PRAKTIKUM ANALISIS KUANTITATIF MIKROORGANISME

FAKULTAS TEKNOLOGI INDUSTRI PERTANIAN

UNIVERSITAS PADJADJARAN

Annisa Puteri Widanti (240210140067)

Departemen Teknologi Industri Pangan Universitas Padjadjaran, Jatinangor

Jalan Raya Bandung-Sumedang Km. 21, Jatinangor, Sumedang 40600 Telp. (022) 7798844,
779570 Fax. (022) 7795780 Email: annisaputeriwidanti@yahoo.com

ABSTRAK

Analisis kuantitatif mikroorganisme pada bahan pangan perlu dilakukan untuk

mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada
bahan pangan serta dapat menentukan batasan yang masih diizinkan untuk bahan pangan
tersebut. Praktikum ini dilakukan dengan tiga metode yaitu metode Petroff-Hauser dengan
sampel susu, Agar Cawan dengan sampel air dan tahu, dan Most Probable Number (MPN)
dengan sampel air keran. Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan, susu segar memiliki
rata-rata jumlah bakteri yang tumbuh yaitu 5,84 x 105 bakteri/ml. Diduga bakteri yang terdapat
pada susu segar yaitu Streptococcus lactis, (Escherichia coli) dan Staphylococcus. Air kran
mengandung bakteri yang lebih banyak dibandingkan tahu. Air kran positif mengandung
koliform dengan nilai MPN 24,00 atau jumlah mikroorganisme sebanyak 2400 koloni/ml.
Bakteri yang diduga adalah Eschericia coli, Enterobacter aerogenes, Citrobacterfruendii.

Keyword: Analisis kuantitatif mikroorganisme, petroff-hauser, agar cawan, most probable

number (MPN)

PENDAHULUAN

Mutu mikrobiologis dari suatu bahan makanan dapat ditentukan oleh jumlah dan jenis
mikroorganisme yang terdapat dalam bahan pangan. Mutu mikrobiologis ini akan menentukan
ketahanan simpan dari produksi tersebut ditinjau dari kerusakan oleh mikroorganisme, dan
keamanan produk dari mikroorganisme ditentukan oleh jumlah spesies patogenik yang terdapat
serta proses pengawetan apa yang akan diterapkan pada bahan pangan tersebut. Jadi kemampuan
untuk mengukur secara tepat jumlah mikroorganisme yang umum terdapat dalam bahan pangan
dan jumlah mikroorganisme spesifik yang berada dalam produk pangan merupakan dasar yang
penting bagi mikrobiologi pangan (Buckle dkk, 1985).
Analisis kuantitatif mikroorganisme pada bahan pangan perlu dilakukan untuk
mengetahui mutu bahan pangan dan menghitung proses pengawetan yang akan diterapkan pada
bahan pangan serta dapat menentukan batasan yang masih diizinkan untuk bahan pangan
tersebut.
Perhitungan jumlah mikroba dapat dilakukan dengan beberapa metode diantaranya, yaitu
metode cawan (Total Plate Count / TPC), perhitungan jumlah terkecil atau terdekat (Most
Probable Number / MPN).
Perhitungan secara langsung dapat dilakukan secara mikroskopis yaitu dengan
menghitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil. Alat yang digunakan adalah
Petroff-Hauser Chamber. Jumlah cairan yang terdapat antar cover glass dan alat ini mempunyai
volume tertentu sehingga satuan isi yang terdapat dalam satu bujur sangkar juga tertentu
(Pelczar,2005).
Metode perhitungan cawan didasarkan pada anggapan bahwa setiap sel yang hidup dapat
berkembang menjadi koloni. Jadi jumlah koloni yang muncul pada cawan adalah indeks bagi
jumlah mikroorganisme yang terkandung dalam sampel. Teknik yang harus dikuasai dari metode
ini adalah mengencerkan sampel dan mencawankan hasil pengenceran tersebut. Setelah inkubasi,
jumlah semua koloni diamati untuk memenuhi persyaratan statistik. Cawan yang dipilih untuk
menghitung koloni adalah cawan yang mengandung antara 30 sampai 300 koloni. Organisme
yang terdapat dalam sampel asal ditentukan dengan mengalikan jumlah koloni yang terbentuk
dengan faktor pengenceran pada cawan yang bersangkutan (Waluyo, 2004).
MPN adalah suatu metode enumerasi mikroorganisme yang menggunakan data dari hasil
pertumbuhan mikroorganisme pada medium cair spesifik dalam seri tabung yang ditanam dari
sampel padat atau cair yang ditanam berdasarkan jumlah sampel atau diencerkan menurut tingkat
seri tabungnya sehingga dihasilkan kisaran jumlah mikroorganisme yang diuji dalam nilai
MPN/satuan volume atau massa sampel. Prinsip utama metode ini adalah mengencerkan sampel
sampai tingkat tertentu sehingga didapatkan konsentrasi mikroorganisme yang sesuai.
Pengamatan tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati timbulnya kekeruhan atau
terbentuknya gas di dalam tabung kecil (tabung durham) yang diletakkan pada posisi terbalik,
yaitu untuk jasad renik pembentuk gas. Untuk setiap pengenceran pada umumnya digunakan tiga
atau lima seri tabung. Lebih banyak tabung yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih
tinggi, tetapi alat gelas yang digunakan juga lebih banyak (Lim, 2006).

Pada praktikum ini dilakukan analisis kuantitatif pada bahan pangan. Perhitungan
mikroorganisme dilakukan dengan metode langsung (Petroff Hauser) dengan sampel susu,
metode agar cawan dengan sampel air dan tahu dan metode Most Probable Number (MPN)
dengan sampel air keran.

METODOLOGI

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan adalah susu murni, tahu, dan air kran sebagai sampel. Media yang
digunakan adalah PCA. Bahan lainnya adalah minyak imersi, media LBSS, media LBDS dan
spirtus,
Alat yang digunakan untuk praktikum adalah bunsen, cawan petri, korek api, loop, objek
gelas, cover glass, kotak Pettroff-Hauser, mikroskop, dan erlenmeyer.
Perhitungan dengan Pettroff-Hauser
Ambil 1 loop kultur bakteri dari sampel susu murni dan diletakkan pada kotak Pettroff-
Hauser yang diletakkan pada objek glass dengan cover penututp. Ruang hitung terdiri dari 9
kotak besar dengan luas 1 mm. Satu kotak besar di tengah, dibagi menjadi 25 kotak sedang
dengan panjang 0,2 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian
satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm.
Tinggi contoh yang terletak antara gelas objek dengan gelas penutup adalah 0,02 mm (Fardiaz,
1992). Volume kotak sedangnya adalah 0,2 x 0,2 x 0,1 = 0,004 mm 3 atau 4 x 10-6 cm3. Kemudian
diamati dengan mikroskop pada perbesaran 1000x dengan minyak imersi. Jumlah bakteri rata-
rata dihitung dan 25 kotak untuk menghitung jumlah bakteri tiap ml bahan. Rumus untuk
menghitung jumlah bakteri adalah sebagai berikut:
 Ratarata jumlah bakteri
Jumlah sel per mL = Volume kotak

Perhitungan dengan Metode Agar Cawan

Ambil 1 gram sampel padat / 1 ml sampel cair. Selanjutnya dibuat pengenceran sampai
10-5. Diambil 1 ml pada pengenceran 10-3, 10-4, dan 10-5. Dimasukan ke dalam cawan petri.
Dituangkan 15 ml PCA cair (sudah disterilkan) ke dalam cawan dan digoyangkan secara
mendatar atau angka delapan di atas meja supaya sampel menyebar dengan rata. Setelah agak
beku, diinkubasikan dengan posisi terbalik pada suhu 35 37C selam 2 hari. Dihitung jumlah
koloni yang tumbuh pada cwan dan laporkan sebagai jumlah koloni per ml menurut
perhitungan Standar Plate Count (SPC). Rumus yang digunakan dalam perhitungan yaitu,
1
koloni per mL= jumlah koloni per cawan
Faktor pengenceran

Perhitungan koloni pada metode cawan adalah menggunakan Standard Plate Count
(SPC) dilakukan dengan 2 cara. Jika jumlah koloni kurang dari 30, berarti pengenceran yang
dilakukan terlalu tinggi. Oleh karena itu jumlah koloni pada pengenceran yang terendah yang
diukur/dihitung. Selanjutnya hasil yang kurang dari 30 dikalikan dengan besarnya pengenceran,
tetapi jumlah yang sebenarnya harus dicantumkan di dalam tanda kurung. Jika pada semua
pengenceran dihasilkan lebih dari 300 koloni pada medium, berarti pengeceran yang dilakukan
terlalu rendah. Oleh karena itu jumlah koloni pada pengenceran yang tertinggi yang dihitung.
Hasilnya dilaporkan kemudian dikalikan dengan faktor pengencernya, tetapi jumlah yang
sebenarnya harus dicantumkan di dalam tanda kurung.
Perhitungan dengan Metode MPN
Perhitungan dengan metode ini menggunakan 6 tabung reaksi kecil dan 3 tabung reaksi
besar dan menggunakan LBSS dan LBDS yang sudah dibuat sebelumnya. LBDS sebanyak 10
ml dimasukkan ke dalam 3 seri tabung reaksi besar. LBSS juga diisikan ke dalam 3 tabung reaksi
sebanyak 1 ml dan 3 tabung reaksi berikutnya sebanyak 0,1 ml. Kemudian seluruh tabung
tersebut diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 hari. Terbentuknya kekeruhan dan gas dalam tabung
durham diamati. Jumlah tabung positif dari masing-masing pengenceran dicatat. Lalu
dicocokkan dengan tabel yang menunjukkan nilai MPN (untuk tabel 3 seri). Dihitung nilai MPN
sampel.
 PEMBAHASAN

Metode Petroff Hauser

Metode Petroff Hauser yaitu menentukan jumlah sel rata-rata tiap kotak-kotak skala yang
mempunyai luas 1 mm3 (Sumanti et al, 2014). Terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0,04
mm2, dan setiap kotak besar terdiri dari 16 kotak kecil. Tinggi contoh yang terletak di antara
gelas objek dengan gelas penutup adalah 0,02 mm. Jumlah sel dalam beberapa kotak besar
dihitung, kemudian dihitung jmlah sel rata-rata dalam satu kotak besar (Fardiaz, 1992).
Jumlah sel mikroorganisme diamati dengan menggunakan mikroskop pada kotak di tiap
sudut kotak petroff hauser, yaitu kotak atas paling kiri dan kanan, serta kotak bawah paling kiri
dan kanan. Lalu dihitung jumlah bakteri rata-rata untuk menghitung bakteri tiap ml bahan.
Sampel yang digunakan adalah susu sapi.

Tabel 1. Hasil Pengamatan Metode Petroff-Hauser

Sampel Jumlah Rata- Jumlah
Rata Bakteri bakteri/ml
Susu 14,6 5,84 x 105
Tabel 1 menunjukkan bahwa rata-rata jumlah bakteri total pada susu segar adalah 5,84 x
105 dan ini tidak melebihi batas maksimum cemaran mikroba yang yang ditetapkan oleh SNI
tahun 2011 yaitu batas maksimum cemaran Enterobacteriaceae 1x103 CFU/ml dan
Staphylococcus aureus 1x102 CFU/ml dengan total mikroorganisme (TPC) maksimal 1 x 106
CFU per ml susu segar. Pencemaran pada susu terjadi sejak proses pemerahan, dapat berasal
dari berbagai sumber seperti kulit sapi, ambing, air, tanah, debu, manusia, peralatan dan udara
(Rombaut. 2005). Peralatan dapat menjadi sumber kontaminasi apabila tidak dibersihkan secara
maksimal terutama bagian yang kontak langsung dengan susu. Hal tersebut sesuai dengan
pendapat Frazier dan Westhoff (1978) yang menyatakan bahwa tingkat kontaminasi berasal dari
setiap sumber dan bergantung dari metode sanitasi yang dilakukan. Sumber kontaminasi yang
sangat signifikan adalah dari permukaan yang kontak langsung dengan susu.
Hitungan dengan metode Petroff Hauser cepat dan murah, tetapi mempunyai beberapa
kelemahan sebagai berikut :
1. Sel-sel yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel-sel hidup. Oleh karena itu, kedua sel
tersebut akan terhitung.
2. Sel-sel yang berukuran sangat kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, sehingga kadang-
kadang tidak terhitung.
3. Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi, misalnya
untuk bakteri minimal 106sel/ml. hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang yang
diamati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung.
4. Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel jasad renik di dalam bahan pangan yang banayk
mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal ini akan mengganggu dalam
perhitungan sel (Fardiaz S, 1992).

Metode Agar Cawan

Prinsip dari metode hitungan cawan adalah jika sel mikroorganisme yang masih hidup
ditumbuhkan pada medium agar, maka sel mikroorganisme tersebut akan berkembang biak dan
membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan dihitung dengan mata tanpa menggunakan
mikroskop (Fardiaz, 1992).
Karena ukuran bakteri sangat kecil, menghitung jumlah bakteri dalam sampel bisa sulit.
Meskipun jumlah langsung dengan mikroskop, mereka memerlukan banyak waktu dan keahlian.
Sebuah metode yang lebih mudah adalah untuk menyebarkan bakteri di wilayah yang luas (plate
agar yaitu nutrisi) dan menghitung jumlah koloni yang tumbuh. Jika
bakteri ini menyebar cukup, setiap sel bakteri dalam sampel asli harus menghasilkan
koloni tunggal. Biasanya, sampel bakteri harus diencerkan jauh untuk mendapatkan jumlah yang
wajar (Eema, 2011).
Sebelum memulai praktikum, langkah pertama yang harus dilakukan adalah pengenceran.
Pengenceran dilakukan 10-1 sampai 10-5. Semakin encer maka mikroorganisme yang terdapat
dalam pangan tersebut semakin rendah. Larutan pengencer terdiri dari NaCl fisiologis dan
aquades steril. Sampel harus disuspensikan dalam larutan aquades steril dengan perbandingan
pengenceran 1:9 yakni 1 gram sampel dengan 9 ml larutan aquades steril untuk sampel padat
sedangkan 1 ml sampel dengan 9 ml larutan aquades steril untuk sampel cair.
Pengenceran yaitu suatu cara atau metoda yang diterapkan pada suatu senyawa dengan
jalan menambahkan pelarut yang bersifat netral, lazim dipakai yaitu aquades dalam jumlah
tertentu. Penambahan pelarut dalam suatu senyawa dan berakibat menurunnya kadar kepekatan
atau tingkat konsentrasi dari senyawa yang dilarutkan/diencerkan (Brady, 1999).
NaCl fisiologis digunakan sebagai pengencer agar suspensi sampel tetap steril dan
menghindari adanya kontaminan pada sampel. Selain itu, NaCl fisiologis juga dapat
mempertahankan kondisi pH. Sebagaimana kita ketahui bahwa pertumbuhan mikroorganisme
sangat peka terhadap perubahan pH, sehingga diperlukan suatu larutan pengencer yang tidak
mempengaruhi kondisi pH.
Sampel dengan pengenceran 10-4 dan 10-5 dituangkan 1 ml ke dalam cawan petri dan diisi
dengan medium PCA steril untuk masing-masing cawan petri. Lalu goyangkan angka delapan,
tujuannya agar pengenceran sampel dan medium tercampur rata. Setelah itu biarkan medium
agar beku dan inkubasi 30-320C selama dua hari. Lalu dilakukan perhitungan koloni. Berikut
adalah hasil pengamatan metode agar cawan dengan sampel air dan tahu.

Tabel 2. Hasil Pengamatan Metode Agar Cawan

Jumlah Koloni
Sampel SPC (CFU/gram)
10-2 10-3 10-4

Air 35 13 18 3,5 x 104

Air 1 koloni besar 2 koloni besar 19 1,9 x 104
Tahu 3 2 0 3,0 x 103
Air 1 33 6 3,3 x 105
Air 58 14 10 5,8 x 103
Tahu 3 136 209 1,4 x 106

Hasil pengamatan menunjukkan banyak kekurangan dalam pembiakkan mikroorganisme

dalam medianya, hal ini dapat dilihat dari jumlah bakteri yang lebih banyak pada pengenceran
yang lebih tinggi dibandingkan pengenceran yang lebih rendah seperti pada sampel tahu. Lalu
didapatkan bahwa pada sampel tahu jumlah koloni yang tampak tidak sampai 30 koloni seperti
rentang yang ditentukan dalam SPC. Jumlah yang tidak mencapai batas ini kemungkinan terjadi
karena pengenceran yang terlalu tinggi. Perlakuan duplo juga menunjukkan ketidakseragaman,
hal ini dapat disebabkan oleh pengocokan yang tidak merata ketika pengenceran maupun
lingkungan praktikum yang kurang aseptis.
Berdasarkan hasil pengamatan menunjukkan bahwa air memiliki jumlah sel yang lebih
banyak dibandingkan dengan tahu. Tahu merupakan produk hasil fermentasi kacang kedelai
Produk fermentasi selalu memiliki jumlah mikroba yang terkandung di dalamnya, namun dapat
dikatakan bahwa mikroba-mikroba tersebut tidak bersifat merugikan bagi pengonsumsinya.
Menurut Fardiaz (1992), metode hitungan cawan merupakan cara yang paling sensitif
untuk mementukan jumlah jasad renik karena beberapa hal yaitu:
1. Hanya sel yang masih hidup yang dihitung.
2. Beberapa jenis mikroorganisme dapat dihitung sekaligus.
3. Dapat digunakan untuk isolasi dan identifikasin berasal dari suatu jasad renik yang
mempunyai penamakan pertumbuhan spesifik.
Selain keunggulan tersebut, metode agar cawan memiliki beberapa kelemahan. Cedera
bakteri mungkin tidak selalu membentuk koloni. Juga, karena tidak ada solusi tunggal yang
pengencer mendukung pertumbuhan semua jenis bakteri, beberapa bakteri dapat dibiarkan keluar
dari setiap prosedur penghitungan yang diberikan (Eema, 2011).
Menurut Fardiaz (1992), kelemahan metode hitungan cawan sebagai berikut:
1. Hasil perhitungan tidak menunjukkan jumlah sel yang sebenarnya, karena beberapa sel yang
berdekatan mungkin membentuk satu koloni.
2. Medium dan kondisi inkubasi yang berbeda mungkin menghasilkan milai yang berbeda.
3. Mikroorganisme yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada medium padat dan
membentuk koloni yang kompak dan jelas, tidak menyebar.
4. Memerlukan persiapan dan waktu inkubasi relatif lama sehingga perumbuhan koloni dapat
dihitung.

5.3 Metode MPN

Metode MPN biasanya dilakukan untuk menghitung jumlah mikroba di dalam contoh
yang berbentuk cair, meskipun dapat pula digunakan untuk contoh berbentuk padat dengan
terlebih dahulu membuat suspensi 1:10 dari contoh tersebut (Fardiaz, 1992).
Metode MPN umumnya digunakan untuk menghitung jumlah bakteri pada air khususnya
untuk mendeteksi adanya bakteri koliform yang merupakan kontaminan utama sumber air
minum. Most Probable Number dalam bidang kesehatan masyarakat dari mikrobiologi pangan,
dipergunakan secara luas untuk menghitung jumlah bakteri yang ada dalam bahan pangan. Media
ini banyak digunakan untuk menghitung bakteri patogenik dalam jumlah sedikit yang terdapat
dalam bahan pangan (Buckle et al, 1985).
Metode MPN menggunakan medium cair dalam tabung reaksi yang berisi tabung
durham, dimana perhitungannya dilakukan berdasarkan jumlah tabung reaksi positif, yaitu yang
ditumbuhi oleh mikroorganisme setelah diinkubasi pada suhu dan waktu tertentu. Pengamatan
tabung yang positif dapat dilihat dengan mengamati terjadinya kekeruhan, terbentuknya gas
didalam tabung durham yang diletakkan pada posisi terbalik, sehingga tabung durhamnya naik
keatas. Setiap pengenceran pada umumnya digunakan tiga atau lima seri. Lebih banyak tabung
yang digunakan menunjukkan ketelitian yang lebih tinggi, tetapi alat gelas yang digunakan juga
lebih banyak (Fardiaz, 1992).
Output metode MPN adalah nilai MPN. Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh
(growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam sampel. Namun, pada
umumnya nilai MPN juda diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang
digunakan, umumnya per 100 mL atau per gram. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95
persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN
tertinggi (Lim, 1998).
Metode MPN merupakan uji deretan tabung yang menyuburkan pertumbuhan koliform
sehingga diperoleh nilai untuk menduga jumlah E. coli dalam sampel yang diuji. Uji positif akan
menghasilkan angka indeks. Angka ini disesuaikan dengan tabel MPN untuk menentukan jumlah
koliform dalam sampel (Pakadang, 2010).
Menurt Buckle (1985), asumsi dari teknik ini adalah:
1. Sel akan tersebar secara acak dalam contoh dan dan gaya pengelompokan, penarikan
dan gaya tolak-menolak di antara sel tidak terjadi.
2. Setiap bagian kecil (aliquot) dari suatu larutan akan menunjukkan pertumbuhan apabila
diinokulasi dalam nutrient broth, bila aliquot tersebut berisi 1 atau lebih sel-sel hidup.
3. Terhindar dari pencemaran bahan dan alat-alat.
Bakteri koliform adalah bakteri indicator keberadaan bakteri patogenik lain. Bakteri
koliform dibedakan menjadi dua tipe, yaitu faecal coliform dan non-faecal coliform. E. coli
adalah bagian dari faecal coliform. Keberadaan E. Coli dalam airdaapt menjadi indicator
pencemaran air oleh tinja. E. coli digunakan sebagai indicator pemeriksaan kualitas bakteriologis
secara universal dalam analisis dengan alasan:
 a) E. coli secaranormal hanya ditemukan di saluran pencernaan manusia (sebagai flora
normal) ataua hewan mamalia, atau bahan yang telah terkontaminasi dengan tinja
manusai atau hewan, jarang sekali ditemukan dalam air dengan kualitas kebersihan
yang tinggi.
b) E. coli mudah diperiksa di laboratorium dan sensitivitasnya tinggi jika pemeriksaaan
dilakukan dengan benar
c) Bila dalam air tersebut ditukan E. coli, maka air tersbeut dianggap berbahaya bagi
penggunaan domestic
d) Ada kemungkinan bakteri enteric pathogen yang lain dapat ditemuan bersama-sama
dengan E. coli dalam air tersebut.
Praktikum kali ini dilakukan pada tiga seri tabung reaksi yang dibagi menjadi Seri I, Seri
II dan Seri III. Setiap tabung reaksi berisi tabung durham yang diletakkan pada posisi terbalik.
Posisi tabung durham harus terbalik, bertujuan untuk mengetahui dengan jelas terdapatnya
gelembung gas atau tidak. Medium yang dipakai untuk metode MPN ini yaitu LBSS (Laktose
Broth Single Strength) dan LBDS (Laktose Broth Double Strength) Sampelnya yaitu air keran
biasa. Sebelum memasukkan sampel kedalam tabung reaksi, pastikan untuk setiap pengerjaannya
harus dengan kondisi yang steril, baik lingkungan, tempat kerja, maupun peralatannya. Pastikan
juga untuk bekerja didekat api bunsen untuk mencegah adanya kontaminasi mikroorganisme
lain.
Metode MPN menggunakan 9 tabung reaksi yang dibagi menjadi 3 seri dimana satu seri
masing-masing terdapat 3 tabung reaksi dengan menggunakan sampel air keran. Seri pertama
menggunakan medium LBDS (Laktose Broth Double Strength) yang diberi sampel 10 ml, seri
kedua menggunakan LBSS (Laktose Broth Single Strength) yang diberi sampel sebanyak 1 ml
dan seri ketiga menggunakan LBSS (Laktose Broth Single Strength) yang diberi sampel 0,1 ml.
Kemudian ditetesi dengan pewarna Neutral Red. Menurut Winckler (1974) Neutral Red adalah
pewarna yang bertindak sebagai indicator pH, berubah merah ke kuning antara pH 6,8 8,0, juga
sebagai indicator untuk mengetahui terbentuk tidaknya asam karena pemecahan karbohidrat.
Lalu diinkubasikan selama 2 hari pada suhu 37oC.
Menurut Fardiaz (1992), setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu, dihitung jumlah
tabung yang positif yaitu tabung yang ditumbuhi mikroorganisme yang dapat ditandai dengan
timbulnya kekeruhan. Misalnya pada pengenceran pertama ketiga tabung menghasilkan
pertumbuhan positif, pada pegenceran kedua dua tabung tabung positif, pada pengenceran ketiga
satu tabung positif, dan pada pengenceran terakhir tidak ada tabung yang positif. Kombinasi
menjadi 3, 2, 1, 0 dan jika diambil tiga pengenceran yang pertama kombinasinya akan menjadi 3,
2, 1 Angka kombinsi ini kemudian dicocokan dengan tabel MPN. Berikut hasil pengamatan.
Tabel 1. Hasil Pengamatan Metode MPN
Jumlah Tabung Positif MPN
MPN Count
LBDS LBSS 1 ml LBSS 0,1 ml
(CFC/ml)
3 1 2

1,2

10
1.20
3
3 3

24

>24,00 102

3 3 3 24
>24,00
102
3 3 3

24

>24,00 102

3 3 3

24

>24,00 102
 Hasil pengamatan pada perhitungan MPN menunjukkan bahwa sampel air keran positif
mengandung E. coli karena hampir semua tabung durham memiliki gelembung di dalamnya.
Menurut Fardiaz (1992), gelembung udara yang dihasilkan pada tabung durham disebabkan oleh
adanya aktivitas yang respirasi mikroorganisme, sehingga dapat dilihat hasil dari respirasi
mikroorganisme tersebut berupa gelembung gas. Sementara perbahan warna yang terjadi dapat
dijelaskan sebagai berikut. Ketika pewarna NR diteteskan pada medium LBSS dan LBDS,
larutan yang semula berwarna kuning akan berubah menjadi warna merah, yang
mengindikasikan terdapat monosakarida di dalam larutan tersebut. Lalu setelah diinkubasi,
warna yang semula merah kemudian berubah lagi menjadi kuning, hal ini disebabkan karena
medium penuh nutrisi tersebut digunakan oleh mikroba untuk berkembang biak sehingga
kandungan laktosanya sendiri berkurang dan mengubah warna larutan tersebut kembali menjadi
kuning/kekuningan.
Menurut Suriawiria (1985), kekeruhan yang terdapat pada tabung reaksi disebabkan karena
adanya aktivitas dari suatu mikroorganisme. Kekeruhan yang terjadi pada tabung-tabung reaksi
tersebut berbeda, ada yang mengalami kekeruhan pada bagian permukaannya saja dan juga ada
yang mengalami kekeruhan merata pada seluruh media dan sampel. Kekeruhan yang terjadi
merata pada media disebabkan karena adanya mikroorganisme anaerob fakultatif, yaitu
mikroorganisme yang mampu hidup ataupun tumbuh dengan atau tanpa adanya oksigen.
Kekeruhan yang terjadi pada permukaannya saja disebabkan karena adanya mikroorganisme
aerob.
Bakteri pembentuk gas mungkin memproduksi gas mungkin memproduksi gas secara cepat
dengan jumlah banyak, atau mungkin produksi gasnya sangat lambat dan sedikit sekali sehingga
sukar dideteksi, misalkan pada beberapa bakteri laktat heterofermentatif. Bakteri pembentuk gas
dapat dibedakan atas dua kelompok yaitu:
1. Bakteri yang memproduksi CO2, misalnya leuconostoc, lactobacillus (hehterofermentatif)
dan propioni bacterium.
2. Bakteri yang memproduksi O2 dan H2, misalnya eshcerichia, enterobacter proteus, bacillus
(aerobasili) dan clostridium (Fardiaz, 1992).
Menurut Standar Nasional Indonesia (SNI) nomor SNI -01-3553-1996 dalam surat
keputusan Menteri Negara Kependudukan dan Lingkungan Hidup KEP-02/MENKLH/I/1988
menyatakan bahwa parameter kualitas air minum berdasarkan parameter bakteriologisnya yaitu
bakteri koliform. Bakteri Coliform merupakan parameter mikrobiologis terpenting kualitas air
minum. Adanya bakteri coliform dan E.Coli pada sumber air, mengindikasikan kalau air tersebut
kurang higenis untuk dijadikan sebagai air minum. Karena bakteri ini biasanya berasal dari
kotoran hewan manusia. Kelompok bakteri coliform terdiri atas Eschericia coli, Enterobacter
aerogenes, Citrobacterfruendii dan bakteri lainnya.
Keuntungan dari metoda ini adalah :
1. Dapat dibuat sangat peka dengan penggunaan volume inokulum contoh yang lebih besar
dari 1,0 ml/tabung.
2. Bahan-bahan dapat dipersiapkan untuk tugas lapangan.
3. Media pertumbuhan selektif dapat digunakan untuk menghitung jenis mikroorganisme yang
diharapkan di antara jenis-jenis lainnya yang ada dalam bahan pangan tersebut.
Kerugiannya adalah dibutuhkannya banyak ulangan untuk diperoleh hasil yang teliti dan
sehubungan dengan hal tersebut banyak biaya dan waktu yang dibutuhkan untuk persiapannya.
Metoda ini banyak digunakan untuk menghitung bakteri patogenik dalam jumlah sedikit yang
terdapat dalam bahan pangan (Buckle et al, 1985).

KESIMPULAN

Berdasarkan pengamatan yang telah dilakukan, susu segar memiliki rata-rata jumlah
bakteri yang tumbuh yaitu 5,84 x 105 bakteri/ml sedangkan batas maksimum cemaran mikroba
yang yang ditetapkan oleh SNI tahun 2011 yaitu dengan total mikroorganisme (TPC) maksimal 1
x 106 CFU per ml susu segar. Diduga bakteri yang terdapat pada susu segar yaitu Streptococcus
lactis, (Escherichia coli) dan Staphylococcus. Air kran mengandung bakteri yang lebih banyak
dibandingkan tahu. Air kran positif mengandung koliform dengan nilai MPN 24,00 atau jumlah
mikroorganisme sebanyak 2400 koloni/ml. Bakteri yang diduga adalah Eschericia coli,
Enterobacter aerogenes, Citrobacterfruendii.

DAFTAR PUSTAKA

Buckle, K.A., dkk. 1985. Ilmu Pangan. UI Press, Jakarta.

Fardiaz, Srikandi. 1992. Mikrobiologi Pangan 1. PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.
Hadioetomo R. 1996. Mikrobiologi Dasar-Dasar Dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.
Pakadang, S. 2010. Buku Penuntun Praktikum Mikrobiologi Farmasi. Jurusan Farmasi Politeknik
Kesehatan Depkes Makassar, Makassar.
Pelczar, dan Chan. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Penerbit Universitas Indonesia
(UI-Press), Jakarta.
Plummer, D. T. 1987, An Introduction to Practical Biochemistry, Tata Mc-Graw Hill Publishing
Company LTD, Bombay- New Delhi.
Sumanti, Debby M. dkk. 2009. Diktat Penuntun Praktikum Mikrobiologi Pangan. Jurusan
Teknologi Industri Pangan Fakultas Teknologi Industri Pertanian Universitas
Padjadjaran, Jatinangor.
Suriawiria, U. 1985, Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Gramedia, Jakarta.