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Introduccin a la

Biotecnologa
Gua de clases tericas y problemas

Clase II
Licenciatura y Tecnicatura en Biotecnologa
1er Cuatrimestre 2017

- Programa Clase II
- Problemas Clase II

Universidad Nacional de Moreno - Av. Bartolom Mitre N 1891


(B1744OHC) Moreno Provincia de Buenos Aires Repblica Argentina
(0237) 466-7186/1529/4530 - (0237) 462-8629 - (0237) 460-1309 www.unm.edu.ar
Introduccin a la Biotecnologa

Universidad Nacional de Moreno


ASIGNATURA: INTRODUCCIN A LA BIOTECNOLOGA (2213)

Carrera: LICENCIATURA EN BIOTECNOLOGIA

Programa Clase 2

Primera parte: Comportamiento de cidos nuclecos en solucin, hibridacin


molecular. Modelo de replicacin semiconservativa del ADN. Experimento de
Meselson y Stahl. Concepto de replicn. ADN polimerasas. Reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR).

Segunda parte: Protenas. Estructura primaria, secundaria y terciaria. Estructura


cuaternaria: subunidades, dominios, interacciones (cooperatividad y
alosterismo).Modificaciones post-traduccionales. Enzimas, enzimas alostricas.

Primera Parte

Propiedades de los cidos Nucleicos, Replicacin del ADN:

Propiedades del ADN en disolucin:


Las disoluciones de molculas nativas de ADN pequeas, y de fragmentos grandes
de ADN, pueden estudiarse fcilmente por mtodos fisicoqumicos y tienen muchas
propiedades caractersticas comunes.

Propiedades cido base:


Los grupos fosfato secundarios que se repiten en el ADN y constituyen los puentes
entre nuclesidos, son fuertemente cidos. Los grupos fosfatos al estar en la
periferia externa de la doble hlice, es decir expuestos al agua, se combinan
fuertemente con cationes divalentes tales como el Ca2+ y Mg2+ , as como las aminas
policatinicas espermina y espermidina en procariotas, e histonas, entre otras, en
eucariotas.
La estabilidad de los puentes de hidrgeno entre las bases, en el ADN doble
cadena, depende del pH. La mxima estabilidad de los pares de bases se
encuentra a un pH comprendido entre 4 y 11. Por debajo de 4 sufre hidrlisis
cida por encima de 11 se desnaturaliza la doble hlice por rotura de puentes de
hidrogeno (el ADN se desenrolla).

Comportamiento de sedimentacin:
El coeficiente de sedimentacin y el peso molecular de muestras de ADN se pueden
determinar por los mtodos ultracentrifugacin. Los pesos moleculares pueden
establecerse por comparacin de las velocidades de sedimentacin en un gradiente
de densidad de sacarosa, con la velocidad obtenida con una muestra de ADN de
tamao y coeficiente de sedimentacin conocidos.
La sedimentacin en equilibrio en gradientes de CsCl, se utiliza en la determinacin
de la densidad de flotacin de las molculas de ADN. Cuando una disolucin de

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cloruro de cesio 8 Molar se centrifuga hasta el equilibrio en un elevado campo


gravitatorio, el CsCl se distribuye segn un gradiente lineal hacia abajo del tubo de
tal forma que en el tope la densidad es 1,55 gr/ml y en el fondo 1,8 gr/ml. Cuando
hay ADN presente durante la formacin de tal gradiente, se concentra en una banda
estable en una determinada posicin del tubo, en la cual la densidad de flotacin es
exactamente la misma que la densidad de la disolucin de cloruro de cesio. La
densidad del ADN puede calcularse por comparacin con la densidad de una
muestra standard de un ADN conocido cocentrifugado en el seno del mismo
gradiente.
ADNs intactos y homogneos de virus producen bandas muy definidas, mientras que
los fragmentos heterogneos y al azar de clulas animales superiores proporcionan
bandas anchas con una amplia extensin de distintas densidades.

Desnaturalizacin del ADN:


Las disoluciones de la forma de doble hlice del ADN experimentan cambios
significativos en varias de sus propiedades fsicas cuando se someten a: pH extremo,
temperatura, disminucin de la constante dielctrica por agregado de alcoholes y
cetonas, exposicin a la urea. En cada una de estas condiciones el ADN disminuye la
viscosidad de la disolucin, la absorcin de luz ultravioleta aumenta, la densidad de
flotacin aumenta y cambia la rotacin ptica. Este cambio fsico del ADN se
denomina desnaturalizacin del ADN (notar que los agentes desnaturalizantes del
ADN son los mismos que inducen desnaturalizacin o desplegamiento de protenas
globulares). Durante la desnaturalizacin del ADN no se rompen enlaces covalentes
pero la estructura de doble hlice se desenrolla y se separa.
Dos conjuntos de fuerzas son las responsables de mantener la estructura de
doble hlice: 1) los puentes de hidrogeno entre los pares de bases ,2) las
interacciones del apilado entre las bases sucesivas. Cuando cualquiera de los
dos conjuntos de fuerzas se interrumpe la estructura de doble hlice nativa
experimenta su transicin a una forma con lazos al azar denominado ADN
desnaturalizado o monohebra

Efecto hipercrmico:
El cambio fsico ms fcil de utilizar como medida de la desnaturalizacin del ADN
es el incremento de la absorcin luminosa observada a 260 nm y que se denomina
efecto hipercrmico. Las bases pricas y pirimidnicas as como sus
correspondientes nucletidos absorben la luz ultravioleta a 260 nm, sin embargo
el ADN doble cadena nativo absorbe mucha menos luz a 260 nm, de la que podra
predecirse por la suma de la luz absorbida por sus mononucletidos constituyentes.
Desnaturalizando el ADN de doble cadena nativo por calentamiento se observa un
gran incremento de la absorcin lumnica a 260 nm que puede llegar hasta un 40 %
segn la muestra. El total de luz absorbida por un ADN completamente
desnaturalizado es casi igual al de un nmero equivalente de los correspondientes
mononucletidos libres. El porcentaje de aumento de absorcin lumnica
inducido por calentamiento de una muestra de ADN nativo se halla
directamente relacionado con su contenido en pares de bases A-T, cuanto
mayor es la proporcin de pares A-T mayor es el incremento de absorcin
lumnica.
La absorcin lumnica, menos que aditiva, de las molculas de ADN de doble hlice
que se denomina hipocromismo se debe a las interacciones electrnicas entre las

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bases apiladas de la estructura de doble hlice nativa, que hacen disminuir la


cantidad de luz que puede absorber cada uno de los restos nucleotidicos. Cuando se
desordena la estructura de doble hlice las bases se des hacinan, y en esta forma
menos obstaculizada absorben casi tanta luz como lo haran si se hallaran en forma
de nucletidos libres.

Replicacin semiconservadora del ADN experimento de Meselson-Stahl:


Desde el punto de vista gentico, la caracterstica ms sobresaliente de la hiptesis
de Watson y Crick, es su postulado de que las dos hebras de ADN de cadena doble,
son complementarias y que la replicacin de cada una de ellas para formar nuevas
cadenas complementarias, conduce a la formacin de dos molculas hijas de ADN
doble cadena, cada una de las cuales contiene una hebra del ADN progenitor. Este
proceso se denomina replicacin semiconservadora.

MS Meselson y FW Stahl llevaron a cabo un experimento en el que demuestran


de modo concluyente, que en E coli el ADN celular se replica por el mecanismo
semiconservador.

Cultivaron varias generaciones de clulas de E coli en un medio de cultivo cuya nica


fuente de nitrgeno era un cloruro de amonio NH4Cl marcado con el isotopo pesado
de nitrgeno (N15), en lugar del N14, normal, por lo tanto todos los componentes
nitrogenados de esas clulas, incluido el ADN, contenan N15. El N15-ADN de tales
clulas (ADN pesado) posee una densidad significativamente mayor que el normal
N14-ADN, las formas pesadas y ligera del ADN pueden separarse por centrifugacin
de equilibrio en un gradiente de densidad de cloruro de cesio.

Para llevar a cabo el experimento crucial sobre el mecanismo de replicacin del


ADN, se continuo el cultivo de las clulas de E coli que contenan el nitrgeno pesado
N15, colocndolas en un medio liviano que contena cloruro de amonio N14 como
nica fuente de nitrgeno. Entonces se dej que las clulas crecieran por varias
generaciones, y se recolectaron muestras a distintos intervalos. Se extrajo el ADN de
estas muestras, se determin su densidad de flotacin por centrifugacin en
gradientes de densidad en cloruro de cesio.
Despus de la primera generacin en el medio de cultivo con N14, cuando
precisamente se haba duplicado el nmero de clulas (se calcula contando las
clulas por densidad ptica), el ADN aislado mostr una sola banda en el gradiente
de densidad, intermedia en densidad entre la del N14 ADN liviano y la del ADN N15
pesado que provena de las clulas cultivadas exclusivamente en el medio de N15.
Este resultado es el que caba esperar en el caso de que el ADN dplex de las clulas
hijas contuviera una cadena de N15 y otra de N14 del ADN recin sintetizado.
Despus de dos generaciones en cloruro de amonio N14 (liviano), el ADN aislado
exhiba dos bandas, una con densidad igual a la del ADN liviano normal y la otra igual
a la del ADN hbrido observado despus de la primera generacin. El experimento
de Meselson y Stahl fue especialmente convincente pues se efectu con clulas
intactas en divisin y sin la intervencin de inhibidores u otros agentes
interferentes. Posteriormente se verific con experimentos similares realizados en
cultivo de clulas vegetales, que la replicacin en eucariotas se realiza
semiconservativamente tambin.

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Direccin de replicacin del ADN en los cromosomas:


Se ha demostrado primero con experimentos de microscopia electrnica de
autoradiografas de clulas bacterianas con ADN marcado, y luego una serie de
experimentos genticos y bioqumicos, que la replicacin del ADN es
bidireccional. Para que ocurra la replicacin las dos cadenas del ADN deben estar
parcialmente desenrolladas, puesto que las bases cuya secuencia es la portadora de
la informacin gentica, estn situadas en el interior de la doble hlice. Si se
considera que una clula de E coli se duplica en 30 minutos el desenrollamiento del
ADN cromosomal debe ser muy rpido por ejemplo unas 400 000 vueltas del
cromosoma duplohelicoidal debern desenrollarse a una velocidad de 13 000
vueltas por minuto. Otro problema es que la direccin de sntesis es 5prima 3 prima
por ende en una de las cadenas la sntesis ser continua mientras que en la
complementaria lo har discontinuamente.
La replicacin discontinua del ADN se realiza en etapas cortas, R. Okazaki
descubri que cuando el ADN de bacterifagos infectantes de E coli, se replica
en la bacteria, el ADN recin formado o naciente, se encuentra en forma de
trozos cortos, que ahora se denominan fragmentos de Okazaki. Ello se
estableci siguiendo la incorporacin de timidina tritiada al ADN en las clulas
infectadas e incubadas a bajas temperaturas para disminuir el ritmo de la
replicacin. Todo el ADN marcado que se forma durante intervalos muy cortos
despus de adicionar la timidina marcada, se encuentra, virtualmente en pequeos
fragmentos de 1000 a 2000 restos, con un coeficiente de sedimentacin de solo 8S a
10S. Sin embargo, si las clulas se exponen a la timidina marcada durante largos
periodos, la radioactividad se encuentra, exclusivamente, en el ADN de elevado peso
molecular. Estos experimentos indican, por tanto, que el ADN se replica en trozos
cortos que son rpidamente unidos entre s, mediante enlaces covalentes,
catalizados por la enzima ADN ligasa. Se vio que en bacterias que poseen una
mutacin tal, que carecen de la enzima ADN ligasa, se acumulan grandes cantidades
de fragmentos cortos de ADN.

La sntesis de ADN se produce por una enzima denominada ADN polimerasa


que cataliza la unin fosfodister entre una cadena de ADN naciente con un
nucletido entrante.
La primera ADN polimerasa fue descubierta por A. Kornberg, posteriormente se
descubrieron otras dos ADN polimerasas actualmente se las denomina ADN Pol I, II,
III.
La Pol III es principal responsable de la replicacin, si bien la Pol I tambin participa
en el desempeando el papel de reparacin de errores durante la sntesis de las
nuevas cadenas.
Los estudios detallados de A. Kornberg sobre la Pol I aislada de E coli, cataliza la
adicin de restos desoxiribonucleotdicos al extremo de una cadena de ADN a partir
de una mezcla de dATP, dGTP, dCTP y dTTP.

La reaccin global de incorporacin de un solo resto es:

dNTPs + ADN en crecimiento + Enzima ADN Polimerasa = ADN prolongado +


PPi(pirofosfato)

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Esta reaccin requiere magnesio Mg2+.


La reaccin no tiene efecto en ausencia de ADN preformado.

La actividad enzimtica se valora midiendo la incorporacin del fosforo radiactivo


de un grupo fosfato de un nucletido marcado en posicin alfa , (es el fosfato que
pasara a ser parte de la unin fosfodister), internucleotidica 3 prima 5 prima, de
la cadena de ADN prolongada.
Debido a que la macromolcula de ADN es insoluble en medio acido, se puede as
separar la cadena naciente marcada de los precursores marcados.

La enzima requiere especficamente la presencia de los 4 5 prima trifosfatos de los


desoxyribonucleosidos (dNTPs) y el catin Magnesio Mg2+.
La ADN polimerasa I cataliza la adicin de unidades mononucleotdicas al
extremo con el hidroxilo 3 prima libre de una cadena del ADN, la direccin de
la sntesis de ADN es por lo tanto 5 prima 3 prima.

La energa requerida para formar el nuevo enlace fosfodister viene proporcionada


por la escisin del pirofosfato del dNTP, que genera una liberacin muy alta de
energa qumica.
La ADN Pol I pura puede incorporar unos 1000 restos nucleotdicos por minuto y
por molcula de enzima a 37 C.

La ADN polimerasa I cataliza tambin otras dos reacciones. Una de ellas es su


actividad de exonucleasa 3 prima 5 prima es decir la hidrlisis de restos
nucleotdicos aislados del extremo 3 prima de una cadena de ADN. La otra
actividades la de exonucleasa 5 prima 3 prima, esto es la hidrlisis de restos mono
nucleotdicos del extremo 5 prima de una cadena de ADN. Ambas actividades
exonuclesicas desempean un importante papel en el funcionamiento de la ADN
polimerasa I.

Las cadenas polipeptdicas de la enzima ADN pol I, pueden escindirse en dos


fragmentos por la accin de determinadas enzimas proteolticas (hidrolizan
cortando uniones peptdicas).
El fragmento mayor contiene la actividad de DNA polimerasa y de exonucleasa 3
prima 5 prima; el fragmento pequeo exhibe solamente actividad de exonucleasa 5
prima 3 prima.
Una mezcla de ambos fragmentos es similar a la enzima intacta en actividad
cataltica, se puede pensar que la molcula de enzima ADN pol I contiene en realidad
dos enzimas una ADN polimerasa con actividad exonucleasa 3prima 5 prima y la
otra una exonucleasa 5 prima 3prima, unidas ambas por un enlace peptdico.
Las clulas eucariticas contienen muchas formas de ADN polimerasas de diferentes
pesos moleculares, localizadas en diferentes compartimientos celulares, ncleo,
citoplasma, mitocondrias.

La propiedad ms relevante y caracterstica de la ADN polimerasa es que


requiere la presencia de algo de ADN preexistente. En su ausencia, la enzima
purificada no producir sntesis alguna.

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Kornberg investig las caractersticas estructurales del ADN preformado, que son
esenciales para la actuacin de la altamente purificada ADN polimerasa I de E coli.
Es significativo que el ADN duplohelicoidal nativo e intacto del que cabra esperarse
actuara como patrn para la replicacin, sin embargo no apoya la sntesis de ADN
En cambio los ADNs desnaturalizados, especialmente aquellos cuyas dos cadenas
estan, en su mayor parte separadas, son activos como patrones. Por otra parte todos
los ADNs desnaturalizados de muy diversos orgenes pueden sustentar la actividad
de la ADN pol I de E coli. Tambin se muestran activos aquellos ADNs doble cadena
que tienen una cadena mellada (se define como una rotura que produce la existencia
de un grupo 3 prima libre y otro 5 prima libre, situados en restos adyacentes), as
como los ADNs doble cadena que poseen un hueco o o brecha en una de sus cadenas.
El ADN monocatenario puede apoyar tambin la accin de la ADN polimerasa
porque puede formar una horquilla de extremos desiguales con formacin de un
dplex intracatenario.
A partir de tales experimentos se ha llegado a la conclusin de que el ADN
preformado ejerce dos funciones en la accin de la ADN polimerasa I: es requerido,
a la vez como patrn y como cebador. La enzima requiere la presencia de una
cadena de ADN que tenga un hidroxilo 3 prima libre, al cual se adicionan los
nuevos restos nucleotdicos para extender la cadena en direccin 5 prima 3
prima. A dicha cadena se la denomina cadena cebadora, (primer) y al nucletido 3
prima terminal se le designa terminal cebador.

Durante la replicacin del ADN aparte de la accin de la polimerasa, deben coexistir


otras actividades enzimticas que desenrollen la doble hlice y que hagan que ADN
tenga una topologa especial a fin de exponer las bases. Estas actividades son
llevadas a cabo por las enzimas girasas, helicasas y topoisomerasas. Todas
contribuyen a estabilizar la conformacin tridimensional ptima de la molcula de
ADN durante su replicacin.

Conceptos introductorios acerca de cmo el ADN transmite la informacin:


La informacin contenida en la secuencia de bases del ADN se transmite por una
molcula intermediaria el ARN, el proceso se denomina transcripcin y es llevado a
cabo por la enzima ARN polimerasa, dicha enzima emplea como molde al ADN para
sintetizar una molcula de ARN, se copiar una u otra cadena del ADN. Los ARNs
son molculas de cadenas simples (mono hebra) aunque adoptan por formacin de
puentes de hidrogeno intracatenarios estructuras secundarias de doble cadena.
Lo que determina que cadena se copia es la presencia de secuencias seal
denominadas promotores las cuales son reconocidas por la ARN polimerasa y a
partir de las mismas comienza la transcripcin.
Bsicamente existen tres tipos principales de ARN (mensajero de transferencia y
ribosomal)
ARN mensajero:
En los primeros experimentos de incorporacin de aminocidos a protenas
marcados en sistemas libres de clulas se vio que la incorporacin cesaba si se
trataba al sistema con ribonucleasa. La actividad de incorporacin (sntesis de
protenas) se restableca si se agregaba un RNA exgeno (primero de la misma
fuente del sistema libre de clulas, luego de cualquier otra especie). Este
experimento conduce a la hiptesis de que el RNA de alguna manera transportaba
informacin codificante para la sntesis de protenas

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El flujo de la informacin desde el ADN, por transcripcin hacia el ARN y de


este por su traduccin a protenas, se conoce como dogma central de la
biologa molecular.
Ntese que en la transcripcin no se modifica el lenguaje es una copia literal, la
informacin contenida en secuencia de bases (ADN) pasa a una molcula
informativa similar (ARN), manteniendo el lenguaje en la secuencia de bases.
En la traduccin existe un cambio de lenguaje, la informacin contenida en la
secuencia de bases del ARN, se traduce a otro lenguaje: la secuencia de aminocidos,
unidos por uniones peptdicas originando protenas.

En la dcada del 70 el dogma sufri una modificacin originada por la actividad de


una ARN polimerasa que puede sintetizar ADN a partir de ARN, el fenmeno es una
transcripcin reversa.

Aminocidos, Pptidos y Protenas:

Conceptos
Las protenas son cadenas de aminocidos ligados por uniones peptdicas

Protena del griego proteion: preeminente


Considrese que sin protenas no existe vida, estn presentes en cada clula, en cada
organela.

Pueden ser estructurales o enzimticas

Protenas conjugadas unidas a porciones no proteicas (grupos prostticos)


Glicoprotenas (azcar)
Nucleoprotenas (ac nuclicos)
Lipoprotenas (lpidos)
Cromoprotenas (pigmentos) hemoglobina mioglobina
Grupo prosttico hemo compuesto orgnico que contiene hierro y combina oxgeno.

Niveles de organizacin estructural


Estructura primaria formada por la secuencia de aminocidos
Contiene la informacin que determina los dems niveles de organizacin

Estructura secundaria

Configuracin espacial:

Alfa hlice
Forma de cilindro, la secuencia de aminocidos se enrolla sobre un cilindro
imaginario por formacin de puentes de hidrogeno ntrelos grupos NH2 de unos
aminocidos con los grupos carboxilo de otros situados cuatro posiciones ms
adelante en la misma cadena

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Hoja plegada beta


Unin por puentes de hidrogeno laterales entre grupos amino y carboxilo de la
misma secuencia formando una estructura plana en forma de hoja.

Estructura terciaria
Es consecuencia de plegamiento de las estructuras secundarias generando una
conformacin tridimensional ms compleja
El plegamiento se origina porque aminocidos ubicados en lugares distantes entre
s, en la cadena se relacionan qumicamente. Segn este plegamiento se originan
protenas fibrosas o globulares.

Fibrosas: secuencias enteras o tramos con estructuras secundaria alfa hlice


Globulares: secuencias con estructura alfa hlice o hoja beta o ambas
combinadas.

Estructura Cuaternaria combinacin de dos o ms polipptidos: macromolculas


de gran complejidad estructural
Ejemplo hemoglobina (una de las primera estructuras determinadas mediante
anlisis de difraccin de rayos X por la molcula de protena cristalizada)
La macromolcula est conformada por la integracin 4 cadenas polipeptdicas.

Dominio proteico: zona de la protena donde se halla la mayor densidad, es decir


donde hay ms plegamientos.
Una cadena puede tener uno o ms dominios.
Una protena formada por ms de una cadena los de cada una son sus dominios,
tambin pude ocurrir que una protena formada por dos cadenas constituya un solo
dominio compartido por ambas.

Dominio funcional: lleva a cabo una funcin bioqumica ejemplo sitio hemo de la
hemoglobina o sitio cataltico de una enzima.
Dominio estructural componente estable de la estructura.

Actualmente existen mtodos computacionales que permiten generar en funcin de


una dada secuencia nucleotdica, su correspondiente secuencia aminoacdica y cul
es la conformacin tridimensional, ms probable de la misma, este aspecto es de
suma importancia biotecnolgica pues se pude predecir a priori cual ser el
comportamiento biolgico de una determinada secuencia

Distintos tipos de uniones qumicas determinan la estructura de la protena:


A parte de las uniones peptdicas estn las uniones covalentes generadas por grupos
SH dos aa (cistenas) que posean este radical podrn formar una unin covalente de
puente disulfuro S-S,

Uniones no covalentes son las uniones dbiles tipo ptes de H, uniones inicas o
electrostticas, interacciones hidrofbicas e interacciones de Van der Waals.

La diferencia fundamental entre las uniones covalentes y las otras es la energa


necesaria para su ruptura para la covalentes se requiere 110 kcal por mol mientras
para un pte de H 4,5 kcal mol, sin embargo un conjunto numeroso de uniones

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dbiles, mediante efecto cooperativo, hace que la estructura molecular se vuelva


estable tal como ocurre con las cadenas de cidos.

Las protenas tienen cargas positivas y negativas pero en el pto. Isoelctrico la carga
neta es cero. El pH del medio en el cual se encuentra una dada protena es el que
dar su carga de acuerdo a como estn ionizados los distintos grupos de los aa.

Las protenas enzimticas catalizan las reacciones qumicas in vivo e in vitro.


Una clula (proceso in vivo) y un extracto celular (in vitro) puede compararse como
un pequeo laboratorio donde ocurren reacciones de sntesis y degradacin de
molculas, estos procesos son efectuados por enzimas, Estos proceso ocurren a una
determinada temperatura. y rango de pH. El proceso en si es una catlisis qumica
la cual se caracteriza por acelerar las velocidades de reaccin sin que el
catalizador se modifique, permitiendo ser reutilizado.
La catlisis enzimtica ocurre, especficamente en el sitio activo (dominio cataltico)
de la enzima, en l se une al sustrato de forma reversible logrando ya sea, la unin
covalente de tomos del sustrato (sntesis) o su ruptura (degradacin).

Sin enzimas, tales reacciones nunca ocurriran en las condiciones de temperatura,


presin, pH del ambiente celular, Las enzimas permiten acelerar las velocidades de
reaccin en ordenes cientos a miles de millones ms rpidas que en ausencia de
catalizador, haciendo viable la ocurrencia de la reaccin en las condiciones celulares.
La caracterstica ms importante de la reaccin enzimtica es su especificidad, es
decir que una dada clase de enzima acta sobre un solo sustrato, ejemplo: la ADN
polimerasa solo forma uniones fosfodiester empleando como sustratos a los
desoxiribonucleotidos.

Debe considerarse que la unin enzima - sustrato (ES) en el sitio activo no es


una unin en la cual intervienen molculas estructuralmente rgidas (modelo
llave cerradura) sino que ambas molculas luego de haberse unido se hacen
complementarias, la unin del sustrato induce un cambio conformacional en
la enzima permitiendo que el sitio cataltico entre en intimo contacto con el
sustrato, mediante interacciones no covalentes (Van der Waals, ptes. de H,
hidrofbicas) cuyo radio de accin es muy limitado, esto explica la naturaleza de la
exactitud de la complementariedad que debe existir para formar el complejo enzima
- sustrato

El comportamiento cintico de las enzimas se define por dos parmetros la


afinidad por el sustrato (KM) y la velocidad de reaccin mxima (Vm).

Las reacciones enzimticas se realizan en dos etapas

1.- Formacin del complejo enzima sustrato [ES]

2.- El complejo origina el producto y la enzima liberada [E+P]

Ambas etapas estn regidas por constantes de velocidad de reaccin (K). La


constante KM se obtiene de graficar velocidad de reaccin vs concentracin de
sustrato, la curva es una hiprbola donde la primera parte es una recta: la velocidad

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es proporcional a la concentracin de sustrato (reaccin de primer orden), luego se


alcanza una meseta donde se llega a la velocidad mxima, meseta orden cero pues
la velocidad es independiente de la concentracin de sustrato. Todas las molculas
de enzimas estn formando el complejo ES.
El KM es el valor de concentracin de sustrato para el cual se obtiene la mitad
de la velocidad mxima es una medida de la afinidad de la enzima por el
sustrato, a menor KM mayor afinidad de la enzima por el sustrato, ms rpido
se alcanza la velocidad mxima.

Algunas enzimas estn sujetas a regulaciones alostricas


En algunas enzimas, la cintica se describe como una curva sigmoidea esto refleja
un comportamiento cooperativo donde la entrada de una molcula de sustrato al
sitio activo favorece la entrada de ms sustrato.

Debe considerarse que las enzimas aisladas del contexto celular tambin cumplen
la funcin catalizadora ah radica su importancia desde el pto de vista
biotecnolgico.
Como por ejemplo; las celulasas en la fabricacin de papel y jugos de frutas,
proteasas, nucleasas que cortan cidos nuclecos, entre otras.

Recientemente se ha encontrado actividad enzimtica en molculas no proteicas


ejemplo ribozimas, o en el sistema CRISP/Cas 9, estas actividades se hallan en
ciertas secuencias de ARN que adoptan una estructura tridimensional que puede
interactuar sobre otros cidos nucleicos, su accin genera cortes especficos en otros
ARN o sobre molculas de ADN.

Algunas enzimas requieren cofactores


Algunas enzimas requieren la presencia de sustancias llamadas coenzimas para
actuar.
Ejemplo: La NADH deshidrogenasa (saca H) requieren como coenzima la
nicotinamida adenina dinucletido que capta el H sacado,
Esta actividad enzimtica con su coenzima asociada se ver en la parte de
metabolismo asociado a la produccin de sustancias en procesos de fermentacin
de inters biotecnolgico.

En otros casos la coenzima es un metal o un grupo prosttico unido covalentemente


a la enzima en otros caso la unin es laxa.

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Clase 2 problemas

1. Sugiera un mtodo para diferenciar ADN de cadena simple de ARN.

2. Describa el proceso de replicacin del ADN y explique por qu al producirse


la estructura en Y (horquilla de replicacin) una de las cadenas hijas se
sintetiza en fragmentos.

3. Qu resultados experimentales (dibuje la posicin de las bandas en los


gradientes de cloruro de cesio CsCl) habran obtenido Messelson y Stahl si
hubieran alimentado a las bacterias primero con N14 (liviano) pasndolas
luego a N15 (pesado), analizando entonces el ADN al cabo de la primera,
segunda y tercera generaciones?

4. En un tubo de ensayo se agregaron los siguientes componentes para una


reaccin de amplificacin de ADN por PCR (reaccin en cadena de la
polimerasa):

ADN molde: genoma del virus de la viruela

Primer A de 20 nucletidos, cuya secuencia es complementaria de la hebra


de abajo (sentido) del molde en la regin A

Primer B de 22 nucletidos, cuya secuencia es complementaria de la hebra


de arriba (antisentido) del molde en la regin B

dNTPs (los 4 desoxiribonucleosidos trifosfato), Buffer conteniendo Magnesio


Mg2+

Taq polimerasa (ADN polimerasa de Thermus aquaticus). La distancia entre


los extremos 5 prima de cada primer es de 320 nucletidos.

Se realizan 30 ciclos de amplificacin en un termociclador, cada ciclo consiste


en:

1-Desnaturalizacin: 30 seg a 94 C
2-Apareamiento: 60 seg a 42 C
3- Extensin: 120 seg a 72 C

Preguntas:
Cul es el tamao en pares de bases del producto de PCR?
Cul es el peso molecular del producto de PCR? Dato: 1 par de bases pesa
650 Daltons
Cul sera el producto de PCR si se omitiera:
Uno de los primers?
Los dos primers?

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El ADN molde?

Cul sera el producto de PCR si se reemplazara:


El genoma del virus de la viruela por el del virus Herpes simplex?
El ADN molde por un ARN de la misma secuencia?
El primer A por otro de 20 nucletidos, pero de secuencia complementaria
a la hebra de arriba (antisentido) de la regin A?
La Taq polimerasa por la ADN polimerasa de E. coli?

JUSTIFIQUE SUS RTAS.

5. Qu consecuencias tendra para una bacteria la perdida por mutacin de la


actividad 3 prima 5 prima nucleasa de la ADN polimerasa III?

6. Describa las caractersticas de las siguientes uniones que se encuentran en


protenas: a) peptdica, b) Puente de hidrogeno, c) fuerzas de Van der Waals,
d) Puentes disulfuro, e) Unin hidrofbica, f) Unin inica o electrosttica.

7. Cules de estas son necesarias para formar una hlice o una hoja plegada
?

8. Defina estructura primaria, secundaria y terciaria de una protena.

9. Cul es el efecto de los siguientes tratamientos sobre una protena nativa:


urea, mercaptoetanol, SDS, hidrlisis acida fuerte, calentamiento a 90
grados?

10. Mencione las caractersticas de las enzimas. Defina: sustrato, producto, sitio
activo, energa de activacin, cofactor.

11. Dibuje un esquema de una protena con tres dominios estructurales y otra
con tres subunidades.

12. Provoca la sustitucin de un aminocido por otro, forzosamente una


disminucin en la actividad biolgica de una protena?

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