Anda di halaman 1dari 29

ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

SENYAWA FLAVONOID FRAKSI METANOL DAN FRAKSI ASETON


DAUN TANAMAN ADAM HAWA (Rhoeo discolor (L'Hr.) Hance)
DENGAN METODE 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH)

Proposal Skripsi

Diajukan oleh:

Deriven Samurai Teweng

NIM : 138114046

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016

1
Persetujuan Pembimbing

ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN


SENYAWA FLAVONOID FRAKSI METANOL DAN FRAKSI ASETON
DAUN TANAMAN ADAM HAWA (Rhoeo discolor (L'Hr.) Hance)
DENGAN METODE 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH)

Proposal skripsi yang diajukan oleh:

Deriven Samurai Teweng

NIM : 138114046

telah disetujui oleh

Pembimbing Utama

(Dr. Erna Tri Wulandari, Apt.) tanggal ......................................

2
DAFTAR ISI

Halaman Sampul.......................................................................................................i
Halaman Persetujuan Pembimbing..........................................................................ii
DAFTAR ISI...........................................................................................................iii
DAFTAR TABEL...................................................................................................iv
DAFTAR GAMBAR...............................................................................................v
RINGKASAN.........................................................................................................vi
BAB 1 PENDAHULUAN.......................................................................................1
1.1. Latar Belakang......................................................................................1
1.2. Rumusan Masalah.................................................................................2
1.3. Tujuan Penelitian..................................................................................2
1.4. Urgensi Penelitian.................................................................................2
1.5. Kontribusi Penelitian............................................................................3
1.6. Luaran yang Diharapkan.......................................................................3
1.5. Manfaat Penelitian................................................................................3
BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA..............................................................................4
2.1. Tanaman Adam Hawa...........................................................................4
2.2. Senyawa Flavonoid...............................................................................5
2.3. Ekstraksi................................................................................................7
2.4. Fraksinasi..............................................................................................8
2.5. Isolasi....................................................................................................8
2.6. Radikal Bebas.......................................................................................8
2.7. Antioksidan...........................................................................................9
2.8. Metode Uji Aktivitas Antioksidan........................................................9
2.9. Spektrofotometri UV-Vis....................................................................10
2.10. Landasan Teori..................................................................................11
2.11. Hipotesis ...........................................................................................12
BAB 3 METODE PENELITIAN...........................................................................13
3.1. Jenis Rancangan Penelitian.................................................................13
3.2. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional.....................................13
3.3. Bahan Penelitian..................................................................................14
3.4. Alat Penelitian.....................................................................................14
3.5. Tata Cara Penelitian............................................................................14
3.6. Tata Cara Analisis...............................................................................17
3.7. Jadwal Kegiatan..................................................................................20
DAFTAR PUSTAKA............................................................................................21

3
DAFTAR TABEL

Tabel I. Tingkat Kekuatan Antioksidan dengan Metode DPPH............................10


Tabel II. Rentang Serapan Spektrum UV-Vis Senyawa Flavonoid......................11
Tabel III. Penafsiran Spektrum Senyawa Flavonoid dalam NaOMe/NaOH.........18
Tabel IV. Penafsiran Spektrum Senyawa Flavonoid dalam NaOAc.....................18
Tabel V. Penafsiran Spektrum Senyawa Flavonoid dalam NaOAc/H3BO3..........18
Tabel VI.Penafsiran Spektrum Senyawa Flavonoid dalam AlCl3 dan AlCl3/HCl.19
Tabel VII. Jadwal Kegiatan Tahun 2016................................................................20

4
DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Tanaman Adam Hawa............................................................................4


Gambar 2. Struktur Antosianidin.............................................................................5
Gambar 3. Struktur Penomoran Flavonoid..............................................................6
Gambar 4. Reaksi DPPH dan Antioksidan..............................................................9

5
RINGKASAN

Tanaman adam hawa (Rhoeo discolor (L'Hr.) Hance) merupakan tanaman hias
yang memiliki khasiat dalam pengobatan terkait antibakteri dan antiksidan. Daun
tanaman adam hawa yang berwarna ungu terdapat senyawa flavonoid dan
antosianin. Penelitian sebelumnya mengidentifikasi senyawa flavonoid dalam
ekstrak etanol 96% dan uji aktivitas antioksidan dalam ekstrak metanol 70% daun
tanaman adam hawa. Namun penelitian hingga tahap fraksinasi pada ekstrak daun
tanaman adam belum pernah dilakukan.
Penelitian ini bertujuan mengetahui aktivitas antioksidan dinyatakan dengan
nilai IC50 dan jenis flavonoid pada fraksi metanol dan fraksi aseton pada ekstrak
etanol 96% daun tanaman adam hawa. Jenis penelitian ini adalah eksperimental
murni. Ekstraksi dilakukan dengan maserasi dan remaserasi menggunakan etanol
96% dan difraksinasi dengan metode dekantasi. Fraksi dilakukan uji aktivitas
antioksidan dilakukan dengan menggunakan metode DPPH dan hasilnya diolah
untuk mendapatkan harga IC50. Isolasi senyawa flavonoid dari fraksi dilakukan
dengan metode kromatografi lapis tipis preparatif (KLT preparatif) dengan fase
diam silika G 60 F254 dan fase gerak BAA 4:1:5 ( n-butanol : asam asetat : air ).
Identifikasi flavonoid dengan metode pereaksi geser dengan larutan pereaksi
seperti AlCl3 5%/HCl, NaOH dan NaOAc/H 3BO3 dengan menimbulkan efek
bathokromik (pergeseran panjang gelombang) menggunakan spektrofotometer
UV/Vis. Manfaat penelitian adalah diketahui nilai IC 50 dan jenis senyawa
flavonoid serta sebagai antioksidan alami dan pengembangan obat.

Kata Kunci : daun, tanaman adam hawa, rhoeo discolor (L'Hr.) Hance ,
flavonoid, antosianin, maserasi, enap tuang, isolasi, kromatografi lapis tipis
preparatif, metode DPPH, IC50.

6
1

BAB I
PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Perubahan yang terjadi pada kondisi lingkungan dan pola hidup


masyarakat, terutama pola makan dan kebiasaan buruk di kota-kota besar pada
negara berkembang seperti Indonesia menjadikan tubuh lebih mudah terkena
berbagai jenis penyakit, khususnya penyakit yang disebabkan oleh radikal
bebas. Radikal bebas dapat berasal dari dalam tubuh manusia sendiri maupun
dari lingkungan, oleh karena itu dengan pola hidup dan kondisi lingkungan
yang tidak sehat berpotensi terserangnya tubuh oleh radikal bebas semakin
besar.

Radikal bebas yang memiliki satu elektron tidak berpasangan ini


menyebabkan radikal bebas tersebut bersifat reaktif yang dapat melakukan
reaksi oksidasi patogenik terhadap sel atau komponennya, sehingga dapat
menyebabkan disfungsi atau mutasi yang berakibat pada timbulnya penyakit
degenertif seperti kanker, penyakit kardiovaskular, kerusakan hati dan penuaan
dini (Musaforah, 2015).

Senyawa yang dapat menstabilkan radikal bebas tersebut ialah senyawa


antioksidan dimana senyawa antioksidan dapat memberikan satu elektron
kepada senyawa radikal bebas sehingga radikal bebas tidak reaktif dan tidak
menimbulkan efek yang merugikan. Namun jumlah antioksidan di dalam tubuh
sangat terbatas sehingga dibutuhkan senyawa antioksidan dari luar tubuh
seperti vitamin C dan golongan-golongan senyawa fitokimia seperti flavonoid
dan fenolik.

Salah satu tanaman yang dapat digunakan masyarakat sebagai sumber


antioksidan ialah tanaman adam hawa (Rhoeo discolor (L'Hr.) Hance).
Tanaman adam hawa termasuk dalam famili Commelinaceae dan suku gawar-
gawaran yang berasal dari Meksiko dan Hindia Barat. Tanaman ini sering
ditanam sebagai tanaman hias karena daunnya yang berwarna keunguan dan
dikenal juga digunakan sebagai etnobotani untuk mengobati berbagai penyakit,
termasuk infeksi mukosa, penyakit kelamin, luka, gangguan pencernaan, dan
kanker, yang mungkin dikaitkan dengan antibakteri dan antioksidan (Tan et
al,2014).

Daun tanaman adam hawa yang berwarna ungu diduga karena adanya
senyawa flavanoid dan antosianin. Kandungan kimia dalam daun tanaman
adam hawa tersebut berdasarkan Lwin (2008) antara lain senyawa-senyawa
flavonoid, antosianin, saponin, karotenoid, lilin, terpenoid, kumarin dan
steroid. Senyawa flavanoid merupakan kelompok senyawa fenol terbesar yang
terdapat di alam dan zat warna merah, ungu, biru dan sebagian zat warna
kuning yang ditemukan pada tumbuh-tumbuhan salah satunya ialah antosianin.
2

Antosianin yang berwarna terdapat dalam daun dan bunga selalu disertai oleh
flavon atau flavonol tanpa warna (Harborne,1996).

Berdasarkan penelitian Tan et al. (2014), peneliti melakukan uji aktiivitas


antioksidan DPPH Free Radical Scavenging (FRS) Assay pada ekstrak metanol
70% daun tanaman adam hawa dengan spektrofotometer visibel diperoleh FRS
yaitu 177,3 15,3 (mg AA/ 100 g). Lalu, penelitian sebelumnya dilakukan
Sitorus et al. (2012), peneliti melakukan isolasi dengan KLT preparatif dan
identifikasi senyawa flavonoid menggunakan dengan metode pereaksi geser
pada ekstrak etanol 95% daun tanaman adam hawa serta senyawa flavonoid
yang diperoleh adalah antosianidin.

Antosianidin itu sendiri merupakan aglikon antosianin yang terbentuk bila


antosianin dihidrolisis dengan asam. Antosianidin yang paling umum dijumpai
ialah sianidin yang berwarna merah lembayung. Sifat fisika dan kimia dari
antosianidin dilihat dari kelarutan antosianin larut dalam pelarut seperti
metanol, etanol, aseton, atau kloroform. Antosianin stabil pada pH 3,5 dan
suhu dibawah 50C. Antosianin mempunyai panjang gelombang maksimum
515-545 nm, dengan eluen BAA (n-butanol-asam asetat-air) pada kromatografi
kertas (Harborne, 1996).

Senyawa-senyawa flavonoid dari tanaman adam hawa tersebut dapat disari


dengan metode penyarian atau ekstraksi. Namun ekstrak yang diperoleh masih
mengandung banyak senyawa didalamnya sehingga perlu dilakukan pemisahan
yang disebut fraksinasi agar memperoleh senyawa yang diinginkan. Fraksinasi
dilakukan dengan metode dekantasi dimana pemisahan dilakukan berdasarkan
densitas (Saifudin, 2014). Sehingga peneliti ingin melakukan hingga tahap
fraksinasi dengan menggunakan pelarut metanol dan aseton, kemudian
dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH serta isolasi dan
identifikasi senyawa flavonoid menggunakan metode pereaksi geser pada hasil
isolasi menggunakan spektrofotometer UV/Vis pada fraksi ekstrak daun
tanaman adam hawa tersebut.

1.2. Rumusan Masalah


a) Berapa nilai IC50 sebagai nilai aktivitas antioksidan fraksi metanol dan fraksi
aseton ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa dengan metode DPPH ?
b) Apa jenis senyawa flavonoid (antosianidin) pada fraksi metanol dan fraksi
aseton ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa ?

1.3. Tujuan Khusus


a) Mengetahui nilai IC50 fraksi metanol dan fraksi aseton ekstrak etanol 96% daun
tanaman adam hawa dengan metode DPPH.
b) Mengetahui jenis senyawa flavonoid pada fraksi metanol dan fraksi aseton
ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa.
3

1.4. Urgensi Penelitian


Penelitian ini berguna untuk pengembangan metode dengan melakukan uji
aktivitas antioksidan dan identifikasi senyawa flavonoid pada fraksi metanol dan
fraksi aseton ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa sehingga
menghasilkan nilai IC50 dan jenis senyawa flavonoid (antosianidin) yang berperan
sebagai antioksidan.

1.5. Kontribusi Penelitian


Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan
dalam bidang kefarmasian berkaitan dengan pengembangan obat herbal dari daun
tanaman adam hawa sebagai sumber antioksidan dan dapat sebagai acuan yang
digunakan untuk penelitian selanjutnya.

1.6. Luaran yang Diharapkan


Nilai IC50 efektif fraksi metanol dan fraksi aseton ekstrak etanol 96% daun
tanaman adam hawa dan jenis senyawa flavonoid (antosianidin) yang berperan
sebagai antioksidan.

1.7. Manfaat Penelitian


a) Manfaat teoritis dari penelitian ini adalah diketahuinya aktivitas antioksidan
yang berupa nilai IC50 dan jenis senyawa flavonoid dari fraksi metanol dan
fraksi aseton ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa.
b) Manfaat praktis dari penelitian ini apabila terbukti, masyarakat dapat
memanfaatkan daun tanaman adam hawa sebagai antioksidan alami dan bagi
formulator dapat diaplikasikan ke bentuk sediaan obat yang sesuai.
4

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tanaman Adam Hawa


Tanaman adam hawa biasa ditanam sebagai tanaman hias, tumbuh subur di
tanah yang lembab. Termasuk suku gawar-gawaran berasal dari Meksiko dan
Hindia Barat. Tinggi pohon hingga 40-60 cm, batang kasar, pendek, lurus tidak
bercabang. Daun lebar dan panjang, mudah patah, warna daun di permukaan atas
hijau dan di bagian bawah berwarna merah ungu (Padmaningrum, 2011). Panjang
daun kira-kira hingga 30-40 cm dan lebar hinga 4 -7,5 cm. Bunga berwarna putih
berbentuk bunga kerang. Kandungan kimia dalam daun tanaman adam hawa
adalah senyawa-senyawa flavonoid, antosianin, saponin, karotenoid, lilin,
terpenoid, kumarin dan steroid (Lwin, 2008).

Gambar 1. Tanaman Adam Hawa (Padmaningrum, 2011).

Kingdom : Plantae
Subkingdom : Tracheobionta
Divisi : Spermatophyta
Sub Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Liliopsida
Sub Kelas : Commelinidae
Ordo : Commelinale
Famili : Commelinaceae
Marga : Rhoeo (Tjitrosoepomo, 2013)
Spesies : Rhoeo discolor (L'Hr.) Hance
5

Sinonim : Rhoeo spathacea, Tradescantia discolor


(Global Biodiversity Information Facility, 2013)
Tanaman ini sering digunakan untuk etnobotani untuk mengobati banyak
penyakit, termasuk infeksi mukosa, penyakit kelamin, luka, gangguan pencernaan,
dan kanker, yang mungkin dikaitkan dengan antibakteri dan antioksidan (Tan et al,
2014).

2.2. Senyawa Flavonoid


Flavonoid adalah suatu kelompok senyawa fenol. Flavonoid terdapat dalam
semua tumbuhan sebagai campuran, jarang sekali ditemukan tunggal dalam
jaringan tumbuhan. Di samping itu, sering terdapat campuran yang terdiri atas
flavonoid yang berbeda kelas. Antosianin berwarna terdapat dalam daun dan
bunga selalu disertai oleh flavon atau flavonol tanpa warna (Harborne, 1996).
Antosianin adalah suatu kelas dari senyawa flavonoid, yang secara luas terbagi
dalam polifenol tumbuhan. Flavonol, flavan-3-ol, flavon, flavanon, dan
flavanonol adalah kelas tambahan flavonoid yang berbeda dalam oksidasi dari
antosianin. Secara kimia semua antosianin merupakan turunan suatu struktur
aromatik tunggal, yaitu sianidin, dan semuanya terbentuk dari pigmen sianidin ini
dengan penambahan atau pengurangan gugus hidroksil, metilasi dan glikosilasi
(Harborne, 1996).
Antosianin adalah senyawa yang bersifat amfoter, yaitu memiliki kemampuan
untuk bereaksi baik dengan asam maupun dalam basa. Dalam media asam
antosianin berwarna merah seperti halnya saat dalam vakuola sel dan berubah
menjadi ungu dan biru jika media bertambah basa. Perubahan warna karena
perubahan kondisi lingkungan ini tergantung dari gugus yang terikat pada struktur
dasar dari posisi ikatannya. Sifat fisika dan kimia dari antosianin dilihat dari
kelarutan antosianin larut dalam pelarut seperti metanol, aseton, atau kloroform,
terlebih sering dengan air dan diasamkan dengan asam klorida atau asam format.
Antosianin stabil pada pH 3,5, suhu dibawah 50C, sensitif terhadap cahaya,
mempunyai berat molekul 207,08 gram/mol dan rumus molekul C 15H11O.
Antosianin berwarna merah, merah senduduk, ungu dan biru mempunyai panjang
gelombang maksimum 515-545 nm, bergerak dengan eluen BAA (n-butanol-
asam asetat-air) pada kertas (Harborne, 1996).

Gambar 2. Struktur Antosianidin (Harborne, 1996).


6

Antosianidin adalah aglikon antosianin yang terbentuk bila antosianin


dihidrolisis dengan asam. Antosianidin yang paling umum sampai saat ini ialah
sianidin yang berwarna merah lembayung. Aglikon atau antosianidin bersifat
kurang stabil dibandingkan antosianin dan dalam jaringan tanaman berada sebagai
suatu glikosida dengan gugus glukosa pada posisi cincin 3 dan 3 dan 5.
Antosianidin terbagi menjadi 6 jenis antara lain pelargonidin, sianidin, peonidin,
delfinidin, petunidin dan malvidin (Harborne, 1996).
Golongan flavonoid dibedakan berdasarkan cincin heterosiklik-oksigen
tambahan dan gugus hidroksil yang tersebar menurut pola yang berlainan antara
lain antosianin, auron, kalkon, flavonol, flavon, flavononol, biflavonol, flavanol,
flavonon, flavononon dan isoflavon (Harborne, 1996). Flavonoid sering terdapat
sebagai glikosida. Golongan terbesar flavonoid berciri mempunyai cincin piran
yang menghubungkan rantai tiga karbon dengan salah satu dari cincin benzena.
Sistem penomoran untuk flavonoid dapat dilihat pada gambar di bawah ini :

Gambar 3. Penomoran flavonoid (Robinson, 1995).


Menurut Mabry et al (1970), berikut cara-cara identifikasi senyawa
flavonoid menggunakan pereaksi geser antara lain :

a. Efek hidroksilasi
Penambahan gugus OH pada cincin A menghasilkan pergeseran batokromik
pada pita serapan I atau pita serapan II pada spektra flavonoid. Apabila gugus
hidroksi tidak ada, panjang gelombang maksimal muncul pada panjang
gelombang lebih pendek jika dibandingkan dengan adanya gugus 5-OH
sedangkan substitusi gugus hidroksi pada posisi 3, 5, 4' mempunyai sedikit efek
atau tidak sama sekali pada spektra.

b. Efek metilasi dan glikosilasi


Metilasi dan glikosilasi terjadi pada pola serapan. Jika gugus 3, 5 atau 5'-OH
termetilasi atau terglikosilasi terjadi pergeseran hipsokromik, dapat dilihat pada
pita serapan I, pergeseran yang terjadi sebesar 12-17 nm. Dapat juga 22-25 nm
pada flavon yang tidak mempunyai gugus 5-OH.

c. Efek natrium asetat


Flavonoid yang mempunyai gugus 7-OH bebas menunjukkan pergeseran
batokromik sebesar 5-20 nm pada pita serapan II dengan adanya natrium asetat.
Natrium asetat hanya dapat mengionisasi khusus pada gugus 7-OH. Adanya
7

natrium asetat dan asam borat akan membentuk kompleks dengan gugus orto
dihidroksi pada semua posisi kecuali atom C5 dan C6. Flavonoid yang
mempunyai gugus orto dihidroksi pada cincin B menunjukkan pergeseran
batokromik pada serapan I sebesar 12-30 nm. Gugus orto dihidroksi pada cincin A
juga dapat dideteksi dengan efek natrium asetat dan asam borat. Adanya
pergeseran batokromik sebesar 5-10 nm pada pita I menunjukkan adanya gugus
orto dihidroksi pada C6 dan C7 atau C7 dan C8.

d. Efek natrium metoksida


Natrium metoksida pada flavonoid dalam metanol pada umumnya
menghasilkan pergeseran batokromik pada semua pita serapan. Walaupun
demikian, pergeseran batokromik yang besar pada serapan pita I sekitar 40-65 nm
tanpa penurunan intensitas, menunjukkan adanya gugus-gugus 4'-OH bebas, dan
flavonoid yang tidak mempunyai gugus 4'-OH bebas juga memberikan pergeseran
batokromik disebabkan adanya gugus 3-OH. Jika suatu flavonoid mempunyai 3
dan 4'-OH bebas, maka spektranya dengan natrium metoksida akan mengalami
dekomposisi. Pereaksi pengganti natrium metoksida yang cocok ialah larutan
NaOH 2M dalam air.

e. Efek AlCl3
Gugus OH pada C3 dan C5 pada flavonoid akan membentuk kompleks yang
stabil dengan adanya AlCl3. Sebaliknya kompleks yang terbentuk antara AlCl 3
dengan gugus orto dihidroksi bersifat labil sehingga dengan penambahan asam
akan terdekomposisi. Sedangkan kompleks antara AlCl3 dengan C-4 keto dan 3
atau 5 OH tetap stabil dengan adanya asam. Adanya gugus ortodihidroksi pada
cincin B dapat diketahui jika pada penambahan asam terhadap spektra kompleks
AlCl3 menghasilkan pergeseran hipsokromik sebesar 30-40 nm pada pita I (atau
pita Ia jika pita I terdiri dari 2 puncak). Dengan adanya pergeseran batokromik
pada pita I (dalam AlCl3/HCl) dibandingkan dengan pita I (dalam metanol) 35-55
nm, menunjukkan adanya 5-OH flavon atau flavonol 3-OH tersubstitusi.

2.3. Ekstraksi
Ekstrak adalah sediaan pekat yang diperoleh dengan mengekstraksi zat aktif
dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai,
kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang
tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang ditetapkan (Depkes
RI, 1995).
Ekstraksi adalah suatu proses pemisahan kandungan senyawa kimia dari
jaringan tumbuhan ataupun hewan dengan menggunakan penyari tertentu. Ada
dua cara metode ekstraksi yaitu cara dingin dan cara panas. Metode ekstraksi cara
dingin antara lain maserasi dan perkolasi sedangkan metode ekstraksi cara panas
yaitu refluks, disitilasi, soxhlet, digesti dan infus (Hostettmann, 2014).
8

Salah satu metode ekstraksi cara dingin yang sederhana yaitu maserasi.
Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut
dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan
(kamar). Remaserasi berarti dilakukan pengulangan penambahan pelarut setelah
dilakukan penyaringan maserat pertama, dan seterusnya (Hostettmann, 2014).

2.4. Fraksinasi
Fraksinasi yaitu proses pemisahan fraksi yang terkandung dalam larutan
ekstrak yang mempunyai karakteristik berbeda. Pemisahan larutan ekstrak
berdasarkan sifat kepolarannya. Ada berbagai jenis metode pemisahan sering
digunakan yaitu ekstraksi cair-padat, ekstraksi cair-cair, kromatografi kolom,
kromatografi gas, kromtografi cair-cair dan kromatografi lapis tipis. Ekstraksi
caircair merupakan metode pemisahan yang sederhana dan sering digunakan
(Hostettmann, 2014).
Ekstrak (metanol, etanol 70%, atau etanol 96%) yang diperoleh masih kasar
dan sangat kompeks isinya. Untuk itu perlu dilakukan fraksinasi cair-cair (partisi)
atau fraksinasi cair-padat (dekantasi). Metode dekantasi (dekantasi) adalah
pemisahan berdasarkan perbedaan densitas dimana dengan melarutkan endapan
(padat) dengan pelarut (cair) yang sesuai dimana ekstrak yang sebelumnya
dilarutkan, masih mengendap atau tidak larut akan dilarutkan dengan pelarut lain
sehingga ekstrak yang larut akan disebut fraksi (Saifudin,2014).

2.5. Isolasi
Isolasi merupakan suatu teknik pemurnian. KLT Preparatif adalah salah
satu metode isolasi sederhana digunakan. KLT Preparatif dapat digunakan untuk
memisahkan bahan dalam jumlah gram, namun sebagian besar pemakaian hanya
dalam jumlah milligram. Seperti halnya KLT secara umum, KLT Preparatif juga
melibatkan fase diam dan fase gerak. Dimana fase diamnya adalah sebuah plat
dengan ukuran ketebalan bervariasi. Untuk jumlah sampel 10-100 mg, dapat
dipisahkan dengan mengunakan KLT Preparatif dengan adsorben silika gel atau
aluminium oksida, dengan ukuran 20 x 20 cm dan tebal 1 mm, jika tebalnya di
dua kalikan, maka banyaknya sampel yang dapat dipisahkan bertambah 50%,
seperti halnya KLT biasa, adsorben yang paling umum digunakan pada KLT
Preparatif adalah silika gel (Hostettman et al.,1998).
Sebelum ditotolkan pada plat KLT Preparatif, sampel dilarutkan terlebih dahulu
dalam sedikit pelarut. Pelarut yang baik adalah pelarut yang mudah menguap,
misalnya metanol, etanol, n-heksana, diklorometana, etil asetat dan lain-lain.
Karena jika pelarut yang digunakan tidak mudah menguap, maka akan terjadi
pelebaran pita. Konsentrasi sampel juga sebaiknya hanya 5-10%. Sampel yang
ditotolkan harus berbentuk pita yang sesempit mungkin karena baik tidaknya
pemisahan juga bergantung pada lebarnya pita (Hostettman et al.,1998).
9

2.6. Radikal Bebas


Radikal bebas merupakan suatu senyawa yang memiliki satu atau lebih
elektron tidak berpasangan, hal ini yang menyebabkan radikal bebas bersifat tidak
stabil dan reaktif. Radikal bebas sangat reaktif sehingga menghasilkan ikatan
silang (cross-link) pada DNA, protein, lipida, atau kerusakan oksidatif pada gugus
fungsional yang penting pada biomolekul ini. Radikal bebas juga terlibat dan
berperan dalam patologi dari berbagai penyakit degeneratif, yakni kanker,
aterosklerosis, rematik, jantung koroner, dan katarak (Musarofah, 2015).

2.7. Antioksidan
Antioksidan merupakan senyawa yang dapat memberikan elektron (elektron
donor). Antioksidan juga merupakan senyawa yang dapat menghambat reaksi
oksidasi dengan mengikat radikal bebas reaktif. Berdasarkan mekanisme kerja,
antioksidan dibagi menjadi 3 yaitu antioksidan primer, sekunder, dan tersier.
Antioksidan primer disebut juga antioksidan enzimatis yang terdapat dalam tubuh
(endogenus) seperti enzim superoksida dismutase (SOD), katalase dan glutation
peroksidase (GSH-Px). Antioksidan sekunder disebut juga antioksidan eksogenus
(diluar tubuh) non enzimatis. Cara kerja sistem antioksidan non-enzimatis yaitu
dengan cara memotong reaksi oksidasi berantai dari radikal bebas. Akibatnya,
radikal bebas tidak bereaksi dengan komponen seluler. Contoh antioksidan
sekunder: vitamin C, vitamin E, flavonoid, betakaroten, isoflavon, flavon,
antosianin, katekin, isokatekin serta asam lipoat. Antioksidan tersier adalah
senyawa yang memeperbaiki sel-sel dan jaringan yang rusak oleh radikal bebas
seperti metionin sulfoksidan reduktase yang bermanfaat bagi penderita kanker
(Musarofah, 2015).

2.8. Metode Uji Aktivitas Antioksidan


Beberapa metode yang digunakan untuk menghambat radikal bebas antara lain
metode FTC (Ferri Tiosianat), metode TBA (Thiobarbituric Acid) dan metode
DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl). Pengujian penangkapan radikal pada
metode ini dilakukan dengan metode DPPH. Radikal sintetik yang sering
digunakan adalah DPPH (2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl) dan ABTS (2,2-azinobis
(3-etil benzotiazolin asam sulfonat). Dasar dari metode ini adalah kemampuan
suatu senyawa untuk menangkap radikal DPPH. DPPH memberikan warna violet
pada panjang gelombang 515 nm diukur menggunakan spektrofotometer visible
(Pokorny et al., 2001).
Berikut reaksi yang terjadi antara DPPH yang tereduksi oleh senyawa
antioksidan :
10

Gambar 4. Reaksi DPPH dan Antioksidan (Molyneux, 2004).


Metode DPPH ini bertujuan untuk menunjukan aktivitas antioksidan yang
ekuivalen dapat memberikan efek aktivitas antioksidan sebesar 50% (IC50). IC50
dapat diketahui dengan menginterpretasikan hasil dalam suatu data eksperimental
(Molyneux, 2004).
Menurut Nusarini (2007), tingkat kekuatan antioksidan senyawa menggunakan
metode DPPH dapat digolongkan menurut IC50 (Tabel I.) yaitu :

Tabel I. Tingkat Kekuatan Antioksidan dengan Metode DPPH


Intensitas Nilai IC50
Sangat Kuat < 0,05 mg/mL
Kuat 0,05 mg/mL - 0,10 mg/mL
Sedang 0,11 mg/mL - 0,15 mg/mL
Lemah > 0,15 mg/mL

2.9. Spektrofotometer UV-Vis


Spektrofotometer UV-Vis merupakan salah satu jenis spektroskopi yang sering
digunakan dalam analisis kimia. Spektrofotometer didasarkan pada interaksi
antara senyawa dengan radiasi elektromagnetik. Prinsipnya adalah cahaya
mempunyai perbedaan energi antara tingkatan dasar dan tingkatan tereksitasi yang
mengenai sampel, maka elektron elektron pada tingkatan dasar akan dieksitasi
ke tingkatan tereksitasi, dan sebagian energi cahaya diserap dengan panjang
gelombang. Dalam analisis secara spektrofotometri terdapat tiga daerah panjang
gelombang elektromagnetik yang digunakan, yaitu daerah UV (200 380 nm)
dan daerah visible (380 700 nm) (Sastrohamidjojo, 2001).
Berdasarkan Gandjar dan Rohman (2007), hal-hal yang harus diperhatikan
dalam analisis spektrofotometri UV-Vis:

a. Waktu Operasional (Operating Time)


Waktu operasional didapatkan dengan mengukur hubungan antara waktu
dengan absorbansi. Pada awal terjadi reaksi, absorbansi senyawa yang berwarna
meningkat sampai waktu tertentu hingga diperoleh absorbansi yang stabil.

b. Pemilihan Panjang Gelombang


Ada beberapa alasan harus menggunakan panjang gelombang maksimal, antara
lain:
11

a. Pada panjang gelombang maksimal, bentuk kurva kepekaannya juga


maksimal sehingga perubahan absorbansi untuk setiap satuan konsentrasi
adalah yang paling besar
b. Di sekitar panjang gelombang maksimal, bentuk kurva absorbansi datar
dan pada kondisi tersebut hukum Lambert-Beer akan terpenuhi
c. Jika dilakukan pengukuran diulang maka kesalahan yang disebabkan oleh
pemasangan ulang panjang gelombang akan kecil sekali.

c. Pembuatan Kurva Baku


Berbagai konsentrasi seri larutan baku dibuat dari zat yang akan dianalisis dan
masing-masing absorbansi konsentrasi larutan diukur, kemudian hasil pengukuran
dibuat kurva yang merupakan hubungan antara absorbansi (y) dengan konsentrasi
(x).

d. Pembacaan Absorbansi Sampel atau Cuplikan


Absorbansi yang terbaca sebaiknya antara 0,2 - 0,8 atau 15% - 70% jika dibaca
sebagai transmitans.
Spektrum Flavonoid biasanya ditentukan dalam larutan dengan pelarut Metanol
(MeOH) atau Etanol (EtOH). Spektrum khas terdiri atas dua maksimal pada
rentang 240-285 nm (pita II) dan 300-550 nm (pita I) (Markham, 1988). Menurut
Markham (1988), untuk identifikasi flavonoid, berikut tabel-tabel analisa
beberapa senyawa flavonoid dengan metode pereaksi geser :

Tabel II. Rentang Serapan Spektrum UV-Vis Senyawa Flavonoid


Pita II (nm) Pita I (nm) Jenis flavonoid
250-280 310-350 Flavon
250-280 330-360 Flavonol (3-OH tersubtitusi)
250-280 350-385 Flavonol (3-OH bebas)
245-275 310-330 bahu Isoflavon
Kira-kira 320 puncak Isoflavon (5-deoksi-6,7-
dioksigenasi)
275-295 300-330 Flavanon dan dihidroflavonol
230-270 340-390 Khalkon
(kekuatan rendah)
230-270 380-430 Auron
(kekuatan rendah)
270-280 465-560 Antosianidin dan Antosianin

2.10. Landasan Teori


Radikal bebas merupakan suatu senyawa yang memiliki satu atau lebih
elektron tidak berpasangan, hal ini yang menyebabkan radikal bebas bersifat tidak
12

stabil dan reaktif di dalam tubuh sehingga dapat menimbulkan kerusakan sel dan
dapat menimbulkan penyakit degeneratif.
Kandungan kimia dalam daun tanaman adam hawa adalah senyawa-senyawa
flavonoid, antosianin, saponin, karotenoid, lilin, terpenoid, kumarin dan steroid.
Flavonoid dan antosianin merupakan senyawa antioksidan memiliki gugus fenol
yang dapat mendonorkan atom hidrogen pada radikal bebas sehingga radikal
dapat bersifat stabil. Antosianin berwarna terdapat dalam daun dan bunga selalu
disertai oleh flavon atau flavonol tanpa warna. Menurut penelitian Sitorus et al.
(2012), senyawa flavonoid yang terdapat pada ekstrak etanol 96% daun tanaman
adam hawa adalah antosianidin. Antosianidin adalah aglikon dari antosianin.
Antosianin larut dalam metanol, etanol, aseton dan kloroform, stabil pada pH 3,5
suhu dibawah 50oC dan sensitif terhadap cahaya.
Metode ekstraksi yang digunakan maserasi dengan pelarut yang sesuai seperti
etanol 96% dan dilakukan remaserasi untuk mendapatkan maserat yang optimal.
Fraksinasi dilakukan untuk memisahkan senyawa antosianidin menggunakan
pelarut yang dapat melarutkan antosianidin seperti metanol dan aseton dengan
metode dekantasi. Kemudian disolasi pada fraksi metanol dan fraksi aseton
dengan KLT preparatif yang melibatkan fase diam silika G F 254 dan fase gerak
BAA (n-butanol : asam asetat : air) (4:1:5), dimana terbentuknya pita-pita yang
memgambarkan senyawa aktif murni yang akan diisolasi untuk uji selanjutnya.
Pengujian aktivitas antioksidan pada fraksi metanol dan aseton dapat dilakukan
dengan metode DPPH, metode melihat aktivitas antioksidan yang terdapat pada
fraksi untuk menstabilkan radikal bebas DPPH yang dinyatakan dalam persen
hambat (%inhibisi) sehingga diperoleh IC50. Kemudian dilakukan identifikasi
senyawa flavonoid pada hasil isolasi fraksi metanol dan fraksi aseton dilakukan
dengan larutan pereaksi geser seperti AlCl3 5%/HCl, NaOH dan NaOAc/H 3BO3
dengan menimbulkan efek bathokromik (pergeseran panjang gelombang)
menggunakan spektrofotometer UV/Vis.

2.11. Hipotesis
Fraksi metanol dan fraksi aseton ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa
mengandung senyawa flavonoid berupa antosianidin yang memiliki aktivitas
antioksidan yang dinyatakan sebagai IC50
13

BAB III
METODE PENELITIAN

3.1. Jenis dan Rancangan Penelitian


Jenis penelitian termasuk penelitian eksperimental murni dengan rancangan acak
lengkap pola searah. Merupakan jenis penelitian eksperimental murni karena
penelitian mencari hubungan sebab akibat dari fraksi daun tanaman adam hawa
dengan nilai IC50 yang dihasilkan. Rancangan acak karena pengambilan sampel
daun adam hawa dilakukan secara acak, tidak ada pemilihan secara khusus.
Rancangan lengkap karena terdapat kelompok perlakuan, kontrol negatif dan
kontrol positif.

3.2. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional


a) Variabel Utama
Variabel bebas : Konsentrasi fraksi metanol dan fraksi aseton ekstrak
etanol 96% daun tanaman adam hawa
Variabel tergantung : Aktivitas antioksidan fraksi metanol dan fraksi aseton
ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa (%
inhibisi)
b) Variabel pengacau
a.Terkendali : cara memanen, waktu panen, tempat tumbuh dan
lokasi pengambilan sampel
b.Tak terkendali : umur tanaman dan patofisiologis tanaman

c) Definisi Operasional
a) Ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa adalah hasil dari maserasi
simplisia daun tanaman adam hawa menggunakan penyari etanol 96% dan
dimaserasi lagi dengan pelarut yang sama hingga filtrat maserat jernih dan
disaring serta diuapkan membentuk cairan kental berwarna hijau keunguan.
b) Fraksi metanol daun tanaman adam hawa adalah hasil dari metode dekantasi
yang akan memisahkan senyawa-senyawa yang larut dalam metanol pada
ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa.
14

c) Fraksi aseton daun tanaman adam hawa adalah hasil dari metode dekantasi
yang akan memisahkan senyawa-senyawa yang larut dalam aseton pada
ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa.
d) Isolat adalah hasil pemurnian fraksi metanol atau fraksi aseton ekstrak
etanol 96% daun tanaman adam hawa dengan menggunakan KLT preparatif
dengan fase gerak BAA (n-butanol : asam asetat : air) (4:1:5) dan fase diam
silika G 60 F254.
e) Persen inhibition concentration (%IC) adalah persen yang menyatakan
kemampuan fraksi metanol dan fraksi aseton ekstrak etanol 96% daun
tanaman adam hawa daun tanaman adam hawa dalam meredam radikal
bebas DPPH.
f) Inhibition concentration 50 (IC50) adalah konsentrasi fraksi metanol atau
fraksi aseton ekstrak etanol 96% daun tanaman adam hawa yang dapat
meredam 50% radikal bebas dengan metode DPPH.
g) Pereaksi geser adalah reagen yang digunakan untuk identifikasi jenis
senyawa flavonoid yang menimbulkan efek pergeseran panjang gelombang
(bathokromik) dari panjang gelombang suatu senyawa flavonoid.

3.3. Bahan Penelitian


a) Bahan Utama
Bahan yang digunakan dalam penelitin ini adalah daun tanaman adam hawa yang
diperoleh dari CV. Merapi Herbal, Jl. Kaliurang km. 21,5, Sidorejo
Hargobinangun, Pakem, Sleman, Yogyakarta.
b) Bahan Kimia
Bahan kimia kualitas pro analitik berupa metanol (E.Merck), AlCl3 5%, NaOH 2
M, NaOAc, H3BO3 dan HCl. Bahan kimia kualitas teknis CV. General Labora
berupa etanol 96%, air suling, n-heksan (teknis), aseton (teknis), alumunium foil,
DPPH (Aldrich), lempeng KLT, rutin (Sigma) dan fase gerak n-butanol : asam
asetat : air (BAA) (4:1:5).
3.4. Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini, antara lain: Shaker (Innova TM 2100),
vortex (Janke & Kunkel), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UVmini-1240
single beam A10935105039 CD), UV cabinet, timbangan analitik METTLER
TOLEDO (max 3100 g, min 0,5 g), timbangan analitik SCALTEC (max 60/120 g,
min 0,001 g), timbangan analitik ultramicro merek RADWAG seri UYA 2.3 Y (
max : 2,1 g, min 0,8 mg), ayakan no.40, bejana maserasi, blender, sentrifugator,
vakum penguap putar (vaccum rotary evaporator) (Buchi R-205,Jerman),
peralatan kromatografi lapis tipis preparatif, waterbath, peralatan gelas,
mikropipet (Acura 825, Socorex).

3.5. Tata Cara Penelitian


A. Determinasi Tanaman
Determinasi tanaman menggunakan ciri-ciri morfologi yang terdapat pada daun
tanaman adam hawa dilakukan secara benar berdasarkan buku acuan Flora
Untuk Sekolah di Indonesia Tahun 1992 yang terdapat di Laboratorium
Farmakognosi Fitokimia Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma
Yogyakarta, untuk proses determinasi dibantu oleh tenaga ahli (determinator).
B. Pengumpulan Bahan Uji
Bahan uji yang digunakan adalah daun tanaman adam hawa yang diperoleh
dari CV. Merapi Farma, Yogyakarta. Daun yang diambil yaitu daun tua (bukan
daun kuning). Daun dipetik satu persatu secara manual. Kriteria daun yang
digunakan yaitu daun utuh, segar, berbentuk pedang dengan panjang 15 - 30
cm dan lebar 2,5 - 5,5 cm, ujung daun runcing, permukaan daun gundul serta
warna daun di permukaan atas hijau dan di bagian bawah berwarna merah
ungu.
C. Pembuatan Simplisia
Daun tanaman adam hawa dipetik dan ditimbang kurang lebih 1,0 kg kemudian
disortasi basah. Hasil sortasi dicuci untuk menghilangkan kotoran yang
melekat pada sampel. Lalu daun tanaman adam hawa tersebut ditiriskan sampai
sisa air menghilang dan dipotong-potong menjadi beberapa bagian. Daun
tanaman adam hawa dikeringkan dengan panas dalam oven pada suhu 40C
selama 7 hari. Daun tanaman adam hawa dikatakan kering jika daun dapat
hancur ketika diremas dengan tangan. Daun tanaman adam hawa yang telah
dikeringkan kemudian diserbuk menggunakan blender, lalu diayak
menggunakan ayakan nomor 40.
D. Ekstraksi Daun Tanaman Adam Hawa
Serbuk kering daun tanaman adam hawa ditimbang kurang lebih 50,0 g
kemudian dimaserasi dengan pelarut etanol 96% sebanyak 250,0 mL. Maserasi
dilakukan selama 6 jam dengan shaker, kemudian didiamkan selama 18 jam.
Hasil maserat dan sisa serbuk dipisahkan. Sisa serbuk dimaserasi kembali
dengan pelarut dan jumlah yang sama sampai filtrat hasil maserasi jernih. Hasil
maserasi digabung dan dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator pada
suhu kurang lebih 40C sehingga diperoleh ekstrak kental etanol 96%. Ekstrak
ditimbang dan dihitung rendemennya.
E. Fraksinasi Ekstrak Daun Tanaman Adam Hawa
Ekstrak etanol 96% kental ditimbang kurang lebih 2,50 g dan ditambahkan
dengan kloroform sebanyak 50,0 mL, kemudian dipisahkan antara yang larut
dan tidak larut kloroform. Ekstrak yang tidak larut kloroform ditambahkan 50,0
mL pelarut aseton, dipisahkan antara yang larut dan tidak larut aseton. Ekstrak
yang larut dalam aseton disebut fraksi aseton. Ekstrak yang tidak larut aseton
ditambahkan 50,0 mL metanol, dipisahkan antara yang larut dan tidak larut
metanol. Ekstrak yang larut dalam metanol disebut fraksi metanol. Total
ekstrak kental etanol 96% yang digunakan untuk fraksinasi adalah kurang lebih
10,0 g. Masing-masing hasil fraksi aseton dan metanol digabung dan
dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator kurang lebih 40oC. Tiap fraksi
ditimbang dan dihitung rendemennya.
F. Isolasi Fraksi
Isolasi dengan KLT preparatif digunakan plat silika G 60 F 254 dengan ukuran
10,0 cm x 20,0 cm. Masing-masing fraksi aseton dan fraksi metanol 100,0 mg
dilarutkan dengan 10,0 mL etanol 96%, kemudian larutan fraksi diinjeksikan
dengan linomat sepanjang plat pada jarak 1,0 cm dari garis bawah dan 1,0 cm
dari garis tepi serta 1,0 cm antar pita. Selanjutnya dielusi dengan n-butanol :
asam asetat : air (BAA) (4:1:5). Setelah gerakan larutan pengembang sampai
pada garis batas, elusi dihentikan. Pita yang terbentuk masing-masing diukur
harga Rf nya. Pita-pita diperiksa di bawah sinar UV pada panjang gelombang
254 nm dan 366 nm. Isolat-isolat yang diperoleh dari hasil KLT preparatif
dengan cara mengerok pila-pita pada fase diam yang telah dielusikan, lalu
serbuk dilarutkan dengan etanol 96% sebanyak 10,0 mL dan disentrifugasi
untuk mengendapkan fase diamnya (silika gel), lalu supernatannya diambil dan
diuapkan di waterbath.
G. Identifikasi Senyawa Flavonoid Isolat
Analisis untuk identifikasi senyawa flavonoid menggunakan isolat dari masing-
masing fraksi aseton dan fraksi metanol daun tanaman adam hawa sebanyak
1,0 mg dilarutkan dalam metanol p.a sampai volume 100,0 mL, diambil 2,0-3,0
mL isolat fraksi aseton dan fraksi metanol kemudian diukur panjang
gelombang maksimum (maks) 200-600 nm pada spektrofotometer visibel
untuk mengetahui panjang gelombang senyawa flavonoid. Bila positif terdapat
senyawa flavonoid, diambil 2,0 mL isolat dan ditambahkan larutan pereaksi
geser seperti AlCl3 5% (6 tetes)/HCl (3 tetes), NaOH 2M (3 tetes) dan NaOAc
(2 mm dari dasar kuvet)/H3BO3 (1 mm dari dasar kuvet) secara bergantian
kemudian diukur maks pada spektrofotometer visibel.
H. Uji Aktivitas Antioksidan
Pada fraksi aseton dan fraksi metanol daun tanaman adam hawa diuji aktivitas
antioksidan menurut metode DPPH dengan beberapa modifikasi. Nilai IC50
dihitung dengan menggunakan rumus persamaan regresi.
a. Uji pendahuluan (optimasi panjang gelombang DPPH dan reaction
time/operating time (OT)
Larutan DPPH yang telah dibuat dengan konsentrasi 0,02 mg/mL ditentukan
spektrum serapan menggunakan spektrofotometer visibel pada panjang
gelombang 400 nm hingga 600 nm dan ditentukan panjang gelombang
optimumnya.
Larutan DPPH 3,8 mL dimasukkan dalam tabung ditambah 0,2 ml larutan
standar rutin dengan masing-masing pada tiga tingkat konsentrasi yaitu
tinggi, sedang dan rendah yaitu 0,02 ; 0,06 ; 0,14 mg/mL dengan rentang
waktu 0; 5; 10; 15; 20; 25; 30; 35; 40; 45; 50; 55 dan 60 menit pada panjang
gelombang maksimum teoritis yaitu 515 nm serta ditentukan OT yang
menunjukkan perubahan absorbansi yang tidak signifikan (stabil).
b. Pembuatan Larutan
1) Pembuatan Larutan DPPH 0,02 mg/mL
Serbuk DPPH ditimbang 10,0 mg dan dilarutkan dalam 100,0 mL metanol p.a
didapatkan konsentrasi 0,10 mg/mL. Kemudian diambil 20,0 mL dimasukkan
ke dalam labu ukur 100 mL dan ditambahkan metanol p.a hingga batas tanda.
2) Persiapan Larutan Uji Fraksi Metanol dan Fraksi Aseton
Pembuatan larutan induk (konsentrasi 2,0 mg/mL). Tiap fraksi ditimbang 20,0
mg dan dilarutkan dalam 10,0 mL metanol p.a hingga homogen.
Pembuatan larutan seri (konsentrasi 0,04; 0,08; 0,12; 0,2; dan 0,28 mg/mL).
Tiap fraksi diambil masing-masing 0,4; 0,8; 1,2; 2; dan 2,8 mL dimasukkan
kedalam labu ukur 10 mL dan ditambahkan volumenya dengan metanol p.a
hingga batas tanda.
3) Pembuatan larutan kontrol negatif (blanko)
Larutan blanko yang digunakan adalah 0,20 mL metanol p.a dimasukkan ke
dalam tabung reaksi dan ditambahkan 3,80 mL DPPH, digojog hingga
homogen. Larutan blanko didiamkan selama OT hasil optimasi.
4) Pembuatan larutan rutin sebagai pembanding/ standar (kontrol positif)
Pembuatan larutan induk (konsentrasi 1 mg/mL). Serbuk rutin ditimbang 10,0
mg dan dilarutkan dalam 10 mL metanol p.a hingga homogen.
Pembuatan larutan seri (konsentrasi 0,02, 0,04, 0,06, 0,1 dan 0,14 mg/mL).
Larutan induk diambil masing-masing 0,2; 0,4; 0,6; 1; 1,4 mL, kemudian
dimasukkan kedalam labu ukur 10 mL dan ditambahkan volumenya dengan
metanol p.a hingga batas tanda.
c. Pengujian aktivitas antioksidan
Dari masing-masing konsentrasi larutan uji tiap fraksi diambil 0,2 mL
dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 3,8 mL DPPH 0,02 mg/mL,
digojog hingga homogen, didiamkan selama OT dan diukur serapannya pada
panjang gelombang hasil optimasi. Pembanding rutin dilakukan pengujian
yang sama seperti pada fraksi.

3.6. Tata Cara Analisis Hasil


a. Hasil Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid
Untuk isolasi dengan KLT preparatif, menurut Gandjar & Rohman
(2007) pemisahan ditunjukkan dengan nilai Rf. Berikut rumus yang
digunakan :
Jarak yang ditempuh solut
Rf =
Jarak yang ditempuh fase gerak
Analisis senyawa flavonoid mengacu pada buku Techniques of Flavonoid
Identification oleh K.R.Markham (1988) dengan sistem penomoron flavonoid
gambar 3 dan tabel-tabel spektrum senyawa flavonoid berikut :

Tabel III. Penafsiran Spektrum Senyawa Flavonoid dalam NaOMe/NaOH


Jenis Flavonoid Pergeseran yang tampak Petunjuk
Pita I Pita II Penafsiran
Flavon & 1.Kekuatan menurun terus 1. 3,4- OH, o-diOH
Flavonol 2. + 45 hingga 65 nm pada cincin A, pada
(tidak turun) cincin B 3 OH yang
3. + 45 hingga 65 nm berdampingan
(menurun) 2. 4-OH
4. Pita baru (bandingkan 3. 3-OH, tak ada 4-
dengan MeOH), 320-335 OH bebas
nm 4. 7-OH
Antosianidin Semua terurai kecuali 3- Nihil
dan antosianin deoksiantosianidin

Tabel IV. Penafsiran Spektrum Senyawa Flavonoid dalam NaOAc


Jenis Flavonoid Pergeseran yang tampak Petunjuk Penafsiran
Pita I Pita II
Flavon & Flavonol 1. +5 sampai 20 nm 1. 7-OH
(berkurang bila ada 2. Gugus yang peka
oksigenasi pada 6 atau terhadap basa, misal 6,7
8) atau 7,8 atau 3,4-diOH

2. Kekuatan berkurang dengan


bertambahnya waktu

Tabel V. Penafsiran Spektrum Senyawa Flavonoid dalam NaOAc/H3BO3


Jenis Flavonoid Pergeseran yang tampak Petunjuk Penafsiran
Pita I Pita II
Flavon & Flavonol 1. + 12 sampai 36 1. o-diOH pada cincin
nm (nisbi terhadap B
spektrum MeOH) 2. o-diOH pada cincin a
2. pergeseran lebih (6,7 atau 7,8)
kecil

Tabel VI. Penafsiran Spektrum Senyawa Flavonoid dalam AlCl3 dan


AlCl3/HCl
Jenis Flavonoid Pergeseran yang tampak Petunjuk Penafsiran
Pita I Pit
a II
Flavon & 1. + 35 hingga 55 nm 1. 5-OH
Flavonol 2. +17 hingga 20 nm 2. 5-OH dengan oksigenasi
3. Tak berubah pada 6
4. +50 hingga 60 nm 3. Mungkin 5-OH dengan
5. Pergeseran AlCl3/HCl gugus prenil pada 6
+ 30 hingga 40 nm 4. Mungkin 3-OH (dengan
6. Pergeseran AlCl3/HCl atau tanpa 5-OH)
+ 20 hingga 25 nm 5. o-diOH pada cincin B
6. o-diOH pada cincin A
(tambahan pada pergeseran
0-diOH pada cincin B)
Antosianidin 1. + 25 sampai 35 nm 1. o-diOH
dan antosianin (pada pH 2-4) 2. Banyak o-diOH atau o-
2. Pergeseran lebih besar diOH (3-deoksiantosianidin )

b. Hasil Uji Aktivitas Antioksidan


Untuk mendapatkan nilai IC50 berdasarkan presentase inhibisi terhadap
radikal DPPH dari masing-masing konsentrasi larutan sampel dengan rumus :
|kontrol||sampel|
%inhibisi= x 100%
|kontrol|
Keterangan :
Abs kontrol : absorbansi larutan kontrol (blanko)
Abs sampel : absorbansi larutan uji fraksi atau absorbansi rutin

Setelah didapatkan % inhibisi dari masing-masing konsentrasi tiap fraksi,


kemudian dintentukan persamaan y = a + bx dengan perhitungan secara
regresi linear dimana x adalah konsentrasi (mg/mL) dan y adalah presentase
inhibisi (%). Aktivitas antioksidan dinyatakan dengan Inhibition
Concentration 50% (IC50) yaitu konsentrasi sampel yang dapat menghambat
radikal bebas DPPH (Molyneux, 2004).
Kemudian nilai IC50 dilakukan uji normalitas Shapiro-wilk taraf
kepercayaan 95% dan uji T tidak berpasangan (terdistribusi normal) atau uji
Mann-Whitney (tidak terdistribusi normal) untuk menentukan signifikansi
perbedaan nilai IC50 fraksi metanol dan fraksi aseton daun adam hawa yang
diperoleh (Dahlan, 2012).

3.7. Jadwal Kegiatan


Tabel VII. Jadwal Kegiatan Tahun 2016
Bulan
Bulan Bulan Bulan Bulan Bulan
No Jenis Kegiatan 8 9 10 11 12

1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2
1. Determinasi
tanaman adam
hawa
2. Pengambilan,
pemotongan dan
pengeringan daun
adam hawa
3. Penyerbukan
simplisia dan
ekstraksi simplisia
4. Fraksinasi ekstrak
5. Uji DPPH fraksi
6. Isolasi dan
identifikasi fraksi
8. Pengolahan data
9. Menyusun naskah
skripsi
10. Revisi naskah
skripsi
11. Ujian akhir skripsi

DAFTAR PUSTAKA

Dahlan, M.Sopiyudin, 2012. Statistik untuk Kedokteran dan Kesehatan. Edisi 5,


Salemba Medika, Jakarta, 48,62,63.
Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 1995. Farmakope Indonesia.Edisi IV,
Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan, Jakarta, 325.
Gandjar, I., G., dan Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar,
Yogyakarta, 252-256, 323-324,328, 354, 359, 465- 469.
Global Biodiversity Information Facility, 2013. Rhoeo discolor (L'Hr.) Hance.
http://www.gbif.org/species/101345884, diakses tanggal 22 April 2016.
Harborne, J., 1996. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan. Cetakan Ketiga, Penerjemah: Padmawinata, K. dan I. Soediro. :
Penerbit ITB , Bandung, 71-80.
Hostettman, K., Hostettman, M. Dan A. Marston, 1998. Preparative
Chromatography Techniques : Applications In Natural Product Isolation.
Springer-Verlag Berlin Heidelberg, New York, 15-19.
Hostettmann, Kurt, 2014. Handbook of Chemical and Biological Plant Analytical
Methods. 3rd edition, John Wiley & Sons Ltd, United Kingdom, 19, 27-29, 30-
40.
Indrayudha, Peni, Wiyarti, Daru dan Rima Munawaroh, 2013. Aktivitas
Antibakteri Fraksi Metanol Ekstrak Etanol Daun Teh Hijau (Camellia Sinensis
(L.) O.K) terhadap Streptococcus mutans dan Lactobacillus acidophilus serta
Bioautografinya. Naskah Publikasi, Universitas Muhammadiyah Surakarta ,
Surakarta, 1-15.
Lwin, Moe Moe, 2008, Morpholgical, Microscopical Studies and Elemental
analysis of Polygonum chinense and Rhoe discolor Hance, Jour.Myan.Acad
Art and Sc, 6 (4), 265 -278.
Mabry, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B., 1970. The Systematic
Identification of Flavonoid. Springer-Verlag, Berlin, 35-164.
Markham, K. R., 1988. Techniques of Flavonoids Identification. diterjemahkan
oleh Padwanita, K., Penerbit ITB, Bandung, 38-53.
Molyneux, P., 2004, The Use of The Stable Free Radical DPPH for Estimating
Antioxidant Activity, Songklanakarin J. Sci. Technol., 26 (2), 211-219.
Musarofah, 2015. Tumbuhan Antioksidan. Penerbit PT Remaja Rosdakarya,
Bandung, 1 -21.
Nusarini, R., 2007. Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Etil Asetat Ekstrak Metanolik
Herba Ketul (Bidens pilosa L.). Skripsi, Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta.
Padmaningrum, Regina Tutik, 2011. Karakter Ekstrak Zat Warna Daun Rhoeo
Discolor Sebagai Indikator Titrasi Asam Basa. Prosiding Seminar Nasional
Penelitian, Pendidikan dan Penerapan MIPA, Fakultas MIPA, Universitas
Negeri Yogyakarta, Yogyakarta, 229-234.
Pokorny, J., Yanishlieva, N., dan Gordon, M., 2001. Antioxidant in Food. Practical
Aplication, Wood publishing Limite, Cambridge, England, 22-23.
Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. Bandung: ITB.
Saifudin, Azis, 2014. Senyawa Alam Metabolit Sekunder: Teori, Konsep, dan
Teknik Pemurnian. Edisi 1, Deepublish, Yogyakarta, 35,49-50.
Sastrohamidjojo, H., 2001. Spektroskopi. Liberty, Yogyakarta, 43.
Sitorus, Risma Meidy Hardina, Wullur, Adeanne C. dan Paulina V.Y. Yam Lean,
2012. Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Flavanoid Pada Daun Adam Hawa
(Rhoe discolor). Pharmacon, 1(1), 53-57.
Steenis, Van., Bloembergen dan PJ. Eyma, 1992. FLORA Untuk Sekolah di
Indonesia. Percetakan Penebar Swadaya, Jakarta, 43-51,136-138.
Tan et al, 2014. Antioxidant Content, Antioxidant Activity, and Antibacterial
Activity of Five Plants from the Commelinaceae Family. Antioxidants, 3, 758-
769.
Tjitrosoepomo, Gembong, 2013. Taksonomi Tumbuhan (Spermatophyta). Cetakan
Kesebelas, UGM Press, Yogyakarta, 408,410.
Winarti ,Wiwi, Djamil, Ratna dan Indah Yuniasari, 2007. Identifikasi Senyawa
Flavonoid dalam Fraksi n-Butanol Taraxacum officinale. Asteraceae, Jurnal
Ilmu Kefarmasian Indonesia, 5 (2), 67 74.