TP-75 ISBN : 978-979-16456-0-7

Isolasi Protein Antioksidan Dari Biji Melinjo

(Gnetum gnemon L.)

Tri Agus Siswoyo, Madios Aldino, Wahdyah Ningsih,

Purnama Okviandari

Pusat Penelitian Biologi Molekul dan Jurusan Agronomi, Fakultas Pertanian,

Universitas Jember

ABSTRAK

Purifikasi protein antioksidan dilakukan dengan menggunakan kombinasi

kolom kromatograpi seperti CM cellulose dan DEAE-Cellulose. Aktivitas protein
antioksidan dan free radical-scavenging ditentukan secara in vitro dengan
menggunakan metode penghambatan autooksidasi linoleic acid, efek scavenging
dengan menggunakan ,-diphenyl--picrylhydrazyl free radical, reducing power,
dan kemampuan mengikat ion Fe2+ dan Cu2+. Dua faksi protein hasil isolasi
menunjukkan kemampuan antioksidan, dimana protein dengan berat molekul
sekitar 30 kD mempunyai aktivitas antioksidan tertinggi dibandingkan dengan
protein satunya yang mempunyai berat molekul sekitar 12 kD. Aktivitas
antioksidan akan mengalami peningkatan seiring dengan meningkatnya
kosentrasi protein yang ditambahkan. Protein isolat menunjukkan kemampuan
yang sama dengan BHT pada pengujian menggunakan metode penghambatan
autooksidasi linoleic acid. Lebih lanjut, dua protein fraksi juga menunjukan
kemampuan dalam mengikat ion Fe2+ dan Cu2+. Dari data yang diperoleh dapat
disimpulkan bahwa protein storage biji melinjo mempunyai potensi sebagai
sumber antioksidan alami.

Kata kunci : Protein, antioksidan, Mlinjo, Radical-scavenging

PENDAHULUAN

Antiradikal bebas atau antioksidan adalah senyawa yang dalam jumlah

kecil dibanding substrat mampu menunda atau menjaga terjadinya oksidasi dari
substrat yang mudah teroksidasi (Halliwell et al, 1987).Antioksidan sangat
bermanfaat bagi kesehatan dan berperan penting untuk mempertahankan mutu
produk pangan. Berbagai kerusakan seperti ketengikan, perubahan nilai gizi,
perubahan warna dan aroma, serta kerusakan fisik lain pada produk pangan
karena oksidasi dapat dihambat oleh antioksidan ini. Berdasarkan sumbernya
antioksidan dibagi dalam dua kelompok, yaitu antioksidan sintetik dan

Seminar Nasional PATPI, Bandung 1718 Juli 2007 1045

Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi
untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
TP-75 ISBN : 978-979-16456-0-7

antioksidan alami. Antioksidan sintetik yang biasa digunakan secara luas adalah
BHA (Butil Hidroksi Anisol) dan BHT (Butil Hidroksi Toluen). Berdasarkan
penelitian yang telah dilakukan, diketahui bahwa BHA dapat menyebabkan
kanker dan penggunaan antioksidan ini perlu dipertimbangkan lagi karena
memiliki efek toksik (Toda et al 1984), sehingga mendorong penemuan obat
untuk penangkal radikal bebas dari sumber bahan alam, terutama tumbuhan.
Tanaman melinjo (Gnetum gnemon), banyak dibudidayakan di Indonesia,
Malaysia dan beberapa negara Asia Tenggara lainnya sebagai penghasil tepung
dari biji mlinjo. Di Indonesia, tanaman ini merupakan salah satu komoditas favorit
dimana bijinya dapat dimakan setelah dimasak dan dibuang kulitnya. Kandungan
protein biji melinjo (Gnetum gnemon) relative tinggi sekitar 9 - 11% sehingga
dapat dipertimbangkan sebagai sumber bahan protein fungsional dan
nutraceutical food supplement. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengkaji
potensi alami biji melinjo sebagai sumber alami protein antioksidan.

BAHAN DAN METODE

Bahan
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah : biji melinjo (Gnetum
gnemon) diperoleh dari sekitar daerah Jember dan Banyuwangi, Jawa Timur.
CM-celullose, DEAE-cellulose dan Sephadex G-25 dari Pharmacia, massa
molekul protein standar dari Daiichi Chemica, dan bahan kimia lain yang
digunakan merupakan analytical reagent grade.

Ekstraksi protein dari biji mlinjo

Isolasi protein antimikrobia dari biji mlinjo menggunakan buffer ekstraksi
50 mM MOPS-NaOH (pH 6.8), 0.5 M NaCl yang diikuti dengan sentrifugasi pada
kecepatan 10.000 rpm pada suhu 4oC selama 10 min. Setelah didapat
supernatan aktivitas antibakteri diujikan.

Purifikasi protein biji mlinjo

Purifikasi protein antimikrobial dilakukan dengan mengunakan presipitasi
amonium sulfate (0-30%) dan kombinasi kolom kromatagraphi (CM-Celullose dan

Seminar Nasional PATPI, Bandung 1718 Juli 2007 1046

Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi
untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
TP-75 ISBN : 978-979-16456-0-7

DEAE-Celulose). Evaluasi aktivitas dilakukan dengan menggunakan metode LA

(untuk aktifitasnya); Abs280 nm (protein) dan 15% SDS-PAGE.

Penentuan berat molekul polipeptida

Penentuan berat molekul peptida dilakukan dengan menggunakan gel
sodium dodesil sulfat poliakrilamida (SDS-PAGE) dengan konsentrasi gel
sebesar 15%. Estimasi berat molekul dilakukan dengan membandingkan pita
protein isolat dengan protein maker (myosin, -galactosidase, albumin, aldolase,
carbonic anhydrase dan myoglobin).

Karakter Gg-AOP.
Penentuan potensi aktivitas antioksidan dengan metode DPPH. Potensi
aktivitas antioksidan diukur dengan menggunakan metode DPPH-radical
scavenging berdasarkan jumlah donor hidrogen atau kemampuan radical
scavenging dari radikal berupa DPPH yang stabil (Yamaguchi et al, 1998; Gadow
et al, 1997). Emulsi model Linoleic Acid. Aktivitas antioksidan pada masing-
masing ekstraksi phenolik jaringan melinjo menggunakan ferric thiocyanate
methode (Mitsuda et al, 1966). Reducing power diukur berdasarkan metode yang
dijelaskan oleh Oyaizu (1988). Aktivitas chelating Cu2+ dan Fe2+ diukur
berdasarkan metode yang dilakukan oleh shimada (1992) dan Dinis et al.
(1994)

HASIL DAN PEMBAHASAN

Isolasi dan purifikasi protein antimikrobia

Hasil isolasi Gg-AMP dengan menggunakan metode presipitasi ammonium sulfat
(0-30%) dan kombinasi kolom kromatograpi (CM-cellulose dan DEAE-Cellulose).
Pada awal ekstraksi diperoleh jumlah protein sebesar 452,96 mg dan setelah
dilakukan presipitasi saturasi ammonium sulfate 0-30% jumlah protein yang
diperoleh yaitu 154 mg. Penurunan jumlah protein sebesar 66 % dari semula
menunjukkan adanya beberapa protein tertentu yang tidak terpresipitasi. Hal ini
dapat dimungkinkan karena adanya perbedaan sifat fungsional pada setiap
protein yang terkandung pada biji melinjo.

Seminar Nasional PATPI, Bandung 1718 Juli 2007 1047

Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi
untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
TP-75 ISBN : 978-979-16456-0-7

16 0,16

Fraction I Fraction II
14 0,14
280 nm

Antioxidant activity (500 nm)

12 NaCl 0,12
LA
Absorbance at 280 nm

10 0,1

8 0,08 1

6 0,06
NaCl (M)
4 0,04

2 0,02 0

0 0
0 50 100 150 200 250 300
Fraction number (2 ml/tube)
Gambar 1. Grafik pemurnian protein antimikrobial (Gg-AOP) yang berasal dari
biji mlinjo pada DEAE-selulose dengan elusi gradien 0 sampai 1 M
NaCl.

Proses presipitasi sebagian protein ini terjadi karena konfigurasi protein

yang berubah, menurut Salcedo-Chavez (2002) terjadinya presipitasi ini akibat
dari peningkatan interaksi elektrostatis antar molekul protein sehingga interaksi
protein dengan air mengalami penurunan. Isolasi dengan metode kombinasi
kolom kromatograpi lebih efektif untuk memperoleh Gg-AOP, secara kualitatif
hasil pemisahan dapat dilihat pada Gambar 1. Pada kolom kromatograpi jenis
DEAE-celulose yang merupakan kolom bermuatan negative dapat diperoleh
tingkat efisiensi yang cukup tinggi hal ini dapat terlihat dari hasil elektrogram 15%
SDS-PAGE dimana pada protein kasar terlihat beberapa pita protein dengan
berat molekul yang berbeda, akan tetapi setelah dilakukan isolasi terlihat satu
pita protein (Gambar 2). Hal ini sesuai dengan beberapa hasil penelitian
sebelumnya yang menyebutkan bahwa protein antimikrob rata-rata mempunyai
berat molekul yang relatif rendah atau sering disebut dengan Low Molecular
Weight dengan kisaran antara 10-30 kD (Marshall, 2003). Hasil aktivitas spesifik
isolat Gg-AOP yang diujikan pada B. cereus juga memperlihatkan peningkatan
sebesar 1.14 kali lebih besar dibandingkan dengan protein kasar dengan nilai
recovery sebesar 3.5 % (Tabel 1).

Seminar Nasional PATPI, Bandung 1718 Juli 2007 1048

Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi
untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
TP-75 ISBN : 978-979-16456-0-7

I II CP Mr

Gambar 2. Elektrograph hasil purifikasi protein antimikrobial biji mlinjo (Gg-

AMP) pada 12% SDS-PAGE Cp.: Protein kasar, Mr. Marker
protein, I. Fraksi I dan II. Fraksi II.

Karakter aktivitas Protein antioksidan.

Stabilitas free radikal pada DPPH dapat terlihat secara maksimal pada
panjang gelombang A517 pada larutan ethanol. Penurun DPPH sebagai donor
proton pada subsrat yang radical dapat ditandai dengan penurunan
absobansinya (Shimada et al., 1992). Dasar prinsip tersebut digunakan sebagai
dasar untuk dapat menggunakan DPPH sebagai senyawa untuk mengukur
kemampuan aktivitas antioksidan. Pada penelitian ini kemampuan scavenging
dari kedua fraksi yang diperoleh. Pada Gambar 3 menunjukkan hasil bahwa
kemampuan aktivitas scavenging dari fraksi I kemampuan yang tinggi
dibandingkan dengan fraksi II, prosentase aktivitas fraksi I dapat disamakan
dengan kemampuan dari BHT.

50
DPPH radikal (%)

40

30

20

10

0
BHT Fraction I Fraction II

Gambar 3. Aktivitas DPPH radical scaveging protein Gg-AOP dari biji melinjo.

Seminar Nasional PATPI, Bandung 1718 Juli 2007 1049

Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi
untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
TP-75 ISBN : 978-979-16456-0-7

Aktivitas antioksidan dari dua fraksi diiuji dengan menggunakan model

emulsi linoleic acid. Prinsip pengujian aktivitas antioksidan dengan metode ini
adalah kemampuan proteksi antioksidan yang diuji terhadap oksidasi oleh air
yang jenuh dengan oksigen dan pemanasan (Hanny et al., 2003). Induksi
oksidasi terjadi setelah hari ke 3 sampai 8 ini terlihat pada kontrol, tapi berbeda
dengan fraksi I dan II serta pada BHT sebgai positif kontrol, ketiganya tidak
menujukkan perubahan yang berarti dibandingkan dengan kontrol (Gambar 4).
Lamanya proses terjadinya oksidasi ini menunjukkan indikasi akan kemampuan
dari kedua fraksi sebagai antioksidan yang potensial. Protein fraksi (I dan II)
kemungkinan juga mengandung elektron donor yang dapat bereaksi dengan
radikal bebas dan dapat meng konver produk menjadi stabil dan reaksi rantai
radikal berhenti.

3,00

Crude Protein BHT

2,50 Control Fraction I
Fraction II
Absobansi (A500)

2,00

1,50

1,00

0,50

0,00
0 1 2 3 4 5 6 7 8

Lama inkubasi (hari)

Gambar 4. Aktivitas penghambatan Lipid peroxidation protein Gg-AOP dari
biji melinjo (Gnetum gnemon). Aktivitas diukur berdasarkan jumlah
linoleic acid yang teroksidasi selama 8 hari. Butylated
hydroxytoluene (BHT) digunakan sebagai positive control.

Reducing power diukur pada panjang gelombang A700 dan kemampuan dari
kedua praksi hasil isolasi dari biji melinjo dapat terlihat pada Tabel 1. Dari hasil
tersebut menunjukkan bahwa protein hasil isolasi mempunyai kemampuan
meredukasi produk begitu pula dari Tabel 1 menunjukkan kemampuan dalam
mengkelat atau mengikat ion Cu2+ dan Fe2.

Seminar Nasional PATPI, Bandung 1718 Juli 2007 1050

Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi
untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
TP-75 ISBN : 978-979-16456-0-7

Table 1. Kemampuan chelating ion copper dan ferros dan reducing power dari
protein Gg-AOP.

Chelating (%) Reducing power

2+
Cu Fe2+ (A700)
Fraction I 74.69 53.70 0.465
Fraction II 28.88 43.60 0.479

KESIMPULAN

Dua faksi protein hasil isolasi menunjukkan kemampuan antioksidan,

dimana protein dengan berat molekul sekitar 30 kD mempunyai aktivitas
antioksidan tertinggi dibandingkan dengan protein satunya yang mempunyai
berat molekul sekitar 12 kD. Aktivitas antioksidan akan mengalami peningkatan
seiring dengan meningkatnya kosentrasi protein yang ditambahkan. Protein isolat
menunjukkan kemampuan yang sama dengan BHT pada pengujian
menggunakan metode penghambatan autooksidasi linoleic acid. Lebih lanjut,
dua protein fraksi juga menunjukan kemampuan dalam mengikat ion Fe2+. Dari
data yang diperoleh dapat disimpulkan bahwa protein storage biji melinjo
mempunyai potensi sebagai sumber antioksidan alami.

DAFTAR PUSTAKA

Dinis, T. C. P., Madeira, V. M. C. and Almeida, L. M. (1994) Action of phenolic

derivatives (acetaminophen, salicylate, and 5-aminosalicylate) as
inhibitors of membrane lipid peroxidation and as peroxyl radical
scavengers. Arch. Biochem. Biophys. 315: 161-169.

Halliwell B, Gutteridge J.M.C, and Aruoma O.I. (1987) The deoxyribose method:
a simple test tube assay for determination of rate constants for reactions
of hydroxyl radicals. Anal Biochem. 165:2159.

Marshall, S. H. (2003) Antimicrobial Peptides: A Natural Alternative To Chemical

Antibiotics And a Potential For Applied Biotechnology. Electronic Journal
of Biotechnology. 6: 271-284.

Mitsuda, H., Yasumoto, K. and Iwami, K. (1966) Antioxidative action of indole

compounds during the autoxidation of linoleic acid. Eiyoto Shokuryo 19:
210-214.

Seminar Nasional PATPI, Bandung 1718 Juli 2007 1051

Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi
untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional
TP-75 ISBN : 978-979-16456-0-7

Oyaizu, M. (1988) Antioxidative activities of browning products of glucosamine

fractionated by organic solvent and thin-layer chromatography. Nippon
Shokuhin Kogyo Gakkaishi. 35: 771-775.
Salcedo-chavez, B., Osuna-castro J. A., Guevara-Lara, F. Dominguez-
dominguez, J. and Paredes-Lopez O. (2002) Optimization of the
Isoelectric Precipitation Method To Obtain Protein Isolates from Amaranth
(Amaranthus cruentus) Seeds. J. Agric. Food Chem. 50: 6515-6520.

Shimada, K., Fujikawa, K., Yahara, K. and Nakamura, T. (1992) Antioxidative

properties of xanthan on the antioxidation of soybean oil in cyclodextrin
emulsion. J. Agric. Food Chem. 40: 945-948.

Seminar Nasional PATPI, Bandung 1718 Juli 2007 1052

Meningkatkan Daya Saing Produk Pangan Lokal melalui Ilmu dan Teknologi
untuk Menunjang Ketahanan Pangan Nasional