2) Sebutkan beberapa faktor yang perlu dipertimbangkan dalam merancang strategi untuk
isolasi RNA!
Jawaban
Secara garis besar proses isolasi RNA terdiri atas tiga tahap: (1) Pemecahan Sel dan
Solubilisasi Membran (2) Isolasi dan Pemurnian RNA, dan (3) Pemekatan RNA.
Beberapa faktor penting yang harus dipertimbangkan dalam merancang strategi isolasi RNA
antara lain:
a. Pemilihan metode untuk pemecahan sel dan solubilisasi membran. Sebaiknya cepat dan
tuntas. Metode : mekanik (homogenisasi, vorteks, sonikasi, french press, bead milling,
penggilingan) dan enzimatik (lysozyme, zymolase, dan lysostaphin)
b. Melakukan penghambatan terhadap aktivitas nuklease (inhibitor spesifik co/:RNA guard
dari Pharmacia, inhibitor nonspesifik co/: heparin, dan reagen lain co/: SDS).
c. Pemilihan metode deproteinisasi (1. enzim proteinase K, 2. ekstraksi dengan pelarut organik
seperti fenol dan kloroform,3. salting-out, 4. kombinasi seluruh perlakuan).
d. Pemilihan metode pemekatan RNA (presipitasi : kombinasi garam dan alkohol).
e. Penghilangan DNA Kontaminan. Ada tiga cara yang digunakan: 1. penambahan DNase, 2.
ekstraksi dengan fenol:kloroform (5:1), presipitasi litium klorida (LiCl). LiCl selektif
mengendapkan molekul RNA.
3) Jelaskan prinsip dasar pengklonan gen (gene cloning) yang juga disebut teknologi DNA
rekombinan!
Jawaban:
Teknologi DNA rekombinan merupakan pembentukan kombinasi materi genetik yang baru
dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk
terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan
sebagai sel inang. Tahapan-tahapan teknologi DNA rekombinan antara lain:
a. Fragmen DNA mengandung gen yang akan diklon dimasukkan ke dalam molekul DNA sirkular
yang disebut vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan.
b. Vektor mentranspor gen ke dalam sel inang, biasanya bakteri meskipun tipe lain makhluk
hidup dapat digunakan.
c. Dalam sel inang, vektor memperbanyak diri menghasilkan jumlah salinan yang identik tidak
hanya untuk dirinya sendiri tapi juga untuk gen yang dibawanya.
d. Ketika sel inang membelah, salinan molekul DNA rekombinan dimasukkan ke keturunan dan
replikasi vektor berlangsung.
e. Setelah sejumlah besar sel membelah, koloni, atau klon, identik sel inang diproduksi. Setiap
sel dalam klon mengandung satu atau lebih jumlah salinana molekul DNA rekombinan; gen
yang dibawa
5) Sebuah gen insulin (INS) akan diklon ke dalam vektor pBK1 untuk selanjutnya diekspresikan
pada bakteri. Situs restriksi yang tersedia pada segmen DNA yang membawa gen INS dan
situs restriksi yang tersedia pada vektor diperlihatkan pada gambar. Jelaskan:
a. Enzim restriksi yang Anda pilih untuk mengklon gen INS ke dalam vektor pBK1 (berikan
alasannya)!
b. Cara menapis (screening) koloni yang membawa plasmid pBK1 dengan insert gen INS
c. Sebutkan faktor yang perlu dipertimbangkan untuk mengoptimumkan ekspresi gen INS
pada bakteri
Jawaban:
a. Enzim restriksi yang dipilih adalah EcoR1. Enzim restriksi adalah enzim yang digunakan untuk
memotong DNA secara spesifik. Restriksi yang digunakan untuk memotong plasmid harus
sama dengan pemotong DNA asing agar urutan basanya bisa sesuai sehingga antara plasmid
dan DNA yang disisipkan akan bersatu. Dari gambar diketahui bahwa situs restriksi ecoR1
berada pada gen LacZ1. Situs ini paling tepat karena DNA asing akan menyisip di daerah gen
LacZ1 sehingga gen LacZ1 tidak berfungsi. Hal ini akan menjadi indikator keberhasilan dalam
seleksi transforman (seleksi biru-putih). Kita tidak dapat menyisipkan si situs BamHI karena
akan merusak gen penyandi resistensi antibiotik. Nantinya, bakteri hasil transformasi
ditempatkan pada medium nutrient padat yang mengandung amphicillin dan gula yang
disebut X-gal. Amphicilin dalam medium yang akan memastikan bahwa hanya bakteri yang
mengandung plasmid yang dapat tumbuh karena adanya resistensi dari amp-R, sedangkan
X-gal akan memudahkan identifikasi koloni bakteri yang mengandung DNA asing yang
disisipkan.
b. Cara penapisan (screening) yang dilakukan adalah dengan seleksi biru putih (media
mengandung Xgal dan IPTG/isopropil tiogalaktosidase). Enzim -galaktosidase dari ekspresi
gen LacZ1 akan memecah Xgal menjadi galaktosa dan 5-bromo-4chloroindigo yang berwarna
biru sehingga koloni bakteri yang mengandung plasmid dengan gen -galaktosidase utuh
akan berwarna biru, tetapi jika suatu plasmid memiliki DNA asing tersisipkan ke dalam
gen lacZ1-nya maka koloni sel akan berwarna putih karena sel tersebut tidak bisa
menghasilkan -galaktosidase untuk menghidrolisis X-gal.
c. Faktor yang berpengaruh terhadap tingkat ekspresi gen:
1. Promoter
2. Stabilitas mRNA
3. Pemilihan kodon
4. Jumlah salinan plasmid
5. Stabilitas plasmid
6. Fisiologi sel inang
b. PCR
PCR digunakan untuk mendeteksi virus, bakteri atau komponennya (faktor virulensi),
amplifikasi urutan nukleotida, menentukan kondisi urutan nukleotida suatu DNA yang
mengalami mutasi, bidang kedokteran forensik, melacak asal-usul sesorang dengan
membandingkan finger print, DNA sekuensing, isolasi DNA, dan lain-lain.
Prinsip dasar Polymerase Chain Reaction (PCR) adalah proses sintesis enzimatik untuk
amplifikasi sekuens nukleotida tertentu secara in vitro. Setiap urutan basa nukleotida yang
diamplifikasi akan menjadi dua kali jumlahnya. Komponen reaksi yang diperlukan dalam
teknik ini adalah untai tunggal DNA sebagai cetakan, primer, dNTPs (deoxynucleotide
triphosphates), buffer, kofaktor, dan enzim DNA polimerase. Secara umum prinsip reaksi
PCR membutuhkan tiga tahap, yaitu:
1. Denaturasi
Prinsipnya adalah memisahkan DNA untai ganda menjadi komponen untai tunggal sehingga
memungkinkan terjadinya hibridisasi primer. denaturasi awal dilakukan sebelum enzim taq
polimerase ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Denaturasi dilakukan pada suhu tinggi (91-
980C) untuk memutus ikatan hidrogen antarnukleotida dan dapat diperlama jika sekuens
banyak mengandung nukleotida G-C. Biasanya dilakukan selama 3 menit. Waktu denaturasi
yang terlalu lama dapat mengurangi aktifitas enzim Taq polymerase.
2. Annealing
Pada tahap ini terjadi hibridisasi primer PCR pada sekuens targetnya. Dilakukan pada suhu
50-600C, dipengaruhi oleh panjang dan susunan DNA (%GC) dan umumnya dilakukan pada
suhu 50C di bawah suhu Tm primer. Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer
yang baik adalah bahwa primer sebaiknya berukuran 18 25 basa, mengandung 50 60 %
G+C dan untuk kedua primer tersebut sebaiknya sama. Waktu annealing yang biasa
digunakan dalam PCR adalah 30 45 detik. Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi
temperaturnya.
3. Elongasi (ekstensi rantai DNA)
Tahap ini Taq polymerase memulai aktivitasnya memperpanjang DNA primer dari ujung 3.
Kecepatan penyusunan nukleotida oleh enzim tersebut pada suhu 720C diperkirakan 35 100
nukleotida/detik, bergantung pada buffer, pH, konsentrasi garam dan molekul DNA target.
Dengan demikian untuk produk PCR dengan panjang 2000 pasang basa, waktu 1 menit
sudah lebih dari cukup untuk tahap perpanjangan primer ini. Biasanya di akhir siklus PCR
waktu yang digunakan untuk tahap ini diperpanjang sampai 5 menit sehingga seluruh produk
PCR diharapkan terbentuk DNA untai ganda.
8) Apa yang dimaksud dengan pustaka DNA dan jelaskan cara penapisannya!
Jawaban:
Pustaka genom merupakan sekumpulan sekuens (urutan) DNA dari suatu organisme yang
masing-masing telah diklon ke dalam vektor tertentu untuk memudahkan pemurnian,
penyimpanan, dan analisisnya. Deteksi pustaka gen dapat ditentukan dengan: (a) DNA probe.
Prosedur ini dinamakan hibridisasi DNA dan tergantung pada stabilitas pasangan basa antara
probe dan sekuens target. (b) Uji imunologi. Digunakan untuk DNA klon yang ditranskripsi dan
ditranslasi menghasilkan suatu protein. Sampel setiap koloni ditransfer ke matriks, protein
dilepaskan dan menempel pada matriks. Matriks yang ada protein terikat dengan antibodi
pertama setelah interaksi protein target dengan antibodi pertama, antibodi yang terikat
dibersihkan dan diberi antibodi kedua. (c) Aktivitas protein. Jika gen target adalah enzim, uji
aktivitas protein dengan metode plate yang mana memplate pustaka genom pada E.coli pada
medium yang ditambah substrat spesifik dan menggunakan pewarnaan selektif untuk identifikasi
koloni yang mampu memanfaatkan substrat.
b. Prinsip qPCR
qPCR/real time PCR merupakan pengembangan PCR konvensional. Real Time PCR (juga
dikenal sebagai quantitative real time polymerase chain reaction (Q-PCR/qPCR) atau kinetic
polymerase chain reaction) adalah suatu teknik pengerjaan PCR di laboratorium untuk
mengamplifikasi (memperbanyak) sekaligus menghitung (kuantifikasi) jumlah target molekul
DNA hasil amplifikasi tersebut. Real Time PCR memungkinkan dilakukannya deteksi dan
kuantifikasi (sebagai nilai absolut dari hasil perbanyakan DNA atau jumlah relatif setelah
dinormalisasi terhadap input DNA atau gen-gen penormal yang ditambahkan) sekaligus
terhadap sekuens spesifik dari sampel DNA yang dianalisis. Cara kerja Real Time PCR
mengikuti prinsip umum reaksi PCR, utamanya adalah DNA yang telah diamplifikasi dihitung
setelah diakumulasikan dalam reaksi secara real time sesudah setiap siklus amplifikasi
selesai. Terdapat 2 (dua) metode kuantifikasi yang umum digunakan antara lain :
o Menggunakan zat pewarna fluoresensi yang akan terinterkalasi dengan DNA rantai ganda
(dsDNA) misalnya SyBr Green
o Probe (penanda) yang berasal dari hasil modifikasi DNA oligonukleotida yang akan
berpendar (flourensensi) ketika terhibridisasi dengan DNA komplemen, misalnya probe
FRET (Hybridisasi) dan probe TaqMan. Dalam setiap pengamatan proses PCR, sinyal
fluoresensi yang dipancarkan akan meningkat secara proporsional setiap siklus PCR telah
berhasil dilakukan sejalan dengan bertambahnya produk DNA (DNA hasil amplifikasi) yang
dihasilkan
c. Pemaketan DNA faga sebagai vektor
Pemaketan in vitro: DNA faga rekombinan dipaket kedalam bentuk partikel faga untuk
meningkatkan efisiensi pemasukan faga kedalam sel. Pemaketan in vitro:
- Sintesis protein kapsid oleh sel E. coli yang membawa faga yang mengalami mutasi pada
situs cos (defective coc sites);
- Sintesis protein kapsid yang jenisnya tidak lengkap oleh dua strain E. Coli
- Campuran lisat sel menghasilkan protein kapsid yang jenisnya lengkap dan dapat
digunakan untuk pemaketan molekul DNA .
10) Jelaskan beberapa cara diagnosis patogen dan jelaskan keunggulan cara molekuler!
Jawaban:
a. PCR (Polymerase Chain Reaction) merupakan metode molekuler untuk amplifikasi DNA
secara in vitro menggunakan enzim dan sepasang primer yang bersifat spesifik terhadap
DNA target. Hasil amplifikasi dilakukan analisis lanjutan menggunakan elektroforesis yang
akan memisahkan DNA berdasarkan kecepatan migrasi di bawah pengaruh medan listrik.
Hasil fragmen yang telah divisualisasi dibandingkan dengan standar. Jika fragmen DNA
sampel sama dengan fragmen DNA standar maka sampel positif mengandung patogen.
b. RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) merupakan metode amplifikasi cDNA (complementary
DNA), yaitu DNA hasil proses transkripsi balik menggunakan RNA sebagai template
selanjutnya melakukan teknik PCR. Diagnosis misalnya dilakukan pada deteksi virus avian
influenza. Bagan deteksi dan analisis dapat dilihat pada gambar berikut.
Keunggulan diagnosis patogen cara molekuler:
1. Mencegah penularan penyakit
2. Diagnosis lebih akurat dan cepat
3. Tidak membutuhkan sampel dalam jumlah yang banyak
4. Dapat menentukan jenis patogen dan jumlahnya
5. Metode konvensional cenderung mahal, prosesnya lama dan membutuhkan keahlian yang
tinggi.