Anda di halaman 1dari 14

4.

5 Alat dan Bahan Penelitian

4.5.1 Alat Pembuatan Gel Kombinasi Kitosan dengan Ekstrak Gel Aloe vera

Alat Pembuatan Kitosan Gel:

1. Timbangan digital

2. Tabung erlenmeyer

3. Pipet tetes

4. Pipet ukur

5. Pengaduk

6. Magnetic Stirrer

Alat Pembuatan Ekstrak Gel Aloe vera:

1. Alat ekstraksi standar (seperti pisau dan blender)

2. Tabung reaksi

3. Water-bath

4. Gelas ukur

5. Alat pengocok

6. Corong buctner

7. Evaporator (Laborota 4000)

Alat Pembuatan Gel Kombinasi Kitosan dengan Ekstrak Gel Aloe vera:

1. Tabung erlenmeyer

2. Magnetic Stirrer

3. pH meter / indicator universal

4. Stopwatch

5. Kaca transparan

6. Sentrifugator
4.5.2 Bahan Pembuatan Gel Kombinasi Kitosan dengan Ekstrak Gel Aloe vera

Bahan Pembuatan Kitosan Gel:

1. Kitosan Berat Molekul Rendah dengan derajat deasetilasi di atas 75%, berat

molekul 50.000-190.000 Da, Lot Number MKBH7256V (Sigma- Aldrich)

2. Kitosan Berat Molekul Tinggi dengan derajat deasetilasi di atas 75% , berat

molekul 310.000-375.000 Da, Lot Number MKBH5816V (Sigma- Aldrich)

3. Asam asetat 1% p.a (Merck, Germany)

Bahan Pembuatan Ekstrak Gel Aloe vera:

1. Aloe vera

2. Pelarut: etanol 70%

3. Na-CMC 3,5%

Bahan Pembuatan Gel Kombinasi Kitosan dengan Ekstrak Gel Aloe vera:

1. NaOH 1,25%

4.6 Lokasi dan Waktu Penelitian

4.6.1 Lokasi Penelitian

Pembuatan formulasi gel kombinasi kitosan dengan ekstrak gel Aloe vera dilakukan

di Laboratorium Fitokimia dan Bahan Alam, Fakultas Farmasi, Universitas Widya Mandala,

Surabaya. Pengujian formulasi gel kombinasi kitosan dengan ekstrak gel Aloe vera dilakukan

di Laboratorium F&T Likuida dan Semi Solida, Fakultas Farmasi, Universitas Widya

Mandala, Surabaya.

4.6.2 Waktu Penelitian

Pengumpulan sampel, pembuatan sediaan gel kombinasi kitosan dengan ekstrak gel

Aloe vera serta analisis data dimulai sejak bulan April 2015 Februari 2016.

4.7 Cara Kerja dan Prosedur Pengambilan Data


4.7.1 Pembuatan Kitosan Gel 1% (w/p)

Pembuatan kitosan gel 1% (w/p) dengan berat molekul rendah maupun tinggi dibuat

dengan melarutkan 1 gram bubuk kitosan dalam 100mL asam asetat (CH 3COOH) 1% sesuai

dengan petunjuk pabrik (Sigma-Aldrich, 2013). Kelarutan kitosan yang paling baik ialah

dalam asam asetat (Sugita, 2009). Pengadukan antara serbuk kitosan dan asam asetat dengan

cara manual kemudian menggunakan magnetic stirrer (Budianto, 2013). Larutan yang

dihasilkan baik apabila sediaan yang dihasilkan homogen, tidak ada pengendapan dan bentuk

sediaan gel setengah padat (Mappa dkk, 2013). Disentrifuse .....

4.7.2 Pembuatan Ekstrak Gel Aloe vera

Ekstraksi dilakukan dengan cara maserasi. Ekstrak gel Aloe vera didapat dengan cara

memotong kecil-kecil 40kg gel Aloe vera hingga halus Aloe vera yang telah dibersihkan dan

dihilangkan durinya dan diambil gel nya (Sulistiawati, 2011). Kemudian, gel Aloe vera yang

telah yang telah halus dikeringakan dengan freeze dry kemudian ditambahkan 4 liter etanol

70% dan diaduk selama 30 menit dengan stirrer magnetic dan didiamkan selama 48 jam.

Hasil maserasi disaring sebanyak 3 kali dengan corong buctner yang dilapisi kertas saring

dan ditampung dengan erlenmeyer. Filtrat hasil penyaringan diuapkan dengan vacum rotary

evaporator. Hasil ekstraksi didapatkan sebanyak 110 mL ekstrak Aloe vera. Selanjutnya untuk

membuat 50mL ekstrak Aloe vera dengan konsentrasi 50%, 25mL ekstrak Aloe vera

dilarutkan dengan menggunakan 25mL Na-CMC 3,5% sedangkan untuk membuat 50mL

ekstrak Aloe vera dengan konsentrasi 75%, 37,5mL ekstrak Aloe vera dilarutkan dengan

menggunakan 12,5mL Na-CMC 3,5%.

4.7.3 Pembuatan Gel Kombinasi Kitosan dan Ekstrak Gel Aloe vera

Pembuatan 100mL gel kombinasi kitosan dan ekstrak gel Aloe vera dilakukan dengan

cara mencampur masing-masing 50mL gel kitosan dengan 50mL ekstrak gel Aloe vera yang

telah dilarutkan dengan Na-CMC 3,5% atau dengan perbandingan volume 1:1 (Silva dkk,
2013). Pencampuran dilakukan secara manual dan dilanjutkan dengan menggunakan stirrer

magnetic hingga didapatkan sediaan yang homogen (Matsunaga, 2005).

Gel kombinasi tersebut memiliki pH yang asam sehingga perlu dinetralkan dengan

menambah larutan NaOH. Berdasarkan hasil trial peneliti, untuk medapatkan hasil sediaan

yang baik penetralan dengan NaOH 1,25% menghasilkan sediaan dengan pH yang netral dan

homogen jika dibandingkan dengan NaOH 2%, 2,75% dan 3,5%. Penetralan dilakukan

dengan menambahkan NaOH 1,25% hingga sediaan memiliki pH netral. Sediaan gel yang

baik berada dalam interval pH yang tidak menyebabkan iritasi antara 6-7 dan memiliki

viskositas yang cukup sehingga mudah dalam pengaplikasiannya (Yoshe, 2014). Gel

kombinasi kitosan dengan ekstrak gel Aloe vera yang telah terbentuk diukur pHnya

menggunakan pH meter.

Cara pembuatan scaffold

Pencabutan gigi

4.5 Alat dan Bahan Penelitian

4.5.1 Alat Penelitian

A. Alat Perlakuan Hewan Coba

1) Pinset

2) Tang modifikasi elevator khusus untuk mencabut gigi tikus

3) Needle holder

4) Gunting
5) Disposable syringe 1cc dan 3cc

6) Absorbable sutures

7) Kotak tempat sampel

8) Sarung tangan

9) Masker

B. Alat Pemeriksaan Histopatologi Anatomi

1) Berker glass

2) Timbangan

3) Pinset

4) Rotary microtome

5) Label

6) Slide dan cover glass

7) Petridish

8) Sarung tangan

9) Mikroskop

10) Kamera

4.5.2 Bahan Penelitian

A. Bahan Perlakuan Hewan Coba

1) Kitosan cangkang kepiting Sigma-Aldrich low molecular weight

(Lampiran 2)

2) Kitosan cangkang kepiting Sigma-Aldrich high molecular weight

(Lampiran 2)

3) Asam asetat 1%

4) NaOH 1,25%
5) Alkohol 70%

6) Ketamin hydrochloride dan xylazine hydrochloride

B. Bahan Pemeriksaan Histopatologi Anatomi

1) Buffer formalin 10%

2) Alkohol 80%

3) Alkohol 95%

4) Alkohol 100% (absolute)

5) NaOH 50%

6) Xylene

7) Buffer paraffin

8) Asam Nitrat 5%

9) Pewarnaan haematosiklin eosin (HE)

4.6 Lokasi dan Waktu Penelitian

4.6.1 Lokasi

1. Pemeliharaan dan pemberian perlakuan hewan coba dilakukan di Laboratorium

Biokimia Unit Hewan Coba Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga Surabaya.


2. Pembuatan kitosan gel dilakukan di Laboratorium Biokimia Fakultas Kedokteran

Universitas Hang Tuah Surabaya.


3. Pembuatan dan pengamatan sediaan histopatologi di Laboratorium Patologi Anatomi

RS Dr. Soetomo Surabaya.

4.6.2 Waktu

Menentukan tema, penyusunan proposal, pengumpulan sampel, pemberian perlakuan

sampel, pembuatan sediaan histopatologi serta analisis dimulai dari bulan Febuari 2013

(Lampiran 3).
4.7 Cara Kerja dan Prosedur Pengambilan Data

4.7.1 Cara Kerja

A. Tahapan Persiapan Hewan Coba

Pada penelitian ini hewan coba yang digunakan adalah Rattus Norvegicus strain Wistar

jantan, usia 3 bulan, berat badan 150-200 gr, diadaptasikan dengan tempat penelitian selama

2 minggu. Hewan coba diletakkan dalam kandang yang jauh dari kebisingan, diberi makanan

dan minuman.

B. Pembagian Kelompok Hewan Coba

Setelah tindakan pencautan, hewan coba dibagi menjadi .. kelompok perlakuan:

Kelompok 1 (kontrol) : Soket gigi tanpa diberi kitosan gel, langsung dijahit.

Kelompok 2 (perlakuan) : Soket gigi diberi ..........................

kemudian dijahit.

Kelompok 3 (perlakuan) : Soket gigi diberi,

kemudian dijahit.

Kelompok....

Tahapan Perlakuan Hewan Coba

Tahapan perlakukan hewan coba mengacu pada penelitian sebelumnya oleh Sularsih

(2011).Prinsip kerja asepsis, semua alat disterilkan dengan panas kering 160C selama 1 jam.

Hewan coba dianastesi menggunakan ketamine dengan dosis 25 mg/kg BB dan xylazine

dengan dosis 10 mg/kg BB yang dilarutkan dalam larutan isotonic saline solution steril lalu

diambil 0,2 ml/ 200 gram BB dan disuntikkan pada paha kanan atas secara intramuskular.
Setelah itu dilakukan pembersihan pada daerah pencabutan dengan semprotan air dan

betadine untuk asepsis daerah pencabutan.Kemudian dilakukan pencabutan gigi pada tikus

menggunakan alat modifikasi tang dan elevator.Pastikan tidak ada sisa gigi yang tertinggal di

dalam soket gigi.Soket gigi kemudian diirigasi menggunakan saline solution.

Kitosan gel dengan berat molekul rendah dan tinggi dalam syringe berdiameter kecil

dimasukkan ke dalam soket tempat luka bekas pencabutan gigi sebanyak 0,1 ml/ ekor tikus,

kemudian dilanjutkan menjahit lukanya dengan teknik simpul tunggal menggunakan

absorbable sutures.

E. Euthanasia Hewan Coba

Tikus perlakuan dan tikus kontrol didekaputasi pada hari ke 7 setelah

perlakuan.Pertama, dianastesi menggunakan kombinasi ketamine dan xylazine hingga

lemas.Tulang rahang di daerah interdental gigi incisive dipotong dan dimasukkan ke dalam

larutan fiksasi menggunakan buffer formalin 10% sebagai sampel penelitian.Dekaputasi

dilakukan dengan menggunakan kombinasi ketamine dan xylazine dosis tinggi dan tikus yang

telah mati dikubur.

F. Pemeriksaan Histopatologi Anatomi

Pemeriksaan histopatologi anatomi mengacu pada penelitian yang telah dilakukan

sebelumnya oleh Sularsih (2011).Bagian tikus yang digunakan dalam pembuatan sediaan

histopatologi anatomi adalah gigi incisive kiri rahang bawah beserta tulang rahang di daerah

interdental rahang bawah tikus.Pengambilan sampel rahang tikus dilakukan pada hari ke-7

setelah perlakuan.

Pembuatan sediaan dilakukan dengan cara sebagai berikut :


1. Potongan rahang tikus difiksasi dengan buffer formalin 10% selama 48 jam.

Setelah 48 jam, larutan fiksasi diganti dengan yang baru dan dibiarkan selama 48

jam. Fiksasi dilakukan untuk mencegah kerusakan jaringan dengan menghentikan

proses autolisis sel oleh enzim lisosim saat kematian sel serta menjaga agar

tidak hancur dan mengalami penyusutan selama proses dehidrasi,

embedding, dan pemotongan.

2. Setelah dilakukan fiksasi, jaringan dibilas dengan menggunakan air mengalir selama

6-9 jam.

3. Dekalsifikasi menggunakan asam nitrat. Setelah sediaan rahang menjadi lunak

dilakukan proses selanjutnya.

4. Dehidrasi dengan cara memasukkan sediaan rahang dimasukkan ke dalam botol berisi

alkohol dengan konsentrasi bertingkat dengan urutan :

Alkohol 80% selama 1 jam


Alkohol 95% 2 kali 1 jam
Alkohol absolut (100%) 3 kali 1 jam

Tahap dehidrasi ini dilakukan untuk mengekstraksi air yang terdapat dalam jaringan.

5. Clearing(penjernihan) dilakukan dengan memasukkan bahan yang telah didehidrasi

ke dalam larutan xylene sebanyak2 kali, masing-masing selama 0,5-1 jam. Pada 10 menit

terakhir proses clearing ini dinaikkan hingga 62C dengan memasukkan ke

dalam inkubator.

6. Infiltrasi ke dalam cairan parafin cair pada suhu 62C sebanyak 2 kali selama 1,5

jam.

7. Pembuatan blok parafin. Blok paraffin berisi sampel jaringan kemudian dipotong

menggunakan rotary microtomesecara serial dengan ukuran ketebalan 4 m.Hasil

potongan diletakkan di atas gelas obyek.


8. Proses penghilangan paraffin atau deparafinasi untuk menghindari gangguan saat

proses pengecatan dengan mencelupkan slideke dalam larutan xyleneselama 2

menit, alkohol 100% (absolut) selama 3 menit, alkohol 95% selama 3

menit kemudian dicuci dengan air.

9. Proses pengecatan sampel dimasukkan ke dalam larutan haematosiklin selama 5

menit untuk mewarnai inti sel, kemudian dicuci dengan air mengalir untuk

menghilangkan kelebihan cat.

10. Pengecatan dengan lithium karbonat, slide dimasukkan ke dalam lithium karbonat

selama 1-2 menit agar didapatkan inti membiru, dicuci dengan air mengalir selama 5-10

menit. Pengecatan dengan eosin agar memberikan warna pada sitoplasma,

yaitu dengan memasukkan slide ke dalam larutan eosin selama 0,5-10

menit, kemudian dicuci dengan air.

11. Sampel didehidrasi menggunakan alkohol 95% selama 1 menit dan alkohol 100%

(absolut) 2 kali 1 menit.

12. Clearinguntuk menghilangkan sisa alkohol dengan cara memasukkan ke dalam

larutan xylene sebanyak 3 kali selama beberpa menit.

13. Sediaan lalu kemudian ditutup dengan gelas penutup dan siap dilakukan

pemeriksaan di bawah mikroskop.

G. Prosedur Pengambilan Data

Perhitungan jumlah sel limfosit dilakukan dengan mikroskop cahaya dengan

pembesaran 400x pada 3 lapang pandang yang berbeda oleh dua pengamat. Daerah yang akan

diamati ditentukan terlebih dahulu yaitu bagian tepi daerah sepertiga apikal soket bekas

pencabutan gigi yang berbatasan dengan tulang alveolaris kemudian difoto dan dihitung

jumlah sel limfosit.


4.8 Alur Penelitian

Sampel tikus Rattus Norvegicus jantan

Pencabutan gigi 1 kiri rahang bawah

Irigasi saline solution

Tanpa pemberian kitosan


Pemberian
(kontrol)
kitosan beratPemberian
molekul rendah
kitosan berat molekul tinggi

Luka pencabutan gigi dijahit

Didekaputasi pada hari ke 7

Pemeriksaan HPA sel limfosit

Hasil

Analisis data
4.9 Analisis Data

Dari data hasil pengamatan penelitian, untuk menentukan data berdistribusi normal atau

tidak digunakan uji Shapiro-Wilk.Setelah itu untuk menguji homogenitas menggunakan

Levenes test.Analisis data perhitungan jumlah sel limfosit yang diperoleh kemudian

dilakukan analisa statistik menggunakan uji One way ANOVA dengan p<0.05 untuk

mengetahui adanya pengaruh pemberian kitosan dengan berat molekul rendah dan tinggi

terhadap perbedaan rerata jumlah sel limfosit pada luka pencabutan gigi. Setelah itu

dilakukan analisis Post-Hoc LSD untuk mengetahui pada kelompok mana terdapat perbedaan

yang bermakna.

Anda mungkin juga menyukai