Laporan Praktikum Biokimia 1

Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

I. JUDUL : Penentuan Kadar Protein dengan Metode

Biuret
II. TANGGAL PERCOBAAN : Selasa, 25 Oktober 2016
III. TUJUAN PERCOBAAN : Menentukan kadar protein yang ada pada
sampel dengan menggunakan metode biuret
IV. DASAR TEORI

Pengertian Protein

Protein yang namanya berarti pertama atau umum merupakan

makromolekul yang paling berlimpah didalam sel dan menyusun lebih dari
setengah berat kering pada hampir semua organisme. Semua protein didalam
semua makhluk hidup dibangun oleh susunan dasar yang sama, yaitu 20 asam
amino baku. (Lehninger,1982). Struktur asam amino digambarkan sebagai
berikut:

Protein adalah molekul yang sangat vital untuk organisme dan terdapat di
semua sel yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang
dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Protein merupakan suatu zat
makanan yang sangat penting bagi tubuh karena zat ini berfungsi sebagai sumber
energi dalam tubuh serta sebagai zat pembangun dn pengatur. Protein adlaah
polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul
protein mengandung unsur-umsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang mengandung
unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno, 1992).
Protein merupakan suatu polipeptida dengan berat molekul yang sangat
bervariasi dari 5000 samapi lebih dari satu juta karena molekul protein yang besar,
protein sangat mudah mengalami perubahan fisis dan aktivitas biologisnya.
Banyak agensia yang menyebabkan perubahan sifat alamiah dari protein seperti
panas, asam, basa, solven organik, garam, logam berat, radiasi sinar radioaktif
(Sudarmadji, 1996).
Struktur & fungsi ditentukan oleh kombinasi, jumlah dan urutan asam
amino sedangkan sifat fisik dan kimiawi dipengaruhi oleh asam amino
 Laporan Praktikum Biokimia 1
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

penyusunnya. Penentuan kadar protein dapat dilakukan menggunakan beberapa

metode, yaitu metode secara kuantitatif, metode secara kualitatif, dan metode
spektrofotometri UV-Vis. Untuk metode Biuret sendiri termasuk kedalam metode
kuantitatif. Metode biuret merupakan salah satu cara yang terbaik untuk
menentukan kadar protein dalam suatu larutan.
Struktur protein ada 4 tingkatan yaitu :
a. Struktur primer menunjukkan jumlah, jenis dan urutan asam amino
dalam molekul protein (rentetan asam amino dalam suatu molekul protein).
b. Struktur sekunder menunjukkan banyak sifat suatu protein, ditentukan
oleh orientasi molekul sebagai suatu keseluruhan, bentuk suatu molekul protein
(misalnya spiral) dan penataan ruang kerangkanya (ikatan hidrogen antara gugus
N-H, salah satu residu asam amino dengan gugus karbonil C=O residu asam yang
lain).
c. Struktur tersier menunjukkan keadaan kecenderungan polipeptida
membentuk lipatan tali gabungan (interaksi lebih lanjut seperti terlipatnya
kerangka untuk membentuk suatu bulatan).
d. Struktur kuartener menunjukkan derajat persekutuan unit-unit protein.

Ditinjau dari strukturnya, protein dapat dibagi dalam 2 golongan yaitu:

a. Protein sederhana yang merupakan protein yang hanya terdiri atas
molekul-molekul asam amino
b. Protein gabungan yang merupakan protein yang terdiri atas protein dan
gugus bukan protein. Gugus ini disebut gugus prostetik dan terdiri atas
karbohidrat, lipid atau asam nukleat.

Pada dasarnya suatu peptida adalah asil-asam amino, karena gugus

COOH dan NH2 membentuk ikatan peptida. Peptida didapatkan dari hidrolisis
protein yang tidak sempurna. Apabila peptida yang dihasilkan dihidrolisis lebih
lanjut akan dihasilkan asam-asam amino. (Anna Poedjiadi, 1994).
Sifat peptida ditentukan oleh gugus COOH, NH2 dan gugus R. Sifat
asam dan basa pada peptida ditentukan oleh gugus COOH dan NH2 , namun
pada rantai panjang gugus COOH dan NH2 yang terletak diujung rantai tidak
lagi berpengaruh. Suatu peptida juga mempunyai titik isolistrik seperti pada asam
amino. Reaksi biuret merupakan reaksi warna untuk peptida dan protein. (Anna
Poedjiadi, 1994).
 Laporan Praktikum Biokimia 1
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

Dalam larutan basa, Cu2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptide

suatu protein, sehingga menghasilkan wara ungu dengan absorbansi maksimal
pada rentang panjang gelombang 540 nm. Reaksinya adalah sebagai berikut :

OH OH

+ NaOH + CuSO4 Na2SO4 + H2O +

H 2C HC HC
Fungsi penambahan NaOH yaitu agar suspensi larutan 2 pada sampel
2

HC NH 2 HC NH 2 HC NH 2
bersuasana alkalis. Sedangkan penambahan CuSO4 bertujuan untuk menghasilkan
COOH C C
O O
biuret berwarna ungu. Absorbansi ini berbanding lurus dengan konsentrasi
O
protein
O

Cu
dan tidak tergantung jenis protein, karena seluruh protein pada dasarnya
mempunyai jumlah ikatan peptide yang sama per satuan berat. Berikut adalah
kurva standart antara absorbansi Vs konsentrasi :

Reaksi biuret merupakan reaksi yang umum digunakan untuk gugus

peptide dan protein. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu,
karena terbentuknya senyawa kompleks antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan
peptida. Banyaknya asam amino yang terikat pada ikatan peptida mempengaruhi
warna reaksi. Untuk itu digunakan metode biuret, metode biuret sendiri digunakan
untuk mengetahui ada atau tidaknya ikatan peptida dalam suatu senyawa protein.
Intensitas warna tergantung pada konsentrasi protein yang ditera.
Penentuan protein cara biuret adalah dengan mengukur optical density (OD) pada
panjang gelombang 560 580 nm. Agar dapat menghitung banyaknya protein
maka perlu lebih dahuu dibuat kurva baku/standar yang melukiskan hubungan
antara konsentrasi protein dengan OD pada panjang gelombang terpilih.
Dibandingkan dengan cara Kjeldahl maka biuret lebih baik karena hanya
protein atau senyawa peptida yang bereaksi dengan biuret, kecuali urea.
 Laporan Praktikum Biokimia 1
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

Hal hal yang dapat mengganggu reaksi ini adalah adanya urea
( mengandung gugus CO, -NH ) dan gula pereduksi yang bereaksi dengan
Cu2+. Berikut reaksi biuret dengan protein :

Spektrofotometer UV-Vis merupakan instrument gabungan antara

spektrofotometer ultraviolet dan spektrofotometer sinar tampak yang dapat
mengukur serapan/ aborbansi radiasi pada panjang gelombang 180-750 nm
(Suyatno, 2011). Selain itu penentuan kadar protein dengan protein dengan
metode biuret, digunakan Hukum Lambert Beer, yaitu :

Keterangan:
Y : Absorbansi Y = ax + b
x : Konsentrasi

Hukum Lambert Beer tersebut dapat berlaku bila larutan encer, dan analit
tidak terdisosiasi. Berasosiasi, atau bereaksi dengan pelarut dan radiasi cahaya nya
monokromatis (mempunyai 1 macam panjang gelombang), dan larutan tidak
keruh (bebas partikel koloid) (Hendayana, 1994 dalam Sudarman, 2012).

Nilai Gizi Protein

Kalau susunan asam amino jumlah dan jenisnya di dalam protein makanan
sama dengan susunan yang diperlukan tubuh untuk sintesa protein tubuh, maka
semua asam amino protein makanan tersebut akan dipergunakan, sehingga
efisisensi penggunaannya menjadi 100 %. Bila ada satu atau lebih asam amino
essensial mempunyai kwantum yang lebih rendah dari yang diperlukan unutk
sintesa protein tubuh, maka hanya sebagian saja dari seluruh asam amino essensial
makanan tersebut dapat dipergunakan, sehingga efisiensi penggunaan protein
makanan tersebut lebih rendah dari 100 %.Jadi persentase penggunaan protein
 Laporan Praktikum Biokimia 1
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

makanan (kualitas protein makanan) ditentukan oleh ada atau tidaknya semua
jenis asam amino essensial di dalam makanan tersebut mencukupi kebutuhan
untuk sintesa protein tubuh (Djaeni, 2008).

Pengaruh Pengolahan terhadap Protein

Kadar asam amino dalam suatu protein tidak secara kuantitatif menunjukkan
nilai gizinya karena pembatas dalam penggunaan protein adalah nilai cerna
protein.Pengolahan dapat menaikkan dan menurunkan nilai cerna
protein.Denaturasi protein oleh pemanasan dapat mempermudah hidrolisis protein
oleh protease dalam usus halus, namun demikian pemanasan juga dapat
menurunkan mutu protein akibat perombakan protein (Harris, 2009).
Pada bahan makanan yang difermentasi, terjadi perubahan protein menjadi
komponen yang lebih kecil oleh adanya enzim yang bekerja pada bahan makanan
tersebut, baik yang berasal dari mikroba atau dari bahan makanan itu
sendiri.Beberapa faktor yang mempengaruhi hasil peruraian protein seperti sifat-
sifat asal bahan pangan itu sendiri, jenis mikroba yang tumbuh selama fermentasi,
kondisi fermentasi dan lamanya waktu fermentasi (Winarno, 1980).

Protein pada Ikan Mujair Nila

Secara umum, sebagai bahan pangan sumber lauk-pauk, kandungan nutrisi
yang terkandung dalam daging ikan sama saja dengan yang ada dalam daging sapi
atau daging ayam. Ada protein, lemak, vitamin, dan mineral.Yang membedakan
adalah jumlah, komposisi, dan jenis dari masing-masing zat gizi tersebut.Protein
pada ikan tersusun atas asam amino esensial yang lengkap dan lebih mudah
dicerna dibanding protein dari sumber hewani lainnya.Protein merupakan sumber
nutrisi penting untuk pertumbuhan.Sementara, untuk soal lemaknya, jenis lemak
yang ada dalam ikan berbeda dari lemak yang ditemukan dalam daging sapi atau
daging ayam. Jadi, kalau biasanya orang dengan sengaja membatasi asupan
daging merah, termasuk daging sapi, karena khawatir akan gempuran lemak (jenis
asam lemak jenuh) dan kolesterolnya, tidak begitu halnya dengan ikan.
Ikan mujair nila merupakan salah satu jenis ikan yang kaya akan manfaat,
Memperlancar proses metabolisme dari karbohidrat, protein dan lemak, mencegah
terjadinya insomnia, mencegah kram dan kejang otot, mengurangi terjadinya
 Laporan Praktikum Biokimia 1
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

gangguan emosi, meningkatkan daya tahan dan imunitas tubuh. Variasi makanan
juga diperlukan untuk orang yang kesehatannya kurang normal.ikan mujair nila
merupakan salah satu solusi untuk memenuhi kebutuhan asupan nutrisi yang di
butuhkan tubuh kita. Ikan mujair nila juga merupakan salah satu jenis ikan yang
familyer mudah di dapat dan di olah dalam berbagai varian rasa.
Ikan mujair nila memiliki daging yang gurih dan nikmat, hal itu yang
membuat ikan mujair nila mudah diolah menjadi berbagai makanan lezat.Selain
itu, ikan mujair nila mempunyai kandungan gizi yang bermanfaat bagi kesehatan
tubuh. Di dalam ikan mujair nila terdapat kandungan protein, vitamin A, vitamin
E, dan kandungan mineral yang terdiri dari kalsium, fosfor serta magnesium.
Ikan mujair nila juga memiliki kandungan omega-3 yang bermanfaat untuk proses
pencernaan dan perkembangan sel-sel di dalam otak.
Menurut Leksono dan Syhrul ikan nila memiliki kandungan gizi yang
lebih baik jika dibandingkan dengan ikan air tawar lainnya seperti ikan lele.
Kandungan protein ikan nila merah sebesar 43,76%; lemak 7,01 %; kadar abu
7,01% per 100 gram berat ikan nila. Dibandingkan dengan kacang-kacangan,
telur, dan daging, protein ikan lebih tinggi.Protein sangat bermanfaat untuk
merangsang sel pertumbuhan pada balita.Selain itu protein ikan juga sangat
mudah dicerna, sehingga baik untuk dikonsumsi oleh balita.

A. Metode Biuret
Suatu peptida yang mempunyai dua ikatan peptida ata lebih dapat bereaksi
dengan ion Cu++ dalam suasana basa dan membentuk suatu senyawa kompleks
yang berwarna biru ungu. Reaksi ini dikenal dengan nama reaksi biuret (Poedjiadi
dan Supriyanti, 2006).
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan
larutan Cupri Sulfat (CuSO4) encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa-
senyawa yang mengandung gugus amida asam (-CONH2) yang berada bersama
gugus amida asam yang lain atau gugus yang lain seperti : -CSNH 2, -C(NH)NH2,
-CH2NH2, -CRHNH2, -CHOHCH2NH2, -CHOHCH2NH2, -CHNH2CH2OH,
-CHNH2CHOH.Dengan demikian uji Biuret tidak hanya untuk protein tetapi zat
lain seperti Biuretatau malonamida juga memberikan reaksi positif yaitu ditandai
dengan timbulnya warnamerah-violet atau biru-violet.
 Laporan Praktikum Biokimia 1
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

Intensitas warna tergantung pada konsentrasi protein yang ditera.

Penentuan protein cara biuret adalah dengan mengukur optical density (OD) pada
panjang gelombang 520 540 nm. Penentuan protein berdasarkan absorbansi
sinar UV adalah cepat, mudah, dan tidak merusak bahan.Untuk keperluan
perhitungan juga diperlukan kurva standar yang melukiskan hubungan antara
konsentrasi protein dengan optical density. Keuntungan dari spekrofotometer UV-
tampak ini adalah dilengkapi dengan alat perekam yang menyediakan plot
absorban vs panjang gelombang. Agar plot ini akurat, penempatan radiasi suatu
sampel, harus sedekat mungkin dengan monokromatik. Dibandingkan dengan cara
Kjeldahl maka biuret lebih baik karena hanya protein atau senyawa peptida yang
bereaksi dengan biuret, kecuali urea.
Berikut reaksi yang terjadi ketika reagen biuret bereaksi dengan ikatan peptide
pada protein ikan mujair nila :

Selain metode biuret, terdapat beberapa metode analisis protein yang lain.
Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu ;Secara kualitatif
terdiri atas ; reaksi Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi
Nitroprusida, dan reaksi Sakaguchi.
Secara kuantitatif terdiri dari ; metode Kjeldahl, metode titrasi formol,
metode Lowry, metode spektrofotometri visible (Biuret), dan metode
spektrofotometri UV.
Analisa Kualitatif
1. Reaksi Xantoprotein
Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan
protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi
 Laporan Praktikum Biokimia 1
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena
yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang
mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan.
2. Reaksi Hopkins-Cole
Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan
pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari
asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan
pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga
membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi
cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut.
3. Reaksi Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam
nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan
endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya
reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan
gugus hidroksifenil yang berwarna.
4. Reaksi Natriumnitroprusida
Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan menghasilkan warna
merah dengan protein yang mempunyai gugus SH bebas. Jadi protein yang
mengandung sistein dapat memberikan hasil positif.
5. Reaksi Sakaguchi
Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan natriumhipobromit. Pada dasarnya
reaksi ini memberikan hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi arginin atau
protein yang mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah.
6. Metode Biuret
Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan
CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawa senyawa yang
mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji
ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet
atau biru violet.
Analisa Kuantitatif
Analisis protein dapat digolongkan menjadi dua metode, yaitu: Metode
konvensional, yaitu metode Kjeldhl (terdiri dari destruksi, destilasi, titrasi), titrasi
formol. Digunakan untuk protein tidak terlarut.
Metode Modern, yaitu metode Lowry, metode spektofotometri visible,
metode spektofotometri UV. Digunakan untuk protein terlarut.
1. Metode Kjeldahl
 Laporan Praktikum Biokimia 1
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

Metode ini merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen

total pada asam amino, protein, dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel
didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai
sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan alkali dengan
kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan
penyerap dan ditetapkan secara titrasi.
2. Metode Titrasi Formol
Larutan protein dinetralkan dengan basa (NaOH) lalu ditambahkan formalin
akan membentuk dimethilol. Dengan terbentuknya dimethilol ini berarti gugus
aminonya sudah terikat dan tida akan mempengaruhi reaksi antara asam dengan
basa NaOH sehingga akhir titrasi dapat diakhiri dengan tepat. Indikator yang
digunakan adalah pp, akgir titrasi bila tepat terjadi perubahan warna menjadi
merah muda yang tidak hilang dalam 30 detik.
3. Metode Spektofotometri UV
Asam amino penyususn protein diantaranya adalah triptofan, tirosin, dan
fenilalanin yang mempunyai gugus aromatik. Triptofan mempunyai absorbasi
maksimum pada 280 nm, sedangkan untuk tirosin mempunyai absorbsi
maksimum pada 278 nm. Fenilalanin menyera sinar kurang kuat dan pada panjang
gelombang lebih pendek. Absorbsi sinar pada 280 nm dapat digunakan untuk
estimasi konsentrasi protein dalam larutan. Supaya hasilnya lebi teliti perlu
dikoreksi kemungkinan adanya asam nukleat dengan pengukuran absorbsi pada
260 nm. Pengukuran pada 260 nm untuk melihat kemungkinan kontaminasi oleh
asam nukleat. Rasio absorbsi 280/260 menentukan faktor koreksi yang ada dalam
suatu tabel.
 Laporan Praktikum Biokimia 1
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

V. ALAT dan BAHAN

Alat
Tabung reaksi 9 buah
Gelas kimia 3 buah
Pipet tetes 9 buah
Rak tabung 1 buah
Spektronik 20
Bahan
Ikan mujair nila
1 mL larutan standar protein
Reagen biuret
Aquades
 Laporan Praktikum Biokimia 1
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

VI. ALUR KERJA

1. Persiapan sampel

1 gram sampel

Dihancurkan menggunakan mortar dan alu

Ditambahkan air 10 mL
Disentrifuge 3500 rpm 10 menit

Residu Filtrat

2. Pembuatan standar

1 mL larutan standar protein

kadar 1 mg/ml
kadar 2 mg/ml
kadar 3 mg/ml
kadar 4 mg/ml
kadar 5 mg/ml

(+) 3 mL reagen biuret

Dikocok
Diinkubasi pada suhu 37C selama 10 menit

Warna ungu yang stabil

Diukur absorbansi masing-masing pada panjang gelombang 520 nm

Absorbansi

3. Penentapan absorbansi larutan blanko

 Laporan Praktikum Biokimia 1
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret

1 mL aquades

Dimasukkan kedalam tabung reaksi

(+) 3 mL reagen biuret
Dikocok
Diinkubasi pada suhu 37C selama 10 menit
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm

absorbansi

4. Penetapan absorbansi larutan sampel

1 mL larutan sampel

Dimasukkan kedalam tabung reaksi

(+) 3 mL reagen biuret
Dikocok
Diinkubasi pada suhu 37C selama 10 menit
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm

absorbansi
 Laporan Praktikum Biokimia 1
Penentuan Kadar Protein dengan Metode Biuret
VII. HASIL PENGAMATAN

No.
Prosedur Percobaan Hasil Pengamatan Dugaan/Reaksi Kesimpulan
Perc.
1. Persiapan sampel Sebelum : CuSO4.5H2O + Dari percobaan yang
1 gram sampel Sampel daging 2NaOH dilakukan dapat
ikan mujair nila: Cu(OH)2 + disimpulkan bahwa
berwarna putih Na2SO4 + 5H2O rata-rata konsentrasi
aquades:
Dihancurkan menggunakan mortar dan alu larutan Cu(OH)2 Cu+ + sampel alam 10 mL =
Ditambahkan air 10 mL tidak berwarna 2OH- 4,1956 mg/mL
Disentrifuge 3500 rpm 10 menit
Sesudah
Sampel + 10 mL Dari hasil percobaan
H2O : larutan isimulkan bahwa hasil
putih keruh yang diperoleh yaitu
Disentrifuge : sebesar kadar protein
endapan pada ikan mujair nila
Residu Filtrat
berwarna putih, sebesar 4,71% dan
Filtrat dan residu tidak sesuai dengan
terpisah teoritis.

Kadar Protein ikan mujair

nila: 43,76%
 2. Pembuatan standar Sebelum : Terbentuknya warna ungu Disimpulkan bahwa
- Larutan standar menandakan adanya semakin tinggi kadar
1 mL larutan standar protein protein : kandungan protein pada larutan standar maka
Larutan tak larutan standar warnanya akan
berwarna semakin pekat ketika
- Aquades : bereaksi dengan
1 mg/ml 2 mg/ml 3 mg/ml 4 mg/ml 5 mg/ml cairan tak reagen biuret. Dan
berwarna ketika warna larutan
- Reagen biuret :
semakin pekat, maka
larutan
nilai absorbansinya
berwarna biru
juga semakin tinggi
Sesudah :
(+) 3 mL reagen biuret
- 5 mL lar.sampel
Dikocok protein dengan
Diinkubasi pada suhu 37C selama 10 menitkadar 10 mg/ml
diencerkan
dengan 10 mL
Warna ungu yang stabil aquades :
larutan tidak
berwarna (kadar
Diukur absorbansi masing-masing pada panjang gelombang 520 nm
5 mg/ml)
- Larutan protein
dengan kadar 4
Absorbansi mg/ml : larutan
tidak berwarna
- Larutan protein
 dengan kadar 3
mg/ml : larutan
tidak berwarna.
- Larutan protein
dengan kadar 2
mg/ml : larutan
tidak berwarna
- Larutan protein
dengan kadar 1
mg/ml : larutan
tidak berwarna

Ditambah 3mL
reagen biuret:
- kadar 5 mg/ml =
ungu (-)
- kadar 4 mg/ml =
ungu (-)
- kadar 3 mg/ml =
biru keunguan
- kadar 2 mg/ml =
ungu (- - )
- kadar 1 mg/ml =
biru keunguan
(-)
Diinkubasii :
 warna larutan tetap
- Tabung 1 : 0,026
- Tabung 2 : 0,096
- Tabung 3 : 0,182
- Tabung 4 : 0,216
- Tabung 5 : 0,317
3. Penetapan absorbansi larutan blanko Sebelum : Sesuai dengan teori
1 mL aquades - Aquades : hasil percobaan dari
larutan tidak aquades dengan
berwarna reagen biuret
Dimasukkan kedalam tabung reaksi - Reagen biuret : menghasilkan larutan
(+) 3 mL reagen biuret larutan berwarn biru jernih yang
Dikocok biru digunakan sebagai
Diinkubasi pada suhu 37C selama 10 menit pembanding
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang Sesudah
520 nm:
- Aquades +
biuret : larutan
berwarna biru
(-)
- Diinkubasi :
larutan biru (+)
absorbansi
4. Penentapan absorbansi larutan sampel Sebelum : Dari hasil kurva
1 mL larutan sampel - Smpel protein : standar diperoleh :
larutan tak y=0.0702 x0.0432
berwarna
Dimasukkan kedalam tabung reaksi - Regen biuret : dengan nilai regresi
(+) 3 mL reagen biuret larutan linear R = 0,9847.
Dikocok berwarna biru Sedangkan pada
Diinkubasi pada suhu 37C selama 10 menit sampel diperoleh nilai
Diukur absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm absorbansi sebesar
Sesudah : 0,273, 0,235, 0,246
- Sampel protein Sehingga diperoleh
+ biuret : konsentrasi rata-rata
larutan sampel ikan mujair
berwarna biru nila sebesar 4,1956
(-) mg/mL, dan kadar
- Diinkubasi : protein pada ikan
absorbansi
larutan biru (+), mujair nila sebesar
diperoleh 4,71%
absorbansi :

Tabung 1: 0.273
Tabung 2 : 0,235
Tabung 3 : 0,246
VIII. ANALISIS DATA dan PEMBAHASAN

Prinsip kerja penentuan kadar protein dengan metode biuret adalah

menganalisis adanya ikatan peptida dengan cara menambahkan reagen biuret
kedalam sample yang kemudian di ukur absorbansinya menggunakan
spektrofotometer. Pada dasarnya suatu peptida adalah asil-asam amino, karena
gugus COOH dan NH2 membentuk ikatan peptida.Peptida didapatkan dari
hidrolisis protein yang tidak sempurna. Apabila peptida yang dihasilkan
dihidrolisis lebih lanjut akan dihasilkan asam-asam amino. (Anna Poedjiadi,
1994).

Sifat peptida ditentukan oleh gugus COOH, NH2 dan gugus R. Sifat
asam dan basa pada peptida ditentukan oleh gugus COOH dan NH2 , namun
pada rantai panjang gugus COOH dan NH2 yang terletak diujung rantai tidak
lagi berpengaruh. Suatu peptida juga mempunyai titik isolistrik seperti pada asam
amino.Reaksi biuret merupakan reaksi warna untuk peptida dan protein.(Anna
Poedjiadi, 1994).

Pada percobaan pertama dalah pembuatan sampel. Sampel yang digunakan

adalah ikan mujair nila berwarna putih kekuningan. Sebelumnya, ikan mujair nila
ditimbang sebanyak 1 gram kemudian dihaluskan menggunakan mortar alu.
Setelah halus, ditambahkan air secukupnya sehingga diperoleh larutan sampel.
Fungsi penambahan air, yaitu agar sampel ikan dapat larut sempurna. Kemudian
larutan tersebut disentrifuge pada 3500rpm selama 10 menit. Setelah proses
sentrifugi diperoleh supernatant berupa larutan putih keruh dan terdapat endapan
pada dinding tabung. Supernatant tersebut diambil sebanyak 1 mL untuk proses
pengencerkan. Dilakukan pengenceran karena supernatant yang diperoleh masih
memiliki warna putih keruh (+) sehingga perlu diencerkan hingga 20x dan larutan
menjadi warna larutan keruh (- -).

Pada percobaan kedua, yaitu pembuatan larutan standar, terlebih dahulu

membuat larutan standar dari larutan induk protein dengan kadar 10 mg/mL.
Larutan standar protein tersebut terlebih dahulu dilakukan pengenceran. Kadar
pengenceran yang diinginkan adalah 1 mg, 2 mg, 3 mg, 4 mg, dan 5 mg. Sehingga
dilakukan pengenceran terhadap 1 mL larutan standar protein dengan kadar 10
mg/mL menggunakan labu ukur 10 mL. Berikut perhitungan yang diperoleh untuk
proses pengenceran :

1. V1M1 = V2M2
10 mg/mL . V1 = 5 mg/mL . 10 mL
V1 = 5 mL
2. V1M1 = V2M2
4 mg/mL . V1 = 5 mg/mL . 10 mL
V1 = 8 mL

3. V1M1 = V2M2
4 mg/mL . V1 = 3 mg/mL . 10 mL
V1 = 7,5 mL
4. V1M1 = V2M2
3 mg/mL . V1 = 2 mg/mL . 10 mL
V1 = 6,6 mL
5. V1M1 = V2M2
2 mg/mL . V1 = 1 mg/mL . 10 mL
V1 = 5 mL
Setelah diencerkan, larutan standar dimasukkan kedalam tabung reaksi.
Selanjutnya ditambahkan dengan 3 ml reagen Biuret. Setalah kelima tabung terisi,
diambil 5 mL reagen biuret larutan berwarna biru (-) dan dicampurkan pada
kelima tabung. Sehingga diperoleh data :
- Tabung kadar 5 mg/ml = larutan berwarna ungu (-)
- Tabung kadar 4 mg/ml = larutan berwarna ungu (-)
- Tabung kadar 3 mg/ml = larutan berwarna biru keunguan
- Tabung kadar 2 mg/ml = larutan berwarna ungu (- -)
- Tabung kadar 1 mg/ml = larutan berwarna biru keunguan (-)

Reaksi biuret merupakan reaksi warna yang umum untuk gugus peptida (-
CO-NH-) dan protein. Reaksi positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu
karena terbentuk senyawa kompleks antara Cu2+ dan N dari molekul ikatan
peptida. Banyaknya asam amino yang terikat pada ikatan peptida mempengaruhi
warna reaksi ini. Terjadinya perubahan warna larutan menjadi warna ungu terjadi
karena Cu2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida pada suatu protein.
Larutan standar tersebut kemudian dimasukkan pada waterbath bersuhu 37C
selama 10 menit terjadi perubahan. Setelah 10 menit, larutan standar diukur
absorbansinya dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang
540 nm. Berikut kurva standar yang dihasilkan dari pengukuran absorbansi
larutan standar :
 Grafik absorbansi VS Konsentrasi
0.35
0.3
f(x) = 0.07x - 0.04
0.25 R = 0.98
0.2
absorbansi
Absorbansi 0.15
Linear (absorbansi)
0.1
0.05
0
0 2 4 6

konsentrasi

Pada percobaan ketiga yaitu penetapan absorbansi larutan blanko. Larutan

ini digunakan sebagai pembanding yaitu langkah pertama diambil 1 mL aquades
larutan tak berwarna dimasukkan ke dalam tabung reaksikemudian ditambahkan
dengan eagen biuret larutan berwarna biru dan larutan tersebut dikocok sehingga
diperoleh larutan berwarna biru ( - ). Langkah selanjutnya yaitu larutan blanko ini
di inkubasi pada suhu 37 C ditunggu sekitar 10 menit dan perubahan
warnanya tetap. Lalu diabsorbansi larutan standart pada panjang gelombang 540
nm menggunakan alat spektrofotometer UV-Vis.

Pada percobaan keempat adalah penetapan absorbansi pada larutan

sampel, sampel yang digunakan adalah sampel ikan mujair nila. Langkah yang
harus dilakukan adalah menimbang 1 gram sampel, yang kemudian dihaluskan
menggunakan mortar dan alu. Selanjutnya memasukkan sampel kedalam labu
ukur 10 ml untuk dilakukan pengenceran dengan cara menambahkan aquades
hingga batas miniskus. Selanjutnya larutan disaring untuk mendapatkan filtrate
berupa soluble protein yang akan digunakan untuk uji biuret. Kemudian diambil 1
ml sampel sebanyak 3 kali dan didistribusikan ke dalam tiga tabung reaksi.Hal
tersebut dilakukan untuk 3 kali replikasi sampel.Selanjutnya sampel ditambahkan
dengan 4 ml reagen biuret. Penambahan reagen biuret berfungsi agar dapat terjadi
perubahan warna pada sampel protein, yakni berubah warna menjadi ungu.
Setelah larutan biuret ditambahkan kedalam tabung, sampel dimasukkan kedalam
waterbath bersuhu 37C selama 10 menit, sehingga warnanya berubah dari biru
menjadi ungu. Perubahan ungu yang terjadi pada masing-masing tabung
disebabkan karena reagen biuret bereaksi dngan ikatan peptide yang ada pada
protein yaitu berikatan dengan gugus C=O dan NH, sehingga terbentuk
kompleks koordinasi antara Cu dengan alfa amino, dimana alfa amino
menggantikan posisi air, sehingga reagen biuret dapat digunakan sebagai indicator
adanya ikatan peptide, dan akan memberkan hasil positive dengan menunjukkan
warna ungu pada masing-masing tabung. Perubahan warna larutan yang terjadi
menandakan reaksi telah benar-benar sempurna terjadi, karena seperti yang kita
tahu inkubasi selama 10 menit tersebut fungsinya adalah untuk mempercepat
terjadinya reaksi reagen biuret dengan larutan standart maupun dengan larutan
sampel. Selanjutnya sampel diukur absorbansinya menggunakan spektrofotometer
UV- visible pada panjang gelombang 540 nm. Dan didapatkan hasil absorbansi
dan konsentrasi sebagai berikut :

SAMPEL
Sampel Konsentrasi Absorbansi
1 12.766 0.210
2 11.372 0.192
3 11.423 0.193

Dari data-data yang didapatkan di atas, dapat dihitung konsentrasi protein

yang terkandung dalam ikan mujair nila melalui persamaan y = ax + b yang
diperoleh dari kurva standar dan data absorbansi sampel ikan mujair nila.
Sehingga didapatkan kadar protein dalam sampel ikan mujair nila sebagai
berikut :

1. Sampel 1 ikan mujair nila :

y=0.0702 x0.0432
0.273=0.0702 x0.0432
x=4,5042

2. Sampel 2 ikan mujair nila :

y=0.0702 x0.0432
 0.235=0.0702 x0.0432

x= 3,9629

3. Sampel 3 ikan mujair nila :

y=0.0702 x0.0432

0.246=0.0702 x +0.0432

x=4,1197

Massa sampel telur ayam kampung : 10,068 gram = 1000,68 mg, maka :
1000,68 mg mg
=100,68
10 ml ml

Rata-rata konsentrasi sampel sampel ikan mujair nila dalam cuplikan 10 mL=
4,5042+3,9629+4,1197
=4,1956 mg/mL
3

Kadar protein dalam sampel ikan mujair nila =

4,1956 mg/mL
100 =4,71
mg
100,68
ml

Prinsip kerja penentuan kadar protein dengan biuret ini adalah reaksi
warna yang dihasilkan dari pembentukan senyawa kompleks antara ion Cu 2+ dan
ikatan peptida pada protein ikan mujair nila. Reaksi biuret bergantung pada
pembentukan suatu kompleks antara ion Cu2+ dan 4 atom N-peptida pada protein
dalam suasana basa.Warna yang dihasilkan pada sampel itulah yang akan diserap
oleh sinar UV pada panjang gelombang maksimum 540 nm, sehingga
menghasilkan data absorbansi dan konsentrasi. Semakin pekat warna sampel yang
artinya semakin tinggi kandungan protein pada sampel, maka data absorbansi
yang dihasilkan juga akan semakin tinggi. Karena kepekatan warna pada sampel
akan berpengaruh terhadap penyerapan yang dilakukan oleh sinar UV. Melalui
data tersebut, maka akan dapat diketahui berapa kadar protein yang terkandung
dalam sampel ikan mujair nila. Penentuan kadar protein dapat dilakukan dengan
 metode yang lain. Namun metode ini menitik beratkan pada reaksi pembentukan
kompleks antara reagen dan sampel. Sedangkan pada metode yang lain, mungkin
saja protein pada sampel tak bereaksi sempurna dengan reagen yang lain.
Sehingga metode ini dipilih atau dianggap sebagai metode yang lebih mudah dan
efisien.

IX. DISKUSI
Pada percobaan yang telah dilakukan diperoleh nilai persentase dari ikan
mujair nila sebesar 4,71% hal ini tidak sesuai dengan teoritis yang ada yaitu
sebesar 43,76%. Hal yang menyebabkan ketidaksesuaian dengan teoritis
antara lain pada saat pengambilan sampel, sampel yang digunakan terlalu
sedikit sehingga mempengaruhi pada larutan sampel yang akan diuji.
Kemudian dapat juga dikarenan oleh faktor pengenceran. Pengenceran pada
sampel protein keju ini yaitu berfungsi agar larutan sampel yang digunakan
tidak terlalu pekat shingga dilakukan pengenceran 20x dan larutan menjadi
tidak berwarna. Fungsi dari pengenceran ini yaitu untuk menanbahakan
konsentrasi pada sampe yang digunakan. Kemudian dapat juga dikarenakan
suhunya yang terlalu ekstrem pada waktu penyimpanan, karena penyimpanan
dilakukan di dalam lemari pendingin, dan ikan mujair tidak terlalu segar,
karena waktu pembelian ikan H-2 sebelum diuji. Kemudian praktikan
melakukan kurang telitinya dalam volume sampel sehingga ini semua dapat
mempengaruhi hasil kadar protein ikan mujair nila tidak sesuai dengan
teoritis.

X. KESIMPULAN
Berdasarkan percobaan yang telah dilakukan, tentang penentuan kadar
protein dengan metode biuret diketahui nilai absorbansi pada larutan standar
protein dengan berbagaikonsentrasi maka akan diperoleh persamaan kurva

standar y=0.0702 x0.0432 dengan nilai regresi linear R = 0,9847.

Sedangkan pada sampel diperoleh nilai absorbansi sebesar 0,273, 0,235,
0,246 Sehingga diperoleh konsentrasi rata-rata sampel ikan mujair nila
sebesar 4,1956 mg/mL, dan kadar protein pada ikan mujair nila sebesar
 4,71% Adanya kandungan protein pada percobaan ini dapat ditandai dengan
terbentuknya warna larutan dari biru sampai ungu.

XI. JAWABAN PERTANYAAN

1. Buatlah kurva standar konsentrasi vs absorbansi. Dengan bantuan kurva
standar tersebut tentukan kadar protein sampel!
STANDAR
Konsentrasi Absorbansi
1 0.026
2 0.096
3 0.182
4 0.216
5 0.317

SAMPEL
Sampel Konsentrasi Absorbansi
1 4,5042 0.273
2 3,9629 0.235
3 4,1197 0.246

WL 540,0
0.35
0.3
f(x) = 0.07x - 0.04
0.25 R = 0.98
0.2
WL 540,0
Axis Title 0.15
Linear (WL 540,0)
0.1
0.05
0
0 1 2 3 4 5 6

Axis Title

Sampel 1 ikan mujair nila :

 y=0.0702 x0.0432
0.273=0.0702 x0.0432
x=4,5042

Sampel 2 ikan mujair nila :

y=0.0702 x0.0432

0.235=0.0702 x0.0432

x= 3,9629

Sampel 3 ikan mujair nila :

y=0.0702 x0.0432

0.246=0.0702 x +0.0432

x=4,1197

Massa sampel telur ayam kampung : 10,068 gram = 1000,68 mg, maka :
1000,68 mg mg
=100,68
10 ml ml

Rata-rata konsentrasi sampel sampel ikan mujair nila dalam cuplikan 10 mL=
4,5042+3,9629+4,1197
=4,1956 mg/mL
3

Kadar protein dalam sampel ikan mujair nila =

4,1956 mg/mL
100 =4,71
mg
100,68
ml

2. Apakah peptide akan memberikan reaksi positif terhadap reaksi biuret?

Jika benar demikian, bagaimana menentukan kadar protein yang
tercampur dengan peptide?
Ya, karena Biuret merupakan salah satu cara yang terbaik untuk
menentukan kadar protein suatu larutan. Dalam larutan basa, Cu 2+akan
membentuk kompleks dengan ikatan peptida suatu protein, sehingga
 menghasilkan warna ungu yang dapat diidentifikasi dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm. Absorbansi ini
berbanding langsung dengan kosentrasi protein dan tidak tergantung jenis
protein karena seluruh protein pada dasarnya mempunyai jumlah ikatan
peptida yang sama persatuan berat.

DAFTAR PUSTAKA

Lehninger.A.L, 1995.Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga, Jakarta

Anna Poedjiadi, 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Penerbit UI-Press: Jakarta.
Djaeni, Achmad. 2008. Ilmu Gizi. Jakarta : PT. Dian Rakyat. Hal 53-65
Harris, Robert. 2009. Evaluasi Gizi Pada Pengolahan Bahan Pangan. Bandung :
Penerbit ITB. Hal 20-22
Sudarmaji, S, dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit
Liberty: Yogyakarta.

Winarno, F.G. 1991. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Penerbit Gramedia. Hal 61-
62
LAMPIRAN 1
PERHITUNGAN

Pengenceran larutan standar dengan labu ukur 10 mL

1. V1M1 = V2M2
10 mg/mL . V1 = 5 mg/mL . 10 mL
V1 = 5 mL
2. V1M1 = V2M2
4 mg/mL . V1 = 5 mg/mL . 10 mL
V1 = 8 mL

3. V1M1 = V2M2
4 mg/mL . V1 = 3 mg/mL . 10 mL
V1 = 7,5 mL
4. V1M1 = V2M2
3 mg/mL . V1 = 2 mg/mL . 10 mL
V1 = 6,67 mL
5. V1M1 = V2M2
2 mg/mL . V1 = 1 mg/mL . 10 mL
V1 = 5 mL

Perhitungan konsentrasi sampel dari kurva standar absorbansi vs konsentrasi

STANDAR
Konsentrasi Absorbansi
1 0.026
2 0.096
3 0.182
4 0.216
5 0.317

SAMPEL
Sampel Konsentrasi Absorbansi
1 4,5042 0.273
2 3,9629 0.235
3 4,1197 0.246
 WL 540,0
0.35
0.3
f(x) = 0.07x - 0.04
0.25 R = 0.98
0.2
WL 540,0
Axis Title 0.15
Linear (WL 540,0)
0.1
0.05
0
0 1 2 3 4 5 6

Axis Title

Sampel 1 ikan mujair nila :

y=0.0702 x0.0432
0.273=0.0702 x0.0432
x=4,5042

Sampel 2 ikan mujair nila :

y=0.0702 x0.0432

0.235=0.0702 x0.0432

x= 3,9629

Sampel 3 ikan mujair nila :

y=0.0702 x0.0432

0.246=0.0702 x +0.0432

x=4,1197

Massa sampel telur ayam kampung : 10,068 gram = 1000,68 mg, maka :
1000,68 mg mg
=100,68
10 ml ml

Rata-rata konsentrasi sampel sampel ikan mujair nila dalam cuplikan 10 mL=
 4,5042+3,9629+4,1197
=4,1956 mg/mL
3

4,1956 mg/ mL
100 =4,71
Kadar protein dalam sampel ikan mujair nila = mg
100,68
ml
LAMPIRAN 2