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Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnologa

Ingeniera Enzimtica

Sergio Huerta Ochoa


UAM-Iztapalapa
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Sntesis de compuestos orgnicos


Naturaleza Industria qumica
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La naturaleza de las enzimas

1) La reaccin qumica se lleva a cabo


bajo condiciones suaves
2) Accin especfica de acuerdo a la
clase de enzima
3) Tasas de reaccin muy rpidas
4) Numerosas enzimas para diferentes
objetivos
Enzymes at work (www.novozymes.com)
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Enzimas tpicas usadas en procesos industriales


Clase Enzimas Industriales
1. Oxidoreductasas Peroxidasas, catalasas, glucosa
oxidasas, lacasas
2. Transferasas Fructosil-transferasas, glucosil-
transferasas
3. Hidrolasas Amilasas, celulasas, lipasas,
pectinasas, proteasas, pululanasas
4. Liasas Pectato-liasas, -acetolactato
decarboxilasas
5. Isomerasas Glucosa isomerasa

6. Ligasas No son usadas actualmente

Enzymes at work (www.novozymes.com)


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Nomenclatura
El cdigo de cada enzima consiste de las letras "EC" seguida de cuatro nmeros
separados por puntos. Esos nmeros representan progresivamente una clsificacin
ms fina de la enzima.

Por ejemplo, la amino peptidasa tripptida tiene el cdigo


"EC 3.4.11.4"

Cuyos componentes indican los siguientes grupos de enzimas:

EC 3 son hidrolasas (enzimas que usan agua para romper otra molcula)
EC 3.4 son hidrolasas que actan sobre enlaces peptdicos
EC 3.4.11 son aquellas hidrolasas que enlazan el amino-terminal de un
aminocido de un polipptido
EC 3.4.11.4 son aquellas hidrolasas que enlazan el amino-terminal de un
aminocido de un tripptido
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Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos


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Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos


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Technology Prospecting on Enzymes: Application,


Marketing and Engineering
Shuang Li, Xiaofeng Yang , Shuai Yang , Muzi Zhu , Xiaoning Wang
Computational and Structural Biotechnology Journal, Volume No: 2, Issue: 3, September 2012
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Puntos principales de la aplicacin comercial de


un catalizador enzimtico

Velocidad de reaccin
(actividad cataltica)

Extensin de la reaccin
(constante de equilibrio)

Duracin de la actividad
(estabilidad)
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Energa de activacin es la cantidad de energa


necesaria para empujar a los reactantes sobre
una barrera de energa.

En el pico las molculas


estn en un punto inestable,
el estado de transicin

G es todava
slo la diferencia
entre sustratos y productos
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Reacciones catalizadas por enzimas

Por lo general, todas las reacciones de enzimas catalizadas se clasifican


en dos categoras:

1. Anabolismo - Pequeas molculas se unen entre s para formar


molculas complejas.
A + B AB
Enzima

2. Catabolismo Molculas complejas se dividen en molculas


simples.
AB Enzima
A + B
Algunas enzimas pueden catalizar ambos tipos de reaccin. La enzima
acta en ambos sentidos hasta que encuentra equilibrio.
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Diseo de biorreactores Balance de materia


F (S i S o ) = v r V reactor

F, S0

donde:
F, Si r = velocidad de reaccin
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Leyes fundamentales de la cintica


Velocidad de la reaccin
[P]

[A]0

v0

Orden de la reaccin
d[P] Orden cero
---- = v = k A P
dt
d[P] A P
---- = v = k CA Orden uno
dt

d[P] Orden dos A+B P


---- = v = k CA CB
dt
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Consideraciones al definir el orden de una reaccin

No se puede decir que todas las


reacciones poseen un cierto orden
(Reacciones complejas)

No se debe intentar deducir el orden de


una reaccin de su ecuacin
estequiomtrica
(Depende del mecanismo de la reaccin)
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Sitio activo y formacin del complejo: enzima-sustrato


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Modelo llave-cerradura

El mecanismo candado-llave de Fischer


(1894) sugiere que el sustrato se ajusta a
una cavidad en la superficie de la enzima
similar a la de una llave que entra en un
candado.
Hermann Emil Fischer (1852 -1919)

S P

k1
k cat
E ES EE
k -1
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Modelo de ajuste inducido


Daniel Koshland (1963) sugiri que la
enzima era ms flexible de lo que se
pensaba. Con un mecanismo de ajuste
inducido, el centro activo de la enzima
sufra cambios en su forma en presencia
del sustrato.
Daniel Edward Koshland (1920-2007)

Hexoquinasa
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Diferentes modelos de enlace enzima-sustrato

Efecto de proximidad y efecto de orientacin


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Los experimentos cinticos revelan propiedades


enzimticas

Cintica qumica

Los experimentos examinan la cantidad de producto


[P] / t)
(P) formado por unidad de tiempo (
Velocidad (v) la tasa de una reaccin
(vara con la concentracin de reactante)
Constante de la tasa (k) indica la velocidad o
eficiencia de una reaccin
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Cintica enzimtica
Complejo enzima-substrato (ES) - complejo formado
cuando el substrato especfico se enlaza al sitio activo de la
enzima

E + S ES E+P

Cuando [S] >> [E], cada enzima enlaza una molcula de


substrato (la enzima est saturada con el substrato)
Bajo estas condiciones la tasa depende solamente de [E],
y la reaccin es pseudo-primer orden
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Velocidad inicial (vo)


La velocidad al inicio de una reaccin catalizada
enzimticamente es
vo (velocidad inicial)
k1 y k-1 representan una rpida asociacin
/disociacin no covalente de substrato del sitio
activo de la enzima
kcat = constante de la tasa para formacin de
producto de ES
k1 kcat
E+S ES E+P
k-1
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Curva de progreso para una reaccin catalizada
enzimticamente

La velocidad inicial (vo) es la


pendiente de la porcin lineal
inicial de la curva
La tasa de la reaccin se duplica
cuando se usa el doble de
enzima
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Leonor Michaelis Maud Menten


1875-1949 1879-1960
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Consideraciones de equilibrio rpido
(Ecuacin de Henri-Michaelis-Menten)
1. Reacciones involucradas k1 k cat
E+S ES E+P
k -1
2. Balance de masa [E ]t = [E ] + [ES ]
3. Velocidad limitante v = kcat [ES ]

v k [ES ]
4. Dividir por [E]t = cat
[E]t [E] + [ES]

KS =
[E ][S ] , [ES ] = [S ] [E ]
5. Expresin de equilibrio [ES ] KS

k
[S ] [E]
cat
v KS
=
6. Sustituir en trminos de [E]
[E]t [E] + [S ] [E]
KS

v
=
[S ]
7. Donde Vmax = kcat [E]t Vmax K S + [S ]
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Briggs JBS Haldane


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Consideraciones de estado estacionario
(Ecuacin de Briggs-Haldane)
k1 k cat
1. Reacciones involucradas E+S ES E+P
k -1
d [ES ]
2. Balance de masa = k1 [E ] [S ] (k 1 + kcat ) [ES ]
dt
d [ES ]
3. En estado estacionario =0
dt
4. Constante de Michaelis [E ] [S ] = k1 + kcat = KM
[ES ] k1

5. Velocidad limitante v = kcat [ES ]

v k [ES ]
= cat
6. Dividir por [E]t [E ]t [E ] + [ES ]
[S ] [E ]
v KM
=
7. Sustituyendo [ES] k cat [E ]t [E ] + [S ] [E ]
KM
v
=
[S ]
8. Donde Vmax = kcat [E]t Vmax K M + [S ]
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Cintica de Michaelis-Menten


Vmax

Vmax [S]
= Vmax
KM + [S]
2

KM [S]
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La ecuacin de Michaelis-Menten

La Velocidad mxima (Vmax) se alcanza cuando una enzima est


saturada con el substrato (alta [S])

A altas [S] la tasa de reaccin es independiente de [S] (orden


cero con respecto a S)

A bajas [S] la reaccin es de primer orden con respecto a S

La forma de una curva vo versus [S] es una hiprbola


rectangular, indicando saturacin del sitio activo de la enzima
conforme [S] se incrementa
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Grficas de velocidad inicial (vo) versus [S]


(a) Cada punto vo vs [S] se obtiene
de un experimento cintico

(b) La constante de Michaelis (KM)


iguala la concentracin de
substrato necesario para
alcanzar de la velocidad
mxima
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El significado de KM

KM = [S] cuando vo = 1/2 Vmax


KM k-1 / k1 = Ks (es la constante de disociacin
enzima-substrato ) cuando kcat << k1 or k-1
Entre ms bajo sea el valor de KM, ms ajustado
ser el enlace del substrato
KM puede ser una medida de la afinidad de E for S
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KM y concentraciones de substrato fisiolgicas

Los valores de KM para las


enzimas son tpicamente
arriba de [S], tal que las
tasas enzimticas son
sensibles a pequeos
cambios en [S]
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Las constantes cinticas indican la actividad


enzimtica y la especificidad

La constante cataltica (kcat) constante de la tasa de orden uno


para la conversin de complejo ES a E + P
kcat es ms fcilmente medible cuando la enzima esta saturada con
S
La relacin kcat /KM , llamada tambin coeficiente de
especificidad, es una constante de segundo orden para
E+S E+P
a bajas concentraciones de [S]
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Significados de kcat y kcat/KM


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Ejemplos de constantes catalticas


Enzyme kcat(s-1)
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Valores of kcat/KM

kcat/KM puede aproximar la tasa de


encuentro de dos molculas no cargadas
en solucin (108 to 109 M-1s-1)
kcat/KM es tambin una medida de la
especificidad de la enzima por diferentes
substratos (constante de especificidad)
Aceleracin de la tasa = kcat/KM
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Determinacin de parmetros cinticos

1. Grfico

2. Linearizacin de la Ec. M-M


A. Lineweaver-Burk
B. Hanes-Woolf
C. Eadie-Hofstee
Mtodo
3. Integracin de la Ec. M-M

4. Sistema de ecuaciones diferenciales

5. Regresin no lineal
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Linearizacin de la Ecuacin de Michaelis-Menten

Lineweaver, H and Burke, D. (1934). "The Determination of


Enzyme Dissociation Constants". Journal of the American
Chemical Society 56 (3): 658666. doi:10.1021/ja01318a036

Hans Lineweaver Dean Burk


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Clculo de KM y Vmax

La grfica doble-
recproca
Lineweaver-Burk es
una transformacin
lineal de la grfica de
Michaelis-Menten
(1/vo versus 1/[S])
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Hanes-Woolf
[S ] = 1
[S ] + KM
v Vmax Vmax

v
Eadie-Hofstee
v Vmax
-KM
v = V max K M
[S ]
v/[S]
Vmax/KM
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Otra opcin es utilizar la forma integral de la ecuacin de Michaelis-Menten:


d [S ] Vmax [S ]
=
dt K M + [S ]
dejando del lado izquierdo los trminos que contengan [S] y del lado todos los que contengan t e
integrando

KM
[S ] d S [ ] d [S ] = V dt
[S ] t

[S ]0 [S ] [S ]0
max
0

Resolviendo la integral

K M ln
[S ]0
+ ([S ]0 [S ]) = Vmaxt
[S ]
[S ]
ln 0
[S ]
dividiendo entre

KM +
([S ]0 [S ]) = V t
ln
[S ]0 max
[S ]
ln 0
[S ] [S ]
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Formas lineares de la integral de la ecuacin de Michaelis-Menten:

[S ]0 [S ] = K + V t
ln
[S ]0 M max
[S ]
ln 0
[S ] [S ]

[S ]0 [S ]
ln 0
[S ]
[S ]

Vmax

t
-KM [S ]
ln 0
[S ]
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Otras formas de linearizacin


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Reacciones reversibles

K1

K2

[E ] + [S ] [ES ] [E ] + [P ]

K 1

K2

Consideracin de estado estacionario

Vmax f
[S ] V [P]
max b
KS KP
v neta =
1+
[S ] + [P]
Glucosa Isomerasa
KS KP
Donde:

Vmax f = k 2 [E ]t Vmax b = k 1 [E ]t
k 2 + k 1
k +k K mp =
K mS = 2 1 k 2
k1
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En el equilibrio

Vmax f K P [P ]eq
vneta = 0 = = K eq
[S ]eq
Relacin de Haldane
Vmax b K S

Borges da Silva y col., 2006