Anda di halaman 1dari 9

MAKALAH

ELEKTROFORESIS GEL AGAROSE


TUGAS MATAKULIAH BIOTEKNOLOGI

Disusun Oleh :

Mas Danang Darto


Hilda Srivaliana Ilham K11016R091

PROGRAM PENDIDIKAN MAGISTER ILMU FARMASI


FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SURAKARTA
2017 / 2018

1
BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar belakang
Agarose gel elektroforesis adalah cara yang paling efektif untuk memisahkan fragmen
DNA dari berbagai ukuran mulai dari 100 bp sampai 25 KB. Agarose gel elektroforesis
adalah cara yang paling efektif untuk memisahkan fragmen DNA dari berbagai ukuran mulai
dari 100 bp sampai 25 KB. Agarose diisolasi dari rumput laut marga Gelidium dan
Gracilaria. Terdiri dari subunit-subunit agarobiose (L- dan D-galaktosa) yang berulang-
ulangan. Selama gelasi, polimer agarosa mengasosiasikan non-kovalen dan membentuk
jaringan bundel yang ukuran porinya menentukan sifat penyaringan molekul gel ini.
Penggunaan elektroforesis gel agarosa merevolusi pemisahan DNA. Sebelum penerapan gel
agarosa, DNA terutama dipisahkan menggunakan sukrosa sentrifugasi gradien densitas, yang
hanya disediakan perkiraan ukuran. Karena DNA memiliki rasio massa / muatan seragam,
molekul DNA dipisahkan oleh ukuran dalam gel agarosa dalam pola sehingga jarak yang
ditempuh adalah berbanding terbalik dengan log dari berat molekulnya. Tingkat migrasi
molekul DNA melalui gel ditentukan sebagai berikut:
1) ukuran molekul DNA;
2) konsentrasi agarosa;
3) conformasi DNA;
4) tegangan diberikan
5) adanya ethidium bromide,
6) jenis agarose dan
7) elektroforesis penyangga.

Setelah pemisahan, molekul DNA dapat divisualisasikan di bawah sinar uv setelah


pewarnaan dengan pewarna yang sesuai. Dengan mengikuti protokol ini, siswa harus dapat:
1. Memahami mekanisme yang fragmen DNA dipisahkan dalam matriks gel
2. Memahami bagaimana konformasi molekul DNA akan menentukan mobilitas melalui
matriks gel
3. Mengidentifikasi solusi agarose dari konsentrasi yang tepat untuk kebutuhan mereka
4. Siapkan gel agarosa untuk elektroforesis sampel DNA
5. Mengatur aparat gel elektroforesis dan power supply

2
6. Pilih tegangan yang sesuai untuk pemisahan fragmen DNA
7. Memahami mekanisme yang etidium bromida memungkinkan untuk visualisasi pita DNA
8. Tentukan ukuran fragmen DNA dipisahkan

3
BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Langkah Kerja
1. Persiapan gel
1. Timbang agarose dan masukkan dalam labu Erlenmeyer. gel agarosa disusun dengan
menggunakan persentase larutan w / v. Konsentrasi agarosa dalam gel akan tergantung
pada ukuran fragmen DNA yang akan dipisahkan, dengan sebagian besar gel berkisar
antara 0,5% -2%. Volume buffer tidak boleh lebih besar dari 1/3 dari kapasitas termos.

2. Tambahkan buffer sedikit demi sedikit ke labu yang mengandung agarose . buffer
yang paling umum adalah TAE (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) dan TBE (45 mM
Tris-borat, 1 mM EDTA).

3. Lelehkan campuran agarosa dan buffer. Hal ini paling sering dilakukan dengan
pemanasan dalam microwave, tetapi juga bisa dilakukan di atas api Bunsen. dengan
interval 30 detik, angkat, goyang-goyangkan, agar tercampur dengan baik. Ulangi
sampai agarosa telah benar-benar larut.
4. Tambahkan etidium bromida (EtBr) untuk konsentrasi 0,5 g / ml. Atau, gel juga dapat
diwarnai setelah elektroforesis dalam menjalankan buffer yang mengandung 0,5 mg /
ml EtBr selama 15-30 menit, diikuti oleh destaining dalam menjalankan penyangga
untuk panjang waktu yang sama.

Catatan: EtBr adalah yang dicurigai karsinogen dan harus dibuang dengan benar sesuai
peraturan lembaga. Sarung tangan harus selalu dipakai saat menangani gel yang
mengandung EtBr. pewarna alternatif untuk pewarnaan DNA tersedia; Namun EtBr
tetap yang paling populer karena sensitivitas dan biaya.

6. Biarkan agarosa untuk dingin.


7. Tuang agarosa cair ke dalam cetakan gel. Biarkan agarosa dingin. Hapus sisir dan
menempatkan gel dalam kotak gel. Atau, gel juga bisa dibungkus dalam bungkus
plastik dan disimpan pada suhu 4 C sampai digunakan

4
Gambar 1. Sebuah gel agarosa yang dipadatkan

2. Menyiapkan Gel Aparatus dan Pemisahan Fragmen DNA

1. tambahkan loading dye dengan sampel DNA untuk dipisahkan (Gambar. 2).

Gambar 2. Seorang mahasiswa menambahkan loading dye dengan sampel DNA-


nya.

Gel loading dye biasanya dibuat pada konsentrasi 6X (0,25% bromphenol biru, 0,25% xylene
cyanol, 30% gliserol). loading dye membantu untuk melacak seberapa jauh sampel DNA
telah berjalan, dan juga memungkinkan sampel untuk tenggelam dalam gel.
2. Program power supply dengan tegangan yang diinginkan (1-5V / cm antara elektroda).

5
3. tambahkan buffer sedikit demi sedikit untuk menutupi permukaan gel. Hal ini penting
untuk menggunakan buffer yang sama dengan yang digunakan untuk menyiapkan gel.
4. Hidupkan power supply dan memverifikasi bahwa keduanya kotak gel dan power supply
bekerja. Hapus tutupnya. Perlahan-lahan dan hati-hati dalam menambahakan sampel DNA
(s) ke dalam gel (Gambar. 3).

Gambar 3. Seorang siswa memuat sampel DNA ke gel.

Ukuran DNA marker yang tepat harus selalu dimuat bersama dengan sampel eksperimental.
5. Ganti tutup ke kotak gel. Katoda (lead hitam) harus lebih dekat sumur dari anoda (lead
merah). Periksa bahwa elektroda yang dipasang ke slot yang benar dalam power supply.
6. hidupkan daya. Jalankan gel sampai pewarna telah bermigrasi ke jarak yang tepat.

3. Mengamati fragmen DNA Terpisah

Ketika elektroforesis selesai, matikan power supply dan menghapus tutup kotak gel.
Hapus gel dari kotak gel. Mengalirkan kelebihan buffer dari permukaan gel. Tempatkan
nampan gel pada handuk kertas untuk menyerap buffer.
Lepaskan gel dari baki gel dan mengekspos gel cahaya uv. Hal ini paling sering dilakukan
dengan menggunakan sistem dokumentasi gel (Gambar. 4).

6
Gambar 4. Contoh dari sistem dokumentasi gel
pita DNA harus muncul band-band fluorescent sebagai oranye.

Gambar 5. Gambar dari posting gel elektroforesis. EtBr telah ditambahkan ke gel
sebelum elektroforesis untuk konsentrasi akhir 0,5 mg / ml, diikuti dengan pemisahan
pada 100 V selama 1 jam. gel terkena cahaya uv dan gambar yang diambil dengan
sistem dokumentasi gel.

4. Hasil Perwakilan

Gambar 5 merupakan hasil khas setelah elektroforesis gel agarosa produk PCR. Setelah
pemisahan, fragmen DNA yang dihasilkan terlihat sebagai band yang jelas. Standar DNA
atau tangga harus dipisahkan ke tingkat yang memungkinkan untuk penentuan berguna dari
ukuran band sampel. Dalam contoh yang ditunjukkan, fragmen DNA dari 765 bp, 880 bp dan
1022 bp dipisahkan pada gel agarosa 1,5% bersama dengan tangga 2-log DNA

7
8
DAFTAR PUSTAKA

Pei yun lee.2012. Agarose Gel Electrophoresis for the Separation of DNA Fragments.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4846332/. Diakses pada 5 april 2017