Produção de Vacinas

Vacinas Bacterianas
Vacinas Virais
Apontamento Histórico

Jenner (1749-1823)

Vacinação da Varíola remonta ao sec VI
na China

Vacinação controlou 9 doenças em
algumas partes do mundo:varíola,
sarampo, difteria, pliomielite, rubéola,
febre amarela, tétano

Progressos: contra a gripe, hepatite B
Vacina da Varíola (trabalhos de
Jenner)

Ordenhadeiras
lesões nas mãos

Durante epidemias elas não contraiam a
doença (variante humana)

Retirou material das lesões da varíola
bovina

Injectou em si próprio

VACINAS derivado do termo latino VACCA
Antigenes do vírus Antigenes do vírus
da varíola
humana ≈ da varíola
bovina

Mas com gravidade diferente

Antigenes????
Antigene

Substâncias de natureza proteica,

polissacaridica ou constituídos por
outros compostos ligados às proteínas
 Estimula
antigenes Produção de anticorpos
Hospedeiro
IMUNIZAÇÃO
Microrganismo O hospedeiro não
contrai a doença
provocada pelo
microrganismo
Antigene Hospedeiro
invasor

Induz o mecanismo de defesa a produzir anticorpos

Tipos de imunidade conferida
por vacinas

Baseia-se em:
• Resistência específica
é activa contra um
determinado microrganismo patogénico (ex:
anticorpos que neutralizam vírus da raiva)

• Imunidade do hospedeiro (inespecífica ou

natural)
activas contra diferentes espécies
de microrganismos
Imunização activa

Artificialmente adquirida
indução da
formação de anticorpos através da introdução
artificial do antigene

Naturalmente adquirida
introdução do

antigene acidental (ferida, via oral)

Ex: Poliomielite – penetra pelo trato digestivo. Se houver

no sangue anticorpos específicos induzidos em
número suficiente, que impeçam que o vírus atinja o
sistema nervoso central, não há problema.
Imunização passiva

Naturalmente adquirida
transferência de
anticorpos para o feto através da placenta

Artificialmente adquirida
os anticorpos são

injectados no organismo proporcionando
protecção imediata
(ex: soro antidiftérico (contendo anticorpos de cavalo contra a
exotoxina diftérica)
Acção de antibiótico ≠ soro diftérico
O antibiótico impede a reprodução e excreção da toxina mas
não é eficaz contra a substância já presente
Principais tipos de vacinas

Cólera (Vibrio cholerae)
Poliomielite

Febre Tifoide (Salmonella
Varíola
typhi)

Raiva

Tuberculose (Mycobacterium
bovis)
Rubéola

Difteria (Corynebacterium
Influenza
diphterae)

Sarampo

Tétano (Clostridium tetani)

Febre amarela

Peste (Yersinia pestis)

Meningite (Neisseria
meningitidis)

Pneumonia Lombar (
Diplococcus pneumoneae)
Fermentação na produção de
vacinas
Volume do inoculo necessário depende de:

Condução dos processos fermentativos, logo da

[microrganismos] e [antigenes] obtidos;

Via de aplicação da vacina (parenteral ou oral)

Posterior purificação do antigene
• > nº requerido para pureza especificada

• > o volume necessário a 1 dose humana
Ampliação de Escala
(obstáculos)

A) vacinas virais preparadas e rotina com
matéria prima (ex: pele de bezerro, ovos de
galinha) são problemáticos quando em grande
escala

B) Alguns processos ainda são desenvolvidos

em institutos e laboratórios

C) cultivo de bactérias patogénicas e vírus

exigem condições complexas.
Produção de Vacinas
(processo unitário)
a) Temperaturas de cultivo ≈ 37ºC
b) Meios de cultivo com composição
complexa
c) Volumes de meios de cultura < do que
noutros processos industriais (25-
3500L)
Produção de Vacinas
(processo unitário)
d) A natureza complexa dos meios, o pH óptimo
≈ 7,5 e a temperatura, sendo condições
favoráveis à proliferação de larga gama de
microrganismos patogénicos, exige estrita
assepsia e protecção especial dos
operadores contra infecções acidentais

e) As substâncias de interesse (os antigenes)

não constituem o principal produto
metabólico
Produção de Vacinas
(processo unitário)
f) Os efeitos colaterais decorrente da
aplicação da vacina devem ser
minorizados

g) Nem sempre é possível saber a eficácia

da vacina durante o processo de
cultivo, a mesma baseia-se em efeitos
observados em animais de laboratório
 Vacinas Bacterianas
Classificação/Processos de
Produção

Segundo localização do antigene (corpo

bacteriano ou meio):

• Partículas (ex: cólera, BCG, febre tifoide)

• Não particuladas (toxoides: diftérico tetânico)

Pode influenciar tratamento final aquando da produção da vacina

 Vacina contra cólera e febre
tifóide (enterobacterianas)

Infecção transmitida Homem – Homem,
alimentos e água;

Bactérias Gram-

Problemas no trato gastro-intestinal

Reproduzem-se em meios simples

Igual meio de cultivo e processamento
posterior;
Cólera - Apontamento Histórico

Vibrio cholerae – descoberto por KocK

Doença originária na India e Paquistão

Melhoria das condições sanitárias restringiu a
doença

Variedade benigna “El Tor”

Melhor imunidade conseguida por uma vacina
contendo estirpe atenuada (Inaba e Ogawa)

Aplicação da metodologia do DNA
recombinante
Febre Tifoide – Apontamento
Histórico

Doença descrita por Budd em 1856

Bacilo responsável descrito por Berth
em 1880

Isolado por Gaffky (disc. Kock) 1884

Salmonella typhi penetra pela via

digestiva e atinge corrente sanguínea
 Vacina

Bacterias de S. typhi (estirpe Tyz de
Felix)
tradicional

Inactivada pelo calor a 53ºC por 1 hora

Preservada em fenol a 0,5 %
Ou

acetona ou álcool + suspensão da bactéria

liofilização
Cultivos submersos podem ser
realizados em fermentador:

- Meio de cultura simples (c/ ext.Levedura e

glicose, adicionada aos poucos senão  teor de
antigenes )
- pH 7,3 -7,6
- Tendo em consideração que são
aeróbios obrigatórios
- Fase estacionária ao fim de 6-8 horas de
fermentação
BCG – Apontamento Histórico

1882 – relacionou a etiologia da
tuberculose à Mycobacterium tuberculosis
(tipo humano)

Crescimento muito lento em meio sólido

Kock tentou obter vacina inactivando o
agente por calor, formalina, outros
quimicos
Continuação

Calmette (1921) suspeita que imunidade é
adquirida pela presença de microrganismos
vivos

Desenvolvimento de uma estirpe atenuada de
Mycobacterium bovis

Foram precisas 250 sub-culturas com meio de
batata, glicerina e bilis bovina

Estirpe conhecida por Bacilo Calmette-Guerin
(BCG)

Administração oral (-eficaz) ou parenteral
Método de Cultivo
Cultivo estático
- elevado nº de frascos
- p/ compensar crescimento lento e
dispersão bacilar
desagregação com
esferas em moinho de bolas (que causa
morte de 40-60%)
- Adição de tensioactivos p/ facilitar a
dispersão bacilar sem gd agitação
Cultivo submerso
Produto final mais viável (7x) para mesma
quantidade de biomassa

Bactérias cultivadas em profundidade mais

resistentes a posterior liofilização.
Combinação meio/estirpe/geometria
de fermentos

 perda de viabilidade durante cultivos
prolongados

 efeitos tóxicos dos tensioactivos

Manutenção de assepsia dt 8 dias de cultivo
com agitação

O facto do pH ser +- 7,5  o risco de
contaminação

< imunogenicidade em cobaias quando
comparado com a estática

Respeitar normas da OMS
Toxoides – mléculas de toxina
modificada

As toxinas:
- São de natureza proteica
- Posteriormente submetidas a um
destoxificação
- Sem alterar propriedades imunogenicas
Método para detectar presença
de toxinas no meio

Toxina + Soro com anticorpos contra esta toxina

(antitoxina)

Floculação visível a olho nu


Exotoxinas –
• termolábeis
• Originam anticorpos específicos
• + facilmente excretadas pela célula

Endotoxinas –
• termoestáveis
• Não induzem formação de anticorpos específicos
• Além de proteínas contêm lipopolissacáridos
Classificação das exotoxinas
segundo tipo de libertação
a) Toxinas ligadas firmemente às células
libertadas (ex: toxina da Pasteurella pestis)
b) Difundem-se livremente no meio de cultura
durante a reprodução microbiana
[intracelular]≈[extracelular] (ex: toxina diftérica)
c) Difundem-se no meio mas
[intracelular]>[extracelular] (ex: Clostridium sp.)
Toxoide Diftérico

Corynobacterium diphtheriae (35ºC)

Vacina descoberta por Behring

Toxina é um polipeptido, molécula com dois
fragmentos A ( responsável pela toxicidade) e
B (responsável pela penetração na célula).

Anticorpos para B protegem da infecção

Há efeitos colaterais (febre) devido à presença
de proteínas estranhas no toxoide
Método de cultivo

Meio de cultura desenvolvido por Linggod e
Fenton, inclui extracto de carne bovina, ext.
levedura e Maltose

A presença de ferro é prejudicial à formação
da toxina

A quantidade dissolvida no meio proveniente
do inox dos contentores está abaixo do
prejudicial

O crescimento bacteriano não é inibido

podem ser usados outros materiais como vidro
e alumínio;

Formação da toxina não está associada à
reprodução bacteriana

Actividade torna-se mensurável a partir da
fase de declínio (48h de fermentação)

pH baixa de 7,8 → 7,5

Com arejamento insuficiente pH baixa de 7,8
→6,5
< produção de toxina
Maltose Glicose Ác. orgânicos CO2 + H2O
1 2 3

Formico Depende:
Acético Disponibilidade do oxigénio
Lactico livre
Propionico  arejamento
+ lenta
Succínico logo acumulação dos ác.
Orgânicos
e acentuada  do pH

Acumulação dos ácidos depende da rapidez de fornecimento

da glucose e de oxidação dos ácidos

[ácidos]
 [toxina] > arejamento > produção toxina

Processo Industrial
Fermentação
Separação das bactérias, do meio onde
se encontra toxina
Filtração Tangencial
Separação dos nutrientes
Filtração Molecular residuais e dos metabolitos
da toxina
Cromatografia Moléculas separadas por tamanho e carga

Desnaturar a toxina pela acção do

Destoxificação formaldeido a 37ºC, 4-6 semanas
Purifica e concentra toxoides
Cromatografia nos padrões estabelecidos

Filtração esterilizante
Mistura com toxoide tetânico
Tétano – Apontamento Histórico

Clostridium tetani – Bacilo Gram +

1884 – descoberta natureza infecciosa

1889 – Kitasato isola microrganismo in
vitro

1890 – descoberta da toxina por Faber
Toxoide Tetânico
Cultivo de bactérias

Produz esporos termoestáveis

É estritamente anaeróbio

N insuflado pode levar a contaminação
acidental

Meio de cultura desenvolvido por Mueller e
Miller (modificado por Latham) constituído por
um produto da digestão enzimática da caseína
(N2case), infusão de coração de bovino, sais
minerais e vitaminas
Toxina Tetânica ≠ Toxina Diftérica

Tetânica:
Diftérica:

Já está presente no
Não se observa
interior da célula em acumulação
quantidade intracelular na fase
considerável em de crescimento.
estágios precoces
da fermentação
Processo Industrial
Fermentação

Filtração Tangencial

Filtração Molecular

Cromatografia
Usar formaldeido, mistura
permanece a incubar a 37ºC, 4
Destoxificação semanas – fazer controlo de
toxoides – se houver toxicidade
Cromatografia adicionar mais formaldeido

Filtração esterilizante Filtro de 0,22 صm

 Controlo do Toxoide

Toxicidade específica

Ausência de contaminantes

Conteúdo e potência do antigene

Engenharia Genética – esforços para obtenção de peptidos

Sintéticos para diminuir os efeitos colaterais
Vacinas Virais

Reprodução dos vírus em culturas in
vitro
em células animais (em órgãos
como rins de macaco ou cobaia)

Cultura estática

Cultura submersa
Cultura estática

Cultura sem agitação em 1 ou mais camadas
de células até a superfície do meio ficar
coberta destas

Inoculação com os vírus

que se propagam podendo causar lise ou não

separação, purificação inactivação (ou não)
Desvantagens

Frequentes operações de inoculação de
frascos, trocas de meio e colheitas

> risco de contaminação
Cultura submersa

Em condições homogéneas, submersa,
em suspensão



Reprodução de células

Constante agitação do meio

Em biorreactores (apropriados)
Vantagens

 risco de contaminação

< mão de obra envolvida

Já há equipamento para controlo das
condições (pH, O2 dissolvido, temperatura,
volume de entrada e saída)

Condições ambientais constantemente
favoráveis

> Uniformidade dos lotes de vacinas obtidos
Desvantagens
1) Difícil manter uma suspensão de
células individuais (pode-se promover a
adesão dessas células sobre esferas
microscópicas ou microcarregadores
que permanecem em suspensão graças
à agitação mecânica do meio)
Desvantagens
2) Quando  a escala
2.1. problemas na definição de necessidades nutricionais
de cultivo
2.2. acumulação de subprodutos do metabolismo e sua
remoção
2.3. transferência de O2 no biorreactor
2.4. Sensibilidade das células às restrições físicas e
fisiológicas no crescimento (tensões devido à agitação,
limitações de transporte em situação de alta [células]
2.5. adopção de métodos de monitorização e controlo do
processo
Sistemas de agitação
Devem:

Permitir adesão das células aos
microcarregadores

Evitar efeitos mecânicos decorrentes da
agitação que levem ao rompimento das
membranas celulares

Evitar arejamento excessivo
Vacinas
Humanos Veterinários
Poliomielite Febre Aftosa
Sarampo Raiva
Rubéola Encefalite equina
Influenza Febre bovina
efémera
Advances in
Raiva Doença de Biotechnological Processes
Newcastle Animal and Human Virus
Herpes Vaccines

Varicela
Esquema do processo de vacina
da Influenza