente (SDS) se rompen enlaces
disulfuro ocasionando que las protenas aisladas pierdan su estructura funcional, dejando una cadena
linear de polipptidos. Dado que la carga intrnseca se anula, stas van a ser separadas en el gel
 poroso con base en sus diferencias de peso molecular (PM): a menor tamao, mayor movilidad de la
protena, y viceversa.

Sin embargo, dependiendo del tipo de casena que se trate, tendr caractersticas distintivas basadas en
su distribucin de carga, por ejemplo:

1. alfa(s1)-casena: tiene un peso molecular 23,000 Da; 199 residuos, de los cuales 17 son de prolina.

2. alfa(s2)-casena: peso molecular de 25,000 Da; 207 residuos, de los cuales 10 son prolinas.

3. -casena: peso molecular de 24,000 Da ; 209 residuos conteniendo 35 prolinas.

4. kappa-caseina: peso molecular de 19,000 Da; 169 residuos, 20 prolinas (4)

Otro pesos de protenas del suero de leche seran las siguientes:

1. -lactoalbmina, Tiene un peso molecular de 14,186 Da en la forma de protena madura, y de 15,840

a 16,690 Da con la estructura glucosilada
2. -lactoglobulina tiene un peso molecular de 18 kDa y pertenece a la superfamilia lipocalina
3. Lactoferrina tiene un peso molecular de aproximadamente 67 kDa.

Usando el peso molecular estimado se puede predecir el nmero de residuos de aminocidos de las
protenas, tomando como referencia el peso promedio de un aminocido, que es de 110 Da.

La unidad de masa atmica unificada o dalton (DA) es una unidad de masa y se define
como la doceava parte de la masa de un tomo, neutro y no enlazado, de carbono-12, en
su estado fundamental elctrico y nuclear, y equivale a 1,660 538 921 10 27 kg. (IUPAC,
1997)

Las protenas separadas por SDS-PAGE pueden ser visualizadas en el gel mediante diversos mtodos
de tincin: fluorescencia, plata y azul coomassie, siendo este ltimo el ms utilizado. Este mtodo de
tincin presenta una sensibilidad de hasta 50 ng de protena.

El peso molecular (PM) de las protenas puede determinarse en electroforesis al comparar las
movilidades electroforticas de varios marcadores de peso molecular conocido. Para ello se compara
el Rf de la protena problema con el de protenas de referencia cuyo peso molecular se conoce.
Recordemos que el Rf es el parmetro experimental asociado a esta tcnica, y se define como:
Distancia que migra una determinada protena

Rf= distancia de la banda (muestra) / Distancia de migracin (frente)

Al realizar un ploteo del log PM de la protena patrn como funcin del valor de Rf, se obtiene un
grfico ligeramente sigmoideo. El peso molecular desconocido puede estimarse por el anlisis de
regresin lineal o por interpolacin en la curva del log de PM contra Rf. (Garfin, 1990)

La determinacin del PM de protenas mediante SDS-PAGE (dodecil sulfato de sodio en gel de

poliacrilamida) es vlida cuando se analizan cadenas proteicas individuales (subunidades), en donde
se han reducido todos los enlaces disulfuro y por ende, se ha distendido toda la cadena proteica para
su interaccin con el SDS. Bajo estas condiciones, la migracin de las molculas obedece
fundamentalmente a su PM. (5)
 Objetivos:

Distinguir la electroforesis como un mtodo para el estudio del tamao y de la conformacin de

macromolculas.
Analizar las muestras del aislamiento de casena mediante el mtodo de electroforesis.
Aprender acerca de la migracin de una partcula sobre un campo elctrico.
Obtener el peso molecular aproximado de la casena aislada de la leche.

Hipotesis:

- Si los residuos resultantes son alrededor de 704 (suma de todos los residuos de diferentes casenas que
posiblemente fueron aisladas) y el peso molecular ronda los 90 kDa(peso terico de la casena),
entonces se habr asilado casena.
- Si el grosor y coloracin del gel es intensa, entonces se tiene una gran concentracin de protenas.
- La regresin linear del marcador de un peso molecular permitir obtener los valores de peso
molecular de las muestras problema.

Material y reactivos.

Material Reactivos

Micropipetas de 200 y 1000L Gel separador:

Puntas para micropipeta Acrilamida 3 960 L

2 vasos de precipitados de 50 mL Amortiguador separador 2 500 L

Charolas para tincin Agua 3 540 L

3 pipetas serolgicas de 10 mL PSA 75 L

2 vasos de precipitados de 1000 mL TEMED 7.5 L

1 anillo metlico Gel concentrador:

Microtubos Acrilamida 780 L

2 pipetas serolgicas de 5 mL Amortiguador concentrador 1 250 L

1 probeta de 1L Agua 2 970 L

1 probeta de 100 mL PSA 37.5 L

1 probeta de 250 mL250 TEMED 7.5 L

1 mechero y tela de asbesto Equipo:

1 soporte universal 1 cmara de electroforesis vertical

1 fuente de poder

Procedimiento.

Una vez armada la cmara de electroforesis Para preparar el gel separador se agreg cada una de las
sustancias en orden, al final el TEMED. Posteriormente se mezclaron evitando formar burbujas.
Se aplic la solucin entre las dos placas de vidrio de la cmara de electroforesis hasta una altura de
4.5 cm. Se dej polimerizar alrededor de 30 min y se limpi la superficie del gel para poner
posteriormente el gel concentrador.

Para la preparacin del gel concentrador se agregaron cada una de las soluciones en orden, cuidando
que el TEMED quedara al final . Se agit la disolucin de nuevo cuidando que no se formaran
burbujas. Se aplic al espacio restante de las placas de vidrio y finalmente se insert el peine de la
cmara. Se dej polimerizar 30 min.

Para la preparacin del amortiguador de corrida TGS 1x se calcularon los mL necesarios de TGS 10x
para preparar 1L de TGS 1x. Una vez preparado se llen la cmara a ras de la orilla.

Por otro lado, se descongel el amortiguador de muestra 4x verificando que no hubiera SDS
precipitado antes de agregarlo a los microtubos.

Se prepararon las muestras de la siguiente forma:

Nmero de tubo Muestras obtenidas de Volumen de muestra Volumen de

la prctica 3 amortiguador de
muestra 4x

1 Leche diluida 1:4 15 L 5 L

2 Sobrenadante diluido 15 L 5 L
1:1

3 Casena purificada (0.6 15 L 5 L

mg/mL)

Se pusieron las muestras a hervir en bao Mara con agua ya hirviendo, durante 1 minuto.

Finalmente se cargaron las muestras en cada uno de los pozos del gel. Se conectaron las cables a la
fuente de poder aplicando 170 V. Se corri aproximadamente 45 minutos.

Tincin del gel:

Una vez que los geles terminaron de correr de descart el amortiguador de la cmara superior y se
liber el porta placas. Con mucho cuidado se retiraron los separadores de las placas para liberar el gel
y con uno de los separadores se hizo un corte pequeo en el extremo superior izquierdo para
identificar la orientacin del gel.

Se lav el gel con agua para eliminar SDS antes de la tincin. se transfiri a una charola con
disolucin fijadora. Se calent en el horno de microondas 1 minuto y se elimin el lquido.

Se cubri al gel con disolucin para teir/desteir y agit por tres minutos y se fue cambiando la
disolucin hasta obtener un buen contraste.

Finalmente se desech la disolucin para teir/desteir y se cubri al gel con agua.

Para medir las bandas, se coloc al gel sobre una lmpara de luz y con una regla se hizo la medicin
inicial.

Resultados.

A continuacin, se muestran diferentes tablas que contienen datos que ayudarn a calcular el peso de
las protenas problema (casena, protenas en el sobrenadante y la leche diluida). As mismo, se
calcularon los residuos de aminocidos de cada una de las bandas marcadas en la electroforesis. El Rf
es un factor importante en estos resultados, pues es un valor til para poder calcular el peso de las
protenas ya mencionadas. Todo esto se realiz para poder identificar de la mejor manera posible
dichas bandas, y comprobar la eficiencia de la purificacin y otras tcnicas utilizadas en prcticas
anteriores. La distancia recorrida por el frente fue de 5 cm, valor que ayudar a calcular el Rf de cada
banda.

En la tabla 1, se utilizaron los pesos moleculares del marcador y se calcul el Rf de estos, con ayuda
de la distancia recorrida de las bandas y del frente. As mismo se calcul el logaritmo del peso
molecular del marcador. Esto, para poder graficar dichos valores y que la grfica no quede desfasada
debido a la gran diferencia de El Rf, siendo este con valores muy pequeos a comparacin del peso
molecular en Da.

En la grfica 1, se utilizaron los valores de Rf en el eje independiente, mientras que los valores de
Peso molecular se utilizaron en el eje dependiente. Con ayuda de esta grfica y clculos realizados en
Excel, se logr obtener una regresin lineal, y as poder obtener los valores de peso molecular de las
muestras problema, pues de estas si se poda calcular el Rf sin necesidad de una regresin lineal. Sin
embargo, los valores de peso molecular se encuentran en logaritmo, as que se necesito hacer una
conversin con antilogaritmo. En la tabla 2 se muestran dichos valores.

La tabla 3 muestra los residuos de aminocidos de cada una de las bandas, utilizando la informacin
de que, en promedio, el peso de un aminocido es de 110 Da.

Protena. Marcador de peso Logaritmo del Distancia Rf de marcador

Marcador de peso molecular. marcador de peso recorrida por las de peso
molecular. (Da) molecular. bandas (cm) molecular.

1 250,000. 5.3979400087 0.2 0.04

2 130,000. 5.1139433523 0.6 0.12

3 100,000. 5 0.9 0.18

4 70, 000 4.84509804 1.3 0.26

5 55, 000 4.7403626895 2 0.4

6 35, 000 4.544068044 3.1 0.62

7 25, 000 4.397940009 4 0.8

Tabla 1: Muestran los pesos moleculares (en Da) de los marcadores, as como su Rf.
Grfica 1: Muestra en el eje independiente el Rf calculado en la tabla 1, y en el eje dependiente el
logaritmo del marcador de peso molecular calculado tambin, en la tabla 1.

Muestras. Distancia Rf. Logaritmo de Peso Molecular

recorrida por las peso molecular (Da).
bandas (cm). (Da).

Banda 1 de Leche 0.4 0.08 5.175988 149964.3398

diluida 1:4

Banda 2 de Leche 1.3 0.26 4.963786 91999.6129

diluida 1:4.

Banda 3 de Leche 1.5 0.3 4.91663 82533.45009

diluida 1:4.

Banda 4 de Leche 2 0.4 4.79874 62912.94278

diluida 1:4.

Banda 5 de Leche 3.5 0.7 4.44507 27865.70274

diluida 1:4.

Banda 1 de 1.3 0.26 4.963786 91999.6129

Sobrenadante.

Banda 2 de 1.5 0.3 4.91663 82533.45009

Sobrenadante.

Banda 3 de 1.8 0.36 4.845896 70128.73418

Sobrenadante.

Banda 4 de 3.8 0.76 4.374336 23677.50844

Sobrenadante.

Banda 1 de 1.5 0.3 4.91663 82533.45009

Casena.

Banda 2 de 1.9 0.38 4.822318 66422.92557

Casena.

Banda 3 de 3.7 0.74 4.397914 24998.50287

Casena.
Tabla 2: Muestra informacin acerca de las bandas de las protenas problema (peso molecular, Rf,
etc.)

Muestras. Nmero de residuos de aminocidos.

Banda 1 de Leche diluida 1:4 1363.

Banda 2 de Leche diluida 1:4. 836.

Banda 3 de Leche diluida 1:4. 750.

Banda 4 de Leche diluida 1:4. 571.

Banda 5 de Leche diluida 1:4. 253.

Banda 1 de Sobrenadante. 836.

Banda 2 de Sobrenadante. 604.

Banda 3 de Sobrenadante. 638.

Banda 4 de Sobrenadante. 215.

Banda 1 de Casena. 750.

Banda 2 de Casena. 604.

Banda 3 de Casena. 227.

Tabla 3: Muestra el nmero de residuos de aminocidos de cada banda de las protenas problema.
Figura 1.- Banda de la leche. Figura 2.- Banda del sobrenadante.

Figura 3.- Banda de la casena. Figura 4.- Banda del marcador de peso molecular.

Discusin.

Los resultados en la electroforesis, de alguna manera, fueron los esperados, pues, al momento de
contar las bandas en dicho mtodo, se observ que la protena que menos bandas tena era la casena,
pues esto se debe a que es una protena que se purific anteriormente, y como consecuencia, esta
debera tener menor nmero de bandas que las otras protenas. Lo mismo pasa con las otras dos, pues,
la leche diluida es la que tiene un nmero mayor de bandas, siendo as, la sustancia con ms protenas
(pues incluye la casena y otras ms que componen a la leche).

Algo que es muy importante destacar, es la cantidad de residuos de aminocidos identificados en la

electroforesis. En los antecedentes se muestran los diferentes pesos moleculares de las diferentes
casenas, siendo as que la alfa(s1)-casena tiene un peso molecular 23,000 Da y 199 residuos, de los
cuales 17 son de prolina. La alfa(s2)-casena, con un peso molecular de 25,000 Da y 207 residuos, de
los cuales 10 son prolinas. La -casena con un peso molecular de 24,000 Da y 209 residuos
conteniendo 35 prolinas. La kappa-casena con un peso molecular de 19,000 Da y 169 residuos, de los
cuales 20 son prolinas. Al calcular la suma de estos residuos de aminocidos nos da un resultado de
704 aminocidos y el peso molecular es alrededor de 90 kDa, por lo tanto estos son los aminocidos y
kDa totales de la casena entera. Si observamos la tabla 3 podemos ver que la Banda 1 de casena
contiene 750 residuos de aminocidos, lo cual es un valor cercano a los aminocidos totales de la
casena, y, si observamos la tabla 2, vemos que la banda ya mencionada, pesa 82533 Da, que
equivalen a 82.533 KDa. Es as, que podemos decir que la Banda 1 de casena, realmente es toda la
casena que se purific, pues esta tiene valores de KDa y residuos de aminocidos cercanos a los datos
de la literatura. Podemos decir que la banda 2 y 3 de casena, son otras protenas que no se lograron
aislar de la casena a la hora de la purificacin.

La Lactoferrina, que es otra protena situada en la leche, tiene un peso molecular de aproximadamente
67 kDa, la cual podra corresponder a la banda 3 del sobrenadante, pues al observar la tabla 2 tenemos
que esta pesa 70128 Da aproximdamente, es decir 70.128 KDa.

Conclusin.

La electroforesis en gel de poliacrilamida es una tcnica sencilla, rpida y reproducible para la

separacin e identificacin de protenas. El anlisis de protenas con esta tcnica nos arroja
informacin tal como la cantidad y composicin de protenas particulares presentes en un compuesto.

Se pudo observar que algunas protenas poseen carga elctrica negativa y encontramos que debido a
sus propiedades electromagnticas estas se dirigen hacia el nodo (con carga elctrica positiva)
ubicndose en la parte inferior del punto en el que se sembr la muestra. Fue as que se desplazaron
desde el punto inicial debido a que son los componentes ms electronegativos presentes en las
protenas, adems de ser las partculas proteicas de menor tamao. Otro aspecto observado fue la
intensidad de color presentada en la banda de las los compuestos los cuales nos indican que hay una
mayor concentracin de protenas.

Si bien esta prctica arroja datos evidentes sobre la cantidad de protenas presentes en la muestra, es
necesario el anlisis e investigacin de los componentes de esta pues al ser trabajadas con anterioridad
se podran predecir, relacionar y verificar los resultados obtenidos en la prctica Aunque en este
experimento se utiliza SDS es decir, se implica que las diferentes cadenas proteicas quedan con una
relacin masa y carga similar, se debe tener en cuenta que estas an influyen en su desplazamiento.
Otro aspecto que influye en este caso es la masa a causa de que se encuentra directamente relacionada
al tamao. Tambin el desplazamiento por carga puede variar debido al pH manejado o a la carga
elctrica aplicada y el desplazamiento por masa que se puede ver alterado por la porosidad del medio
en que se lleve a cabo, en este caso, el gel de poliacrilamida.

As mismo, se logr identificar algunas bandas de la electroforesis de acuerdo a su peso calculado en

Daltones, as como con la ayuda del clculo de residuos de aminocidos, confirmando que la hiptesis
planteada anteriormente fue correcta ya que en los resultados observamos valores muy cercanos en
kDa al peso terico de la casena al igual que el nmero de residuos de aminocidos de esta.
Bibliografia

1. Chvez Planes MA, Daz Brito J, Prez U, Delfn J. Temas de enzimologa. Tomo 2 Facultad de
Biologa Universidad de La Habana, 1990.

2.Nochumson S, inventors; FMC Corporation, assignee. Polyacrylamide cross-linked with a

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3. Campell MK. Biochemistry. 2 ed. Saunders: College Publishing.1995.

4. <https://www.uoguelph.ca/foodscience/book-page/caseins>

5. <http://www.ciens.ucv.ve:8080/generador/sites/lab-bioq-gen/archivos/Lomonte%20- >

6. IUPAC Compendium of Chemical Terminology 2nd Edition (1997)

7.Garfin DE. One dimensional gel electrophoresis. Methods in enzymology. vol 182. Academic
Press.1990