Anda di halaman 1dari 9

Enzimatik Chemoselective Sintesis Sekunder-Amide

Surfaktan dari N-Methylethanol Amine


Jitender Sharma, 1 Daniela Batovska, 1 Yuko Kuwamori, 1 dan
Yasuhisa Asano1 *
Pusat Penelitian Bioteknologi, Toyama Prefektur University,
5180 Kurokawa, Imizu, Toyama 939-0398, Jepang1
Revisi 6 Mei 2005 / Diterima 8 September 2005
Sintesis selektif Efisien surfaktan amida sekunder N-metil
lauroylethanolamide
dari metil laurat dan N-methylethanol amina oleh operator-tetap
Chirazyme L-2 (Candida antarctica)
menggunakan strategi kinetik telah dibuktikan. Ketika pelarut yang
berbeda disaring untuk
hasil produk menggunakan Chirazyme L-2, asetonitril ditemukan optimal.
Laju reaksi
meningkat tajam dengan meningkatkan rasio molar reaktan dan suhu
reaksi.
Ketika reaksi dilakukan pada 50 C selama 36 jam dengan 50mmol ester
dan 100mmol amina, yang
produk diperoleh dengan hasil 97,1%. Dengan 50mmol ester dan 150mmol
amina, hasil tertinggi
(97,3%) diperoleh setelah 16 jam inkubasi pada 50 C. Butuh waktu hanya
5 jam untuk mendapatkan hasil 95,8% di
60 C menggunakan 50mmol ester dan 200mmol amina. Aktivitas enzim
dalam reaksi amidasi
campuran tidak menurun terutama bahkan setelah enam kegunaan.
[Kata kunci: Chirazyme L-2, N-metil lauroylethanolamide, surfaktan
amida sekunder, metil laurat,
N-methylethanol amina]

Fatty amida asam yang cukup menarik dan ekonomi


Oleh karena itu penting dan telah menjadi objek dari
banyak penelitian dan perhatian industri. Mereka sekarang diproduksi
dalam skala besar karena mereka berguna sebagai pelumas serat,
deterjen, agen flotasi, pelembut tekstil, agen antistatik,
aditif lilin, dan plasticizer. Amida dari asam laurat
secara luas diterapkan dalam shampoo, lotion mandi, dermal
bahan pembersih dan krim kulit (1). Amida asam lemak yang
semicommodities yang dihasilkan dari asam lemak dengan
Reaksi dengan amonia anhidrat pada sekitar 200 C
dan 345-690 kPa (2). Karena sensitivitas panas mereka,
pembuatan amida ini memerlukan distilasi tambahan
langkah-langkah dalam rangka untuk memenuhi spesifikasi kemurnian.
Oleh karena itu, rendah
sintesis suhu yang menghindari kebutuhan tambahan
pemurnian berpotensi menarik.
Sejauh ini, pendekatan kimia hanya telah dimanfaatkan untuk
produksi massal mereka. Pada saat yang sama, beberapa lipase memiliki
berhasil digunakan untuk sintesis amida primer
asam oleat dan palmitat (2; Mori, N., Uemura, S., dan
Iwasaki, R., Jepang terbuka paten 153.985, 22 Juni 1993).
Lipase katalis ammoniolysis dari ester asam amino, karboksilat
asam dan trigliserida telah digambarkan sebagai menarik
metode untuk mendapatkan amida yang sesuai (3-5). itu
pembentukan N-lauroil--alanin etil ester dan 3- (N-lauroylamino) -
propionitril menggunakan amobil lipase (6), dan sintesis
dari propionitril N-lauroil--amino menggunakan packedbed packedbed
reaktor telah dilaporkan (7). Sintesis enzimatik
hydroxyamides dari N-methylglucamine (8, 9) dan etanolamin
juga telah dilaporkan (10). Sintesis enzimatik
amida sekunder telah berhasil dengan beberapa pengecualian
(6), berbeda dengan yang untuk amida primer (11).
Di sini, kita menggambarkan hasil kami dari studi enzim-dikatalisasi
sintesis chemoselective amida sekunder. Kami menggunakan
Chirazyme L-2 untuk mengkatalisis reaksi selektif metil
laurat dengan N-metil etanolamin, yang berisi satu hidroksil
dan satu gugus amina (Gbr. 1).
BAHAN DAN METODE
Reagen Methyl laurat dan N-methylethanol amina yang
hadiah dari Kawaken Kimia, Fukui. Semua bahan kimia lain yang
dari sumber komersial dan digunakan tanpa pemurnian lebih lanjut.
Enzim Lipase dari Pseudomonas cepacia (PS), Pseudomonas
fluorescens (AK), Candida rugosa (AY), Aspergillus
niger (A), Rhizopus sp. (F-AP15), Mucor javanicus (M), Geotricum
candidum (GC-20), Rhizopus sp. (D), Penicillium roqueforti
(R), Aspergillus sp. (PZ-6), Humicola langinosa (CE), Penicillium
aurantiogriseum (G), Geotricum candidum (GC-20), Rhizopus
niveus (Neolase F), pancrease babi (Pancreatin F), protease
dari Bacillus subtilis (N), dan esterase (AC 409) adalah hadiah dari
Amano Farmasi (Nagoya). Lipase dari Rhizomucor miehei
(Lipozyme), Aspergillus niger, Candida lipolytica, Mucor javanicus
dan Rhizopus arrhizus dibeli dari Fluka Chemie AG
(Buchs, Swiss); lipase dari Candida rugosa, babi hati (PLE),
gandum, dan Tipe II lipase dan Pancreatin dibeli
dari Sigma Chemical Company (St. Louis, MO, USA); lipase
dari Pseudomanas aeruginosa (Lipoprotein lipase) dan Pseudomonas
sp. (Toyozyme LIP) yang dibeli dari Toyo Jozo
(Shizuoka); lipase dari Rhizopus niveus dibeli dari Kanto Chemicals
(Tokyo); lipase dari Rhizopus delemer dibeli
dari Seikagaku Kogyo (Tokyo) dan Chirazyme (L-2) adalah
dibeli dari Boehringer Mannheim (Mannheim, Jerman).
Aktivitas spesifik Chirazyme (L-2) adalah 10.000 propil laurat
unit (PLU) / g dan satu PLU didefinisikan sebagai jumlah enzim
yang mengkatalisis pembentukan 1 umol dari ester dari propil alkohol
dan asam laurat per menit.
Skrining enzim untuk sintesis amida Pada 1,5 ml Eppendorf
tabung, metil laurat (50 mmol), N-methylethanol amina (100
mmol) dilarutkan dalam 1 ml asetonitril dan 2 mg enzim yang
ditambahkan. Campuran reaksi terguncang pada 30 C selama 20 jam
dan
pembentukan produk diperiksa oleh TLC dengan pelarut kloroform
dan metanol dalam rasio 10: 1 (v / v) sebagai fase gerak dan visualisasi
bintik-bintik dicapai dengan penyemprotan acidsulphuric fosfomolibdat
asam atau larutan ninhidrin, diikuti dengan memanaskan pelat
pada 120 C. Persen hasil molar ditentukan oleh HPLC dengan
Kolom ODS (Cosmosil 5C18, Nacalai Tesque, Kyoto, fase gerak,
CH3CN / 0.02M 1-hexanesulphonic acid sodium salt (H2O) = 60/40;
tingkat, 0,7 ml / menit mengalir; waktu retensi untuk N-metil
lauroyletanolamide,
12,9 menit), yang dipantau oleh detektor indeks bias
(Shodex RI-101, Showa Denko, Kanagawa). Inframerah (IR)
spektrum sampel dalam pelet KBr dicatat dari 400 sampai
4600 cm-1 menggunakan spektrofotometer Shimadzu FTIR-8100. 1H dan
13C NMR spektrum direkam pada spektrofotometer JEOL LA-400
(JEOL, Tokyo) untuk solusi di CD3OD dengan tetrametilsilan
sebagai standar internal dan nilai-nilai J diberikan dalam hertz (Hz).
IR spektrum dari N-metil lauryoleathanolamide: (OH) = 3400
cm 1, CH = 2800-2900 cm-1, dan (CO-N) = 1651 cm-1. 1H NMR ;
(MeOD, 400 MHz); 0.96 (vt, J = 7,2 Hz, 3H), 1,2-1,3 (br, 18H),
1.58 (BRS, 2H), 2,2 (t, J = 7,0 Hz, 2H), 2.3 (t, J = 7,0 Hz, 1H), 2.90
(s, 3H), 3,42 (m, 1H), 3.5 (m, 1H). 13C NMR (MeOD, 100MHz);
14.1, 22.6, 26.0, 28.5, 29.0, 29.4, 29.5, 29.6, 29.7, 32.0, 34.3, 35.2,
52,4, 58,7, 172,3.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Kondisi ringan, kebutuhan minimal untuk kelompok pelindung, a
kurangnya by-produk, regio tinggi dan enantioselectivity, dan
Biaya sintesis rendah membuat sintesis enzimatik amida
menguntungkan dibandingkan dengan sintesis kimia (12). Sampai saat ini,
protease seperti thermolysin dan Subtilisin sangat
digunakan untuk produksi amida skala besar (13, 14). Namun,
enzim ini diketahui khusus untuk amino tertentu
asam dan sangat sensitif terhadap inaktivasi oleh pelarut organik.
Di antara hidrolase, lipase adalah katalis yang menjanjikan
untuk sintesis peptida, polimer, surfaktan dan
deterjen baru dengan biaya rendah, karena mereka telah terbukti untuk
mengkatalisasi
pembentukan ikatan amida dalam pelarut organik (15-
20). Dua strategi untuk pembentukan ikatan amida dapat
dipertimbangkan: kontrol termodinamika dan kontrol kinetik (12).
Dalam pendekatan termodinamika, kesetimbangan bergeser
menuju sintesis bukan hidrolisis dan ini bisa
dicapai dengan mengubah kondisi reaksi. Sebagai contoh,
peningkatan konsentrasi bahan awal atau pengendapan produk akan
mendukung amidasi tersebut
reaksi, dengan penggantian molekul air
dengan pelarut organik. Dalam reaksi kinetik dikontrol,
bahan awal merupakan senyawa karboksil diaktifkan seperti
sebagai ester. Ester diaktifkan oleh enzim melalui
asil-enzim menengah, yang dapat lebih diserang oleh
amina atau sebuah molekul air. Karena kinetis dikendalikan
sintesis memerlukan zat antara asil-enzim, hanya
serin atau thiol hidrolase, seperti lipase, subtilisins dan
papain, dapat digunakan. Metalloproteases seperti thermolysin
hanya cocok dalam reaksi termodinamika dikendalikan.
Kami merancang reaksi kinetik dikontrol metil
Nobel dengan N-metil etanolamin menggunakan komersial
tersedia dan menyumbangkan enzim. Setelah skrining pelarut,
kami memilih asetonitril sebagai pelarut yang paling cocok
untuk reaksi, karena kemampuan untuk membubarkan kedua
reaktan tanpa mempengaruhi enzim. Tiga puluh dua enzim
disaring untuk produk mereka kemampuan membentuk menggunakan
TLC. Tiga lipase, yaitu, Chirazyme L-2 dari Candida
antartika, Toyozyme, dan Amano PS, yang beristirahat positif
dalam pengujian ini dan hasil panen mereka diperoleh dengan
menggunakan enzim ini
diperkirakan oleh HPLC. Hasil tertinggi 51,4% adalah
diamati dengan Chirazyme, diikuti oleh Toyozyme dan
Amano PS (Tabel 1).
Campuran reaksi dengan Chirazyme dominan memberikan
dua tempat terdeteksi oleh TLC menggunakan acidsulphuric fosfomolibdat
visualisasi asam (Rf: 0,25 dan 0,45). produk
di Rf = 0,45 dimurnikan dengan kromatografi kolom silika gel
dari reaksi ditingkatkan 100 kali lipat dibandingkan dengan
reaksi skrining menggunakan Chirazyme dan strukturnya
dikonfirmasi melalui inframerah dan spektra NMR, seperti yang
ditunjukkan dalam
Bahan dan Metode bagian. Produk terdeteksi pada Rf =
0,25 oleh TLC adalah ninhidrin positif dan menghasilkan puncak pada
waktu retensi 8,3 menit dalam analisis HPLC. rasio
dari luas puncak pada waktu retensi 8,3 dan 12,9 menit itu
kira-kira 2: 3. Meskipun kami berusaha untuk mengisolasi produk,
tidak hanya oleh silika gel kromatografi kolom, tetapi juga oleh
fisik menggores tempat dari lapisan kromatografi tipis,
produk positif ninhidrin tidak dapat diisolasi
dan kami menemukan hanya produk membusuk sedikit dan N-metil
lauryoleathanolamide pada lapisan kromatografi tipis,
seperti yang dijelaskan di bawah ini, setelah penguapan. Ketika Amano PS
adalah digunakan, tempat ninhidrin positif juga terdeteksi pada Rf =
0,25 oleh TLC. Produk utama dibentuk dengan Amano PS adalah
juga terisolasi oleh prosedur yang sama dan telah dikonfirmasi sebagai
N-metil lauryoleathanolamide oleh spektrum NMR dan IR.
Ketika pelarut yang berbeda diuji untuk produk mereka
Kemampuan menggunakan Chirazyme oleh TLC dan HPLC, asetonitril
membentuk
ditemukan menjadi pelarut terbaik dengan 51,5% yield,
diikuti oleh n-heksana dengan yield 18,4% (Tabel 2).
Produk utama dalam n-heksana diisolasi oleh serupa
Prosedur seperti dijelaskan di atas, dan sama dikonfirmasi
N-metil lauryoleathanolamide oleh spektrum NMR dan IR.
Tempat N-metil lauryoleathanolamide bersama-sama dengan
jejak tempat positif ninhidrin juga terdeteksi ketika
reaksi terjadi dalam n-heksana dan dikatalisasi oleh
Chirazyme. Produk yang terbentuk dalam toluena, diisopropileter,
metilen klorida, t-butylmethylether, 1,4-dioksan
dan 4-metil-2-pentanon semua memberikan waktu retensi yang sama
(12,9 menit) seperti yang di N-metil lauryoleathanolamide, berdasarkan
HPLC. Untuk mengoptimalkan jumlah biokatalis, berbeda
jumlah Chirazyme mulai dari 2 mg sampai 10 mg, yang
digunakan untuk melakukan reaksi pada suhu 30 C selama 24 jam. hasil
panen yang
58,8% dan 58% untuk 2 mg dan 5 mg enzim dan hasil
lanjut menurun dengan kenaikan lebih lanjut dalam jumlah enzim,
yaitu, 53,2% untuk 7 mg enzim dan 50,8% untuk 10
mg. Dalam semua percobaan lebih lanjut, 2 mg enzim digunakan.
Pengaruh rasio molar reaktan, suhu dan
waktu reaksi pada N-metil sintesis lauroylethanolamide
Reaksi dilakukan pada suhu 30 C hingga 60 C selama 8 sampai 24 jam
menggunakan rasio molar yang berbeda dari metil laurat dan N-
methylethanol
amina. Hasil dari produk tersebut meningkat ketika
kelebihan amina dipekerjakan seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3.
Hasil tertinggi 97,3% diperoleh ketika tiga kali lipat
kelebihan amina (ester 50 mmol, amina 150 mmol) adalah
digunakan. Ketika reaksi dilakukan dengan kelebihan dua kali lipat
amina (ester 50 mmol, amina 100 mmol), perbaikan
yield diamati dengan tidak hanya memperpanjang
waktu inkubasi 24-60 jam (58,8% dan 77,3% hasil panen di
berjalan 1 dan 2, masing-masing), tetapi juga dengan menaikkan suhu
sampai 50 C dan inkubasi selama 36 jam (97,1% yield dalam
menjalankan 4).
Tidak ada perbaikan lebih lanjut diamati dengan meningkatkan
suhu di atas 50 C (berjalan 2-5). Reaksi lebih lanjut yang
dilakukan untuk menentukan waktu yang optimal untuk mencapai
hasil maksimum untuk setiap suhu dan rasio molar. dengan
peningkatan rasio molar (1: 2, 1: 3, dan 1: 4), lebih tinggi
hasil yang diperoleh pada 30 C dalam reaksi 24 jam (58,8%,
77,3%, dan 96,2% hasil panen di berjalan 1, 6, dan 11, masing-masing).
Namun, perbaikan yang signifikan dalam hasil yang diamati
ketika suhu reaksi yang bergeser dari
30 C hingga 50 C (77,3% sampai 97,1% hasil panen di berjalan 2-5;
95,6% menjadi
97,3% hasil panen di berjalan 7-10, masing-masing) dengan inkubasi yang
lebih pendek
kali. Menyimpulkan, dengan mempertimbangkan bahwa penggunaan
kurang amina menguntungkan, salah satu hasil yang optimal (97,1%)
diperoleh ketika reaksi dilakukan pada 50 C untuk
36 jam dengan ester untuk amina rasio 1: 2 (run 4). ketika
waktu reaksi yang lebih singkat diperlukan, reaksi dapat dilakukan
pada 50 C selama 16 jam dengan ester untuk amina rasio 1: 3
(menjalankan 9 dengan hasil 97,3%), atau pada suhu 60oC selama 5 jam
dengan ester untuk
rasio amina dari 1: 4 (run 1 dari Gambar 2 di 95,8% yield.). itu
perbedaan hasil produk pada rasio yang berbeda dari prekursor
reagen pada dasarnya diatur oleh variasi pH
campuran reaksi dan mencerminkan perubahan dalam asam-basa
sifat reagen prekursor.
Penggunaan berulang enzim Untuk penggunaan berulang dari
enzim, reaksi dilakukan dengan kelebihan empat kali lipat dari
amina (50 mmol ester, 200 mmol amina) dengan 2 mg
Chirazyme pada 60 C selama 5 jam. Enzim Chirazyme disaring
dari campuran reaksi dan digunakan untuk selanjutnya
siklus reaksi. Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 2, enzim tidak kalah
aktivitas katalitik pada suhu 60 C dan dapat digunakan enam kali
(berjalan 1-6, di 95,8%, 94.2%, 92,8%, 89,6%, 89,2%, dan
97,7% hasil, masing-masing) tanpa pengobatan antara
berjalan dan dengan sedikit hilangnya aktivitas. Dalam kehadiran
kelebihan amina, selektivitas untuk amida yang diinginkan meningkat
nyata selama sintesis enzimatik amida surfaktan dari dietanolamida (10).
Ada sejumlah laporan mengenai sintesis enzimatik
dari Biosurfaktan dengan ikatan amida primer, tetapi hanya beberapa
contoh sintesis enzimatik dari amida sekunder
tersedia. Dalam kasus sintesis amida sekunder,
gugus hidroksil dari N-methylethanol amina juga dapat bereaksi
dengan ester asam lemak; dengan demikian, perlu untuk menemukan yang
cocok
kondisi yang memungkinkan asilasi selektif fungsi amina.
Izumi et al. telah dijelaskan sintesis amida
dari ester asam lemak dan amina primer menggunakan Chirazyme
L-2 (Candida antartica lipase) (6), meskipun konversi
amina sekunder, N-etil ester methylglycine menjadi metil
laurat dalam THF atau kloroform tidak berhasil. Kami memiliki
menentukan kondisi reaksi untuk sintesis amida sekunder
dan hasilnya hampir kuantitatif. enzimatik
N-asilasi N-metil-glucamine di heksana menggunakan lipase
dari Rhizomucor miehei telah dibuktikan. N-Methylglucamine
dilarutkan dengan penambahan asam oleat bebas, sehingga
dalam pembentukan pasangan ion antara asam dan
amina, yang tampaknya penting untuk sintesis amida (9). Selain itu,
sintesis surfaktan glucamide telah dilakukan
oleh asilasi N-metil-glucamine di hadapan
dari Chirazyme L-2, di kutub pelarut protik 2-metil-2-butanol
(21). Karena substrat N-metil-glucamine memiliki
baik amina dan gugus hidroksil, reaksi dengan metil
oleat dikatalisis oleh Chirazyme memberikan campuran amida dan
mono-ester, dengan preferensi yang lebih tinggi untuk pembentukan
amida.
Demikian pula, dalam penelitian ini, senyawa positif minor ninhidrin
dibentuk oleh tindakan Chirazyme dan Amano PS
dalam asetonitril bisa menjadi ester yang tidak stabil, yang diisomerisasi
oleh penataan ulang antarmolekul untuk memberikan N-metil
lauryoleathanolamide dan senyawa terurai lainnya
pada silika gel kromatografi kolom, penguapan, atau di
Reaksi dilakukan pada suhu yang lebih tinggi.
Reaktivitas tinggi fungsi amina sekunder lebih
alkohol dapat dikaitkan dengan nucleophilicity lebih tinggi
mantan. Dalam pelarut polar seperti asetonitril dan dioksan,
nucleophilicity sering ditingkatkan dan hidroksil
kelompok dalam ini pelarut polar mungkin terlibat dalam antar atau
intramolekul H-obligasi, sehingga membuatnya menjadi nukleofil yang
buruk.
Residu amino berfungsi sebagai nukleofil yang lebih baik daripada
gugus hidroksil (22). Namun, tidak stabil oleh-produk, mungkin
ester yang disusun kembali ke amida, adalah
terbentuk dalam penelitian ini. Hasil serupa menghasilkan campuran
amida dan mono-ester telah dilaporkan dengan bifunctional
substrat N-metil-glucamine (dengan amine- dan hidroksil
kelompok) dan asam lemak metil ester (21). pilihan
pelarut membentuk amida sekunder tampaknya cukup
terbatas seperti yang kita lihat dalam penelitian ini.
Kesimpulannya, metode yang efisien telah dikembangkan untuk
sintesis Chirazyme-driven stabil amida-ikatan
surfaktan N-metil lauroylethanolamide dari hydroxylated
amina sekunder dan metil laurat. Ini adalah salah satu dari beberapa
contoh enzimatik sintesis amida sekunder.