PROGRESS REPORT

Validasi Metode dan Penetapan Kadar Kafein dalam Minuman Energi

dengan Metode Kromatografi Lapis Tipis-Densitometri

Magdalena Siviana Yuspita148114158

Siwi Kristina Sari M 148114159

Sara Septi Widayani 148114160

Maria Euphrasia Yolanda M. 148114161

Golongan : D2

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2017
I. SKEMA KERJA
1. Pemuatan Fase Gerak

Fase gerak yang digunakan adalah fase gerak methanol : etilasetat : ammonia
25% dengan rasio 4 : 23 : 3 (v/v/v)

Fase gerak ini dibuat sebanyak 30 ml

Fase gerak dicampur pada corong pisah

Kemudian dimasukkan ke dalam chamber

2. Penjenuhan Chamber

Chamber dengan ukuran 20 x 20 cm diisi dengan fase gerak yang telah dibuat

Kemudian chamber dijenuhkan selama 30 menit

3. Pengaktivan Fase Diam

Fase diam berupa KLT silica gel 60 F254 di keringkan dalam oven selama 2
menit pada suhu 105oC

4. Penyiapan Sampel

Serbuk sampel minuman energi ditimbang

kemudian sampel ditimbang lagi setengahnya

Sampel dilarutkan menggunakan aquabides secukupnya

Kemudian dimasukkan kedalam labu takar 100ml

Kemudian ditambahkan aquabides sampai tanda batas
5. Pembuatan Larutan Stok Kafein

Baku kafein ditimbang seksama 50,0 mg

Kemudian dilarutkan dengan sedikit aquabides

Kemudian dimasukkan kedalam labu takar 5 ml

Larutan ditambahkan aquabides sampai tanda sehingga diperolah larutan
dengan konsentrasi 10.000 g/ml atau 10.000 ppm

6. Pembuatan Seri Larutan Baku Kafein

Larutan stok kafein 10.000 ppm diambill menggunakan pipet sebanyak 10, 20,
30, 40, 50, dan 60 l

Lalu masing masing dimasukkan ke dlaam mikrotube

Kemudian diencerkan hingga volume tepat pada 1 ml

Diencerkan menggunakan aquabides sehingga memperoleh larutan baku
kafein dengan konsentrasi 100, 200, 300, 400, 500, dan 600 g/ml

7. Pembuatan Kurva Baku Kafein

Seri larutan baku kafein konsentrasi 100, 200, 300, 400, 500, dan 600 g/ml
ditotolkan sebanyak 1 l menggunakan mikropipet pada plat KLT dengan fase
diam silica gel 60 F254

Lalu dikeringkan dan dikembangkan dalam chamber kromatografi yang telah
dijenuhkan dengan fase gerak

Setelah mencapai titik rambat 75 mm, lempeng dikeluarkan dan dikeringkan

Plat kemudian diukur tinggi peaknya dengan densitometer pada 274 nm.

Dilakukan replikasi sebanyak 3 kali dan dilihat juga RF dari masing masing
larutan baku kafein.

8. Penentuan recovery dan coefficient of Variations (CV) kafein dalam matrik

sampel

Sejumlah 800 l larutan sampel dimasukkan ke dalam mikrotube 1ml

Kemudian ditambahkan kafein dari larutan stok sebanyak 5 l (konsentrasi
50g/ml), 10 l (konsentrasi 100g/ml), dan 15 l (konsentrasi 150 g/ml)

Lalu ditambahkan aquabides sampai volume 1 ml, Kemudian diberi perlakuan
seperti pada poin 7

Nilai recovery digunakan sebagai parameter akurasi sementara nilai RSD

9. Penetapan Kadar kafein dalam sampel

Sampel diambil sebanyak 800l, lalu dimasukkan ke dalam mikrotube dan

ditambahkan aquabides sampai volume 1000l

Sampel ditotolkan sebanyak 1 l menggunakan mikropipet pada plat KLT
dengan fase diam silica gel 60 F254 lalu dikeringkan dan dikembangkan dalam
chamber kromatografi yang telah dijenuhkan dengan fase gerak

Setelah mencapai jarak rambeat 75mm, lempeng dikeluarkan dan dikeringkan

Plat KLT kemudian diukur tinggi puncak peaknya dengan densitometer pada
274 nm

 Dilakukan replikasi sebanyak 6 kali.

II. HASIL SEMENTARA / DATA

A. Penimbangan Baku kafein
Bobot kertas : 2,456 g
Bobot kertas + isi : 2,506 g
Bobot kertas + sisa : 2,456 g
Bobot kafein : 0,05 g

B. Perhitungan Konsentrasi Stok

50,0 mg kafein dilarutkan dalam 5 mL
C baku = 50,0 mg/ 5 mL
= 10 mg/ mL
= 10.000 g/ ml
= 10.000 ppm

C. Perhitungan larutan seri

Larutan Seri 1 Larutan Seri 2

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

10.000 g/ ml. V1 = 100 g/ ml.1000 L 10.000 g/ ml. V1 = 200 g/ ml. 1000 L

V1 = 10 L V1 = 20 L

Larutan Seri 3 Larutan Seri 4

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

10.000 g/ ml. V1 = 300 g/ ml. 1000 L 10.000 g/ ml. V1 = 400 g/ ml. 1000 L

V1 = 30 L V1 = 40 L

Larutan Seri 5 Larutan Seri 6

C1.V1 = C2.V2 C1.V1 = C2.V2

10.000 g/ ml. V1 = 500 g/ ml. 1000 L 10.000 g/ ml. V1 = 600 g/ ml. 1000 L

V1 = 50 L V1 = 60 L

D. Penimbangan Sampel
Bobot kertas : 2,652 g
Bobot kertas + isi : 5,654 g
Bobot kertas + sisa : 2,655 g
Bobot kafein : 2,999 g
 E. Pengambilan Sampel
Konsentrasi sampel = = 0,25 mg/mL = 250 g/mL
Pengambilan sampel
C1 x V1 = C2 x V2
250 g/mL x 0,8 mL = C2 x 1 mL
C2 = 200 g/mL (Sampel diambil sebanyak 0,8 mL)

F. Konsentrasi TLC-Densitometri Baku Kafein

Regresi Linear
(ppm) AUC
100 5546,1
A = 4766
200 10784,4
300 B = 15,92
8170,8
400 8187,5
R = 0,7889
500 15461,0
600 13882,1
y = 15,922x + 4766

Kurva Baku Kafein Konsentrasi vs AUC

20000

15000
f(x) = 15.92x + 4766
10000 R = 0.62
AUC
5000

0
0 100 200 300 400 500 600 700

Konsentrasi (g/mL )

G.Perhitungan Akurasi Presisi

Konsentrasi low adisi Konsentrasi medium Konsentrasi high adisi
(50 g/mL) adisi (150 g/mL)
(100 g/mL)

y = 15,922x + 4766 y = 15,922x + 4766 y = 15,922x + 4766

4782,0 = 15,922x + 9896,4 = 15,922x + 4766
1191,5 = 15,922x + 4766 4766 x = 322,22
x = -224,50 x = 1,00

y = 15,922x + 4766 y = 15,922x + 4766 y = 15,922x + 4766

3721,6 = 15,922x + 4766 5370,7 = 15,922x + 8749,1 = 15,922x + 4766
x = -65,63 4766 x = 250,16
x = 37,98
y = 15,922x + 4766 y = 15,922x + 4766 y = 15,922x + 4766
3281,2 = 15,922x + 4766 4832,4 = 15,922x + 8840,6 = 15,922x + 4766
x = -93,25 4766 x = 255,91
x = 4,17

Rata-rata = -127,79 Rata-rata = 14,38 Rata-rata = 276,09

Konsentrasi sampel tanpa adisi

y = 15,922x + 4766 y = 15,922x + 4766 y = 15,922x + 4766

3902,3 = 15,922x + 4766 6441,6 = 15,922x + 9186,4 = 15,922x + 4766
x = -54,25 4766 x = 277,63
x = 104,61

Rata-rata =

Akurasi
a. Konsentrasi low adisi (50 g/mL)
%Recovery =
%Recovery =
b. Konsentrasi medium adisi (100 g/mL)

%Recovery =
c. Konsentrasi high adisi (150 g/mL)

%Recovery =
Presisi
a. Low
SD = 84,88
Rata-rata = -127,79
RSD =
RSD =
b. Medium
SD = 20,50
Rata-rata = 14,38
RSD = =
c. High
SD = 40,05
Rata-rata = 276,09
RSD =

H. Perhitungan Resolusi
Replikasi 1 =
=
=3
Replikasi 2 =
=
 = 2,7
Replikasi 3 =
=
= 1,4

I. Perbandingan nilai Rf Baku dan Sampel

Konsentrasi seri Rf baku
baku kafein
(g/mL)

100 0,70

200 0,69

300 0,68

400 0,66

500 0,64

600 0,63

Replikasi sampel Rf sampel Resolusi Sampel

1 0,63 3

2 0,63 2,7

3 0,63 1,4

III. Pembahasan

Tujuan praktikum ini adalah menetapkan kadar kafein dalam minuman

berenergi dengan metode TLC-Densitometri. Sampel minuman energi yang
digunakan adalah Kuku Bima Energi dengan kandungan kafein dimana kafein
yang terkandung dalam Kuku Bima Energi dipisahkan dengan metode KLT.

Kafein memiliki rumus molekul C8H10N4O2 dengan berat molekul 194,19

(Kafein Anhidrat), 212,21 (Kafein Monohidrat). Pemeriannya berupa serbuk
putih atau bentuk jarum mengkilat putih, biasanya menggumpal, tidak berbau,
rasa pahit. Larutan bersifat netral terhadap kertas lakmus. Senyawa ini agak sukar
larut dalam air, dalam etanol, mudah larut dalam kloroform, sukar larut dalam
eter (Depkes RI, 1995).
 Kafein merupakan senyawa yang akan dianalisis dan merupakan senyawa
yang polar. Kafein pada praktikum ini dilarutkan dengan menggunakan air untuk
memperoleh larutan stok kafein. Larutan stok kafein ini digunakan untuk
membuat kurva baku menggunakan 6 titik. Absorbansi maksimum kafein yaitu
pada panjang gelombang 273-275 nm. Pada praktikum ini digunakan panjang
gelombang 274 nm, sesuai dengan optimasi yang telah dilakukan pada jurnal
(Riswanto, 2015).

KLT merupakan metode analisa yang cukup sederhana karena dapat

menentukan jumlah komponen yang ada pada suatu bahan, bahkan dapat pula
mengidentifikasi komponen tersebut (Soebagio, 2002). Pada kromatografi,
komponen-komponen yang akan dipisahkan antara dua fase yaitu fase diam dan
fase gerak.fase diam akan menahan komponen campuran sedangkan fase gerak
akan mengelusi. Prinsip kerja KLT adalah memisahkan berdasarkan kepolaran
fase diam dengan analit.

Fase gerak yang digunakan adalah campuran metanol : etil asetat : amonia
25% (4 : 23 : 3) sebanyak 30 mL, pemilihan fase gerak ini merupakan kondisi
optimal yang didapatkan dari jurnal (Riswanto et.al., 2015). Semakin polar suatu
pelarut atau campuran pelarut maka akan semakin jauh pelarut tersebut
menggerakkan senyawa polar naik dari titik awal penotolan. Jika senyawa non
polar yang sedang dianalisis, maka tidak akan ada peningkatan yang nyata dalam
jarak migrasi dengan peningkatan polaritas pada fase gerak (Watson, 2009).
Secara keseluruhan fase gerak ini bersifat polar. Dilakukan penjenuhan chamber
dengan kertas saring yang bertujuan untuk mengetahui apakah fase gerak sudah
siap digunakan untuk mengelusi senyawa yang akan dianalisis.

Fase diam yang digunakan adalah silika gel F254 yang bersifat polar dan akan
berfluoresensi pada panjang gelombang 254 nm. Fase diam lebih polar
dibandingkan fase gerak sehingga pada praktikum ini KTL yang digunakan
termasuk fase normal. Pada saat elusi kafein akan cenderung tertahan pada fase
diam karena sifatnya polar.

Kurva baku yang diperoleh adalah r=0,7889 sehingga untuk praktikum

selanjtnya perlu dilakukan pembuatan kurva baku kembali karena belum
memenuhi kurva yang baik yaitu mendekati 1. Persamaan kurva baku yang
didapatkan adalah y = 15,922x + 4766. Dengan menggunakan persamaan kurva
baku, maka konsentrasi sampel adisi dapat dihitung. Pengukuran konsentrasi
sampel untuk masing-masing variasi konsentrasi (low, medium, high) dilakukan
replikasi masing-masing konsentrasi sebanyak 3 kali dan didapatkan hasil
-224,50; -65,63; dan -93,25 dengan rata-rata -127,79 untuk konsentrasi low. 1,00;
37,98; dan 4,17 dengan rata-rata 14,38 untuk konsentrasi medium. 322,22;
250,16; dan 255,91 dengan rata-rata 279,09 untuk konsentrasi high. Pada
peritungan kadar sampel tanpa adisi juga dilakukan replikasi sebanyak 3 kali dan
didapatkan hasil -54,25; 104,61; 277,63 dengan rata-rata 109,33. Keakurasian
 data diukur melalui persen perolehan kembali (recovery) pada masing-masing
konsentrasi, persen recovery untuk konsentrasi low didapatkan -474,24%,
-94,95% untuk konsentrasi medium; dan 111,17% untuk konsentrasi high. Presisi
data diukur menggunakan SD dan RSD pada masing-masing konsentrasi.
Didapatkan SD=84,88 dan RSD=-66,42% untuk konsentrasi low; SD=20,50 dan
RSD=142,56% untuk konsentrasi medium dan SD=4005 dan RSD=14,51% untuk
konsentrasi high.

Dari hasil percobaan, kadar kafein yang didapat pada konsentrasi low minus
yang menandakan bahwa konsentrasinya terlalu kecil sehingga tidak masuk
dalam range kurva baku. RSD yang dihasilkan pada konsentrasi low juga minus
yang menunjukkan tidak presisinya data.

IV. Saran
1. Sampel 1 sachet mengandung 50 mg kafein, saran penyajian dalam 200 mL
air. Dilarutkan sachet (25 mg) dengan 100 mL air.
2.