LAPORAN PRAKTIKUM ENZIMOLOGI

Isolasi Enzim Laktat Dehidrogenase Dari Hati Ayam

Kunto Wibisono 3425111414

Aditya Ahkami 3425111416

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS NEGERI JAKARTA

2013

1
Tujuan Praktikum

- Mengetahui dan mempelajari cara dan langkah-langkah dalam mengisolasi

enzim laktat dehidrogenase dari hati ayam
- Menganalisis setiap reaksi yang terjadi pada proses isolasi dan pemurnian
enzim laktat dehidrogenase
- Mengetahui bahan dan alat yang digunakan untuk mengisolasi enzim laktat
dehidrogenase
- Mengetahui dan mempelajari pemakaian alat yang digunakan dalam
mengisolasi enzim laktat dehidrogenase
- Menganalisis kurva standar dan cara penentuan kadar enzim dengan teknik
spektrofotometri

Tinjauan Pustaka

Kata enzim diperkenalkan pertama kali oleh Kuhne pada tahun 1878 untuk
suatu zat yang bekerja pada suatu substrat. Enzim adalah protein yang diproduksi
dari sel hidup dan digunakan untuk mengkatalisis reaksi kimia yang spesifik.
Enzim merupakan biokatalisator, memiliki tenaga katalitik yang luar biasa dan
biasanya lebih besar dari katalisator sintetik. Spesifitas enzim sangat tinggi
terhadap substratnya. Tanpa pembentukan produk samping enzim merupakan unit
fungsional untuk metabolisme dalam sel, bekerja menurut urutan yang teratur.
Enzim berperan sangat penting dalam aktivitas biologis. Dalam jumlah yang
sangat kecil, enzim dapat mengatur reaksi tertentu. Enzim bekerja secara spesifik
karena hanya bekerja pada substratnya (Amri, 2012).
Laktat dehidrogenase (LDH) merupakan enzim yang dapat digunakan untuk
menguji keragaman genetik (Sofro, 1993). Enzim ini berperan dalam
mengkatalisis substrat yang akan digunakan sebagai prazat (prekursor)
pembentukan hormon glikoprotein. Konsentrasi enzim ini sangat penting
mengingat proses deglikosilasi elepasan karbohidrat)dari hormon glikoprotein
menyebabkan penurunan konsentrasi hormon (Swedlow et al., 1996). Jika protein
isozim yang dianalisis antar individu tidak bervariasi, maka gen yang
mengendalikan protein tersebut tidak bervariasi atau sebaliknya (Singer dan Bug,
1991).

2
 Pada keadaan hipoksia produksi asam laktat juga meningkat, oleh karena
itu asam laktat seringdigunakan sebagai maker hipoksia. Asam laktat berasal dari
piruvat yang dikatalisis oleh enzim laktatdehidrogenase (LDH). Glikolisis yang
berlangsung didalam eritrosit, sekalipun dalam keadaan aerob, selalu berakhir dengan senyawa
laktat karena mitokondria yang mengandungmesin enzimatik untuk oksidasi aerob piruvat tidak
ada.

Enzim laktat dehidrogenase (LDH) juga berperan penting dalam metabolisme

laktat. Enzim LDH mengkatalisis reaksi irreversibel piruvat menjadi laktat. Enzim
LDH merupakan tetramer yangterdiri dari dua jenis subunit 35-kd yang disandi
oleh gen yang mirip: jenis H lebih menonjol di jantung,sedangkan homolognya
yaitu jenis M, di otot rangka dan di hati. Jenis enzim LDH mungkin berbeda pada
keadaan aerob dengan keadaan anaerob.

Aktivitas LDH total dalam serum diperkirakan meningkat pada hampir semua
keadaan penyakit yang mengalami kerusakan atau destruksi sel. Selain itu,
aktivitas LDH total juga merupakan indikator yang relatif sensitiv yang
menunjukkan sedang berlangsungnya proses patologik. Peningkatan LDH total
dan rasio LDH1/LDH2 dengan kadar tertinggi LDH1 bermanfaat untuk
memastikan diagnosis infark miokardium (MCI). Kadar LDH meningkat dalam
waktu 12-24 jam setelah terjadinya MCI, mencapai puncaknya dalam 2-5 hari dan
tetap tinggi hingga 6-12 hari, lalu akan menjadi normal kembali dalam waktu 8-14
hari.

Metode yang dapat dilakukan untuk mendapatkan enzim dari sel hidup adalah
dengan mengisolasi enzim. Secara umum, tahapan yang dilakukan dalam
memperoleh enzim ada 4 tahap yaitu (Lopes, 2007):
1. Ekstraksi enzim, merupakan metode pemisahan satu atau lebih
komponen dari suatu campuran menggunakan pelarut (solven) sebagai
separating agent. Pemisahan terjadi atas dasar kemampuan larut yang
berbeda dari komponen-komponen dalam campuran. Proses tersebut harus
memperhatikan letak enzim di dalam sel, apakah enzim tersebut tergolong
enzim soluble / dapat larut atau enzim yang terikat membran. Ekstraksi
enzim dilakukan dengan memecah sel dan merusak membran secara

3
 mekanik dengan pemanasan atau penghancuran menggunakan
homogenizer dan secara kimia dengan detergen (Triton-X-100, SDS), n-
Butanol atau enzim lisozim.
2. Isolasi enzim, merupakan serangkaian proses yang dilakukan untuk
memisahkan enzim dari komponen sel dan protein-protein lainnya. Proses
ini dilakukan dengan mengendapan protein melaui penambahan filtrat
dengan pelarut organik seperti aseton, etanol, isopropanol atau diendapkan
menggunakan garam seperti amonium sulfat, natrium sulfat, sodium sulfat
3. Purifikasi enzim, merupakan tahapan untuk mendapatkan enzim yang
murni dengan menghilangkan molekul-molekul garam hasil pengendapan

Metode-Metode yang Digunakan untuk Proses Purifikasi Enzim

4. Karakterisasi enzim.
Karakterisasi enzim meliputi :
a. Penentuan aktivitas enzim, dapat dilakukan dengan mengukur
kecepatan reaksi yang dikatalitis oleh enzim tersebut. Dalam keadaan
normal, kecepatan reaksi yang diukur sesuai dengan aktivitas enzim
yang ada. Satu unit aktivitas enzim didefinisikan sebagai jumlah enzim
yang menyebabkan perubahan absorban 0,001/menit pada kondisi
optimumnya, berarti perubahan substrat dari suatu mikromalekul
produk meningkatkan kenaikan absorban sebesar 0,001.
b. Penentuan waktu inkubasi optimum dilakukan pada suhu 37 C dan
rentang waktu 10 s.d. 50 menit.

4
 c. Penentuan suhu optimum dilakukan pada waktu inkubasi optimum
yang telah didapatkan dari prosedur sebelumnya dan pada rentang
suhu 30 C s.d. 70 C. Waktu dan suhu optimum tersebut akan
digunakan untuk uji aktivitas setelah dilakukan pengendapan enzim.

5. Uji Aktivitas Enzim, meliputi uji aktivitas enzim pada berbagai substrat
dengan berbagai konsentasi pada suhu dan waktu optimum.

Metodologi
1. Tempat Praktikum
Laboratorium Genetika Molekular dan Biokimia Universitas Negeri
Jakarta
2. Waktu Praktikum
Mei 2014 Juni 2014
3. Alat dan Bahan yang Digunakan
Alat - Alat filtrasi Gel Sephadex
- Gelas beaker
- Gelas ukur
- Batang pengaduk
Bahan
- Timbangan
- Tabung falcon - Ammonium sulfat
- Tabung mikro (Microtube) - PBS pH 7
- Pipet mikro - Kulit pepaya muda
- Sentrifuge - Alumunium foil
- Pemanas - Plastik selofan dan penjepit
- Spektrofotometri
selofan
- Mortar

5
4. Cara Kerja
a. Ekstraksi Enzim

b. Isolasi Enzim

c. Purifikasi Enzim
Hasil dan Pembahasan

Tujuan dari praktikum ini adalah mengisolasi enzim laktat dehidrogenase

(LDH) dari hati ayam. Laktat dehidrogenase (LDH) adalah enzim intraseluler yang
terdapat pada hampir semua sel yang bermetabolisme, dengan konsentrasi tertinggi
dijumpai di jantung, otot rangka, hati, ginjal,otak, dan sel darah merah. Oleh karena
itu enzim LDH diisolasi dari hati ayam yang masih segar.

Tahapan pertama untuk mendapatkan enzim LDH adalah mengekstraksi enzim

LDH dari hati ayam. Ekstraksi enzim dilakukan dengan memisahkan satu atau lebih
komponen dari suatu campuran menggunakan pelarut (solven) sebagai separating
agent. Pemisahan terjadi atas dasar kemampuan larut yang berbeda dari komponen-
komponen dalam campuran. Enzim LDH termasuk enzim yang tergolong enzim
soluble / dapat larut sehingga proses ekstraksi enzim LDH dilakukan dengan
memecah sel dan merusak membran hati ayam secara mekanik dengan
menggunakan homogenizer yaitu dengan ditumbuk dengan mortar dan alu sampai
halus. Fungsi dari homogenizer adalah untuk memecah membran sel dan
mengeluarkan enzim dari sel.
Enzim yang telah keluar dari sel diisolasi untuk memisahkan enzim dari
komponen sel dan protein-protein lainnya. Proses ini dilakukan dengan
mengendapan protein melaui penambahan filtrat dengan pelarut organik seperti
aseton, etanol, isopropanol atau diendapkan menggunakan garam seperti amonium
sulfat, natrium sulfat, sodium sulfat. Pada praktikum ini, proses isolasi enzim
dilakukan dengan menggunakan garam amonium sulfat. Penggunaan garam lebih
efektif dibandingkan dengan pelarut organik. Hal tersebut karena, pelarut organik
dapat menurunkan konstanta dielektrik, pelarut organik kurang sesuai dengan
permukaan enzim yang polar, menyebabkan kemungkinan terjadinya inaktivasi
enzim, memperbesar kemungkinan denaturasi terutama pada suhu tinggi, pelarut
organik mudah terbakar, dan harganya mahal. Sedangkan keuntungan menggunakan
garam yaitu, pada konsentrasi rendah ion-ion garam melingkungi molekul protein
dan mencegah bersatunya molekul protein sehingga protein melarut, dan pada
konsentrasi tinggi, terjadi peningkatan muatan listrik di sekitar protein yang akan
menarik mantel air dari koloid protein. Interaksi hidrofobik diantara sesama molekul
protein pada suasana ionik akan menurunkan kelarutan protein. Selain itu harga
garam lebih murah dibandingkan pelarut organik.
Larutan selanjutnya disentrifuge untuk memisahkan enzim dengan komponen
sel lainnya yang telah mengendap bersama ammonium sulfat. Supernatan hasil
sentrifugasi mengandung enzim. Akan tetapi, pada larutan tersebut, tidak hanya
terdapat enzim saja, namun juga terdapat protein-protein non enzim. Untuk
mendapatkan enzim yang murni, enzim harus dipisahkan dari protein-protein non
enzim.
Purifikasi enzim merupakan tahapan untuk mendapatkan enzim yang murni
dengan cara memisahkan enzim dengan protein non enzim. Metode-metode yang
digunakan untuk proses purifikasi enzim bermacam-macam. Pada praktikum ini
proses Dialisis digunakan untuk mempurifikasi enzim. Dialisis merupakan proses
perpindahan molekul terlarut dari suatu campuran larutan yang terjadi akibat difusi
pada membran semi permeabel. Kantung yang digunakan pada proses dialisis adalah
kantung selofan yang memiliki membran yang semi permeabel. Larutan enzim
dimasukkan ke dalam plastik selofan dan dijepit kedua ujungnya dengan penjepit
selofan. Seanjutnya, selofan yang telah berisi larutan enzim di rendam dalam PBS
pH 7. Molekul-molekul non enzim akan keluar dari kantung melalui proses difusi
pada membran semi permeabel karena adanya perbedaan gradien konsentrasi.
Sementara itu enzim akan tertahan pada kantung selofan. Jumlah larutan sebelum
dan sesudah melakukan setiap rangkaian proses dicatat.

Setelah melalui proses dialisis, selanjutnya larutan dimasukkan ke dalam alat

filtrasi gel menggunakan Sephadex. Proses tersebut masih termasuk dalam proses
 purifikasi enzim. LDH yang telah dimurnikan dengan filtrasi gel menggunakan
Sephadex memiliki tingkat kemurnian yang lebih tinggi dari tahap sebelumnya.
Sephadex dapat digunakan untuk memisahkan enzim dari senyawa-senyawa lain
sebagai pengotor.
Prinsip dari teknik filtrasi gel (kromatografi filtrasi gel) adalah pemisahan
molekul berdasarkan perbedaan ukurannya. Sampel diteteskan pada bagian atas
kolom gel Sephadex yang berfungsi sebagai fase diam dan larutan buffer fosfat pH 7
yang berfungsi sebagai fase gerak. Sampel enzim yang memiliki bobot molekul
lebih besar dari pori-pori gel akan melewati ruang antar pori-pori sehingga akan
lebih dahulu keluar dari kolom sebaliknya yang berbobot molekul lebih kecil akan
masuk ke dalam pori-pori matriks sehingga akan keluar lebih lambat. Setelah proses
kolom berlangsung, eluen ditampung pada wadah. Eluen yang telah ditampung pada
wadah kemudian diukur kadar protein dengan teknik Spektrofotometri.
Kemurnian enzim diukur dengan teknik Spektrofotometri, alatnya disebut
Spektrofotometer. Spektrofotometri adalah teknik yang digunakan untuk
mementukan komposisi / konsentrasi / kadar suatu sampel larutan secara kuantitatif
yang didasarkan pada interkasi antara materi dan cahaya. Prinsip kerjanya yaitu
adanya interaksi antara materi dengan cahaya yang memiliki panjang gelombang
tertentu. Ketka cahaya polikromatis mengenai suatu zat, maka cahaya dengan
panjang gelombang tertentu saja yang dapat diserap oleh zat tersebut. Cahaya yang
diserap oleh zat diukur sebagai absorbansi.
Tabel 1. Hasil Absorbansi pada panjang gelombang 340 nm. Setiap
sampel berisi 0,1 ml larutan enzim dan ditambahkan 1,9 ml
aquades.

Tabung Absorbansi
1 0,003
2 0,010
3 0,025
4 0,020
Nilai Rata-Rata 0,0145
Perhitungan kadar enzim diperoleh dengan menggunakan kurva standar BSA.

Nilai rata-rata absorbansi hasil spektrofotometri selanjutnya dimasukkan ke dalam

persamaan kurva regresi linier yang diperoleh dari kurva standar BSA.
BSA (Bovine Serum Albumin) merupakan larutan standar protein yang dibuat

dengan menimbang 0,01 gram BSA yang dilarutkan ke dalam 10 ml H2O steril sehingga
diperoleh larutan stok BSA dengan konsentrasi 1000 ppm. Larutan stok dengan

konsentrasi 1000 ppm diencerkan dengan melarutkan 0,5 ml larutan stok

ditambahkan 4,5 ml H2O steril sehingga diperoleh larutan stok BSA 100 ppm. Larutan

stok tersebut diukur dengan konsentrasi 0, 50, 100, 150

pada panjang gelombang 595 nm. Dari absorbansi yang dihasilkan, dibuat kurva standar

dan regresi linear. Selanjutnya akan diperoleh persamaan

matematik untuk larutan standar.

Tabel 2. Hubungan konsentrasi BSA dengan absorbansi
Konsentrasi
BSA Absorbansi
0 0
50 0.071
100 0.126
150 0.153

Kurva Standar BSA

160 Konsentrasi BSA
150
140 R
f(x)==150x - 50 Linear (Konsentrasi
120 BSA)
100 100 Linear (Konsentrasi
80 BSA)
60 Absorbansi
50
40
20
0 01 2
0.07 3
0.13 4
0.15
1 2 3 4

Grafik 1. Kurva standar BSA

Perhitungan Kadar Enzim:
y = 50x - 50
0,0145 = 50x - 50
0.0145 + 50 = 50x
50,0145 = 50x
x = 1,00029
Jadi, besarnya kadar enzim yang berhasil diisolasi pada praktikum ini adalah :
1,00029 Unit (U) / 4,5 mililiter / 5 gram bahan.
 Adapun alasan didapatkan enzim yang sedikit. Karena pada saat
proses dialisis, masih banyak terdapat serat hati yang masuk
kedalam kuvet. Sehingga supernatan yang dihasilkan tidak murni.
Kesimpulan
- LDH adalah suatu zat (enzim) yang dapat diperoleh di jantung, otot rangka, hati,
ginjal,otak, dan sel darah merah. Pada praktikum ini enzim diperoleh dari hati ayam.
- Tahapan yang dilakukan dalam memperoleh enzim ada 4 tahap yaitu: ekstraksi
enzim, isolasi enzim, karakterisasi enzim, dan uji aktivitas enzim
- Ekstraksi enzim dilakukan dengan memecah sel dan merusak membran secara
mekanik dengan pemanasan atau penghancuran menggunakan homogenizer dan
secara kimia dengan detergen, n-Butanol atau enzim lisozim.
- Isolasi enzim dilakukan dengan mengendapan protein melaui penambahan filtrat
dengan pelarut organik atau menggunakan garam. Penggunaan garam lebih efektif
dibandingkan dengan pelarut organik.

Daftar Pustaka
Bergmeyer HU dan Grassl M, 1983. Method of Enzyme Analysis. vol. 2: Verlag
Chemie,Weinheim.
Darwis A Azis dan Sakara E, 1990. Isolasi, Pemurnian dan Karakterisasi Enzim.
IPB, Bogor.
DEUTCHER. M.P. 1990. Gude To Protein Purification. Methods In Enzymology.
Academic Press INC. San Diego, New York.
Lehninger Albert, 1993. Dasar-dasar Biokimia, Alih bahasa Meggy Thenawijaya
Penerbit Erlangga, Jakarta.
Wang, W., Sun, X. & Jin, W. 2003. Determination of lactate dehydrogenase in
human erythrocytes by capillary electrophoresis with electrochemical
detection. Journal of Chromatography B 798: 175178.