Anda di halaman 1dari 6

1.

Definisi Elektroforesisi

Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan
melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah peristiwa atau teknik pemisahan partikel
koloid atau molekul atau komponen yang bermuatan berdasarkan tingkat migrasinya dalam
sebuah medan listrik. Medan listrik dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang
akan dipisahkan. Teknik ini dipelopori pada tahun 1937 oleh ahli kimia yang bernama Swedia
Arne Tiselius. Partikel-partikel koloid umumnya bermuatan sehingga dapat dipengaruhi oleh
medan listrik. Apabila ke dalam sistem koloid dimasukkan sepasang elektroda yang dihubungkan
dengan sumber arus listrik searah maka partikel-partikel koloid akan bergerak ke elektroda-
elektroda tersebut.

Elektroforesis adalah teknik pemisahan suatu partikel/ spesies/ ion atau partikelkoloid
berdasarkan kemampuan berpindah melalui medium konduktif, biasanya berupalarutan bufer,
sebagai respon adanya suatu medan listrik (Harvey 2000). Secara teknis,elektroforesis
merupakan istilah yang diberikan untuk migrasi partikel yang bermuatanakibat diberikan arus
listrik searah atau DC (Direct Current). Umumnya teknik dari
cikal- bakal elektroforesis digunakan untuk menentukan muatan dari suatu koloid (Patnaik2004).
Teknik elektroforesis ditentukan oleh ciri molekular ionik dan adanya muatansebagai sifat fisik.
Arah dan laju pergerakan tergantung pada spot dan intensitas muatanionik (Rouessac 2007).
Bufer elektroda digunakan untuk konduktor arus dengan
menjadi jembatan konduksi diantara dua elektroda sehingga memungkinkan terjadinya aliranmed
an listrik (Skoog 2002).

Partikel koloid yang bermuatan positif akan menuju katoda (elektroda negatif) dan partikel yang
bermuatan negatif akan menuju anoda (elektroda posotif). Pergerakan yang terjadi disebut
elektrokinetik. Karena itu elektroforesis koloid dapat digunakan untuk menentukan jenis
muatan suatu koloid.

Hasil yang didapatkan dari elektroforesis adalah elektroforegram yang memberikan informasi
mengenai seberapa cepat perpindahan komponen atau biasa disebut kecepatan migrasi. Besaran
yang digunakan sama dengan proses kromatografi. Kromatografi adalah suatu teknik
pemisahan berdasarkan perbedaan fase gerak dan fase diam untuk memisahkan komponen
(berupa molekul) yang berada pada larutan.

Teknik elektroforesis dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif
dilewatkan malalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke kutub yang
berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif.

Macam macam elektroforesis :

1. Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fasediam
dan partikel bermuatan yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ialah ion-ionkompleks.
Pemisahan ini terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang sistem pemisahan.
Pergerakan partikel dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zatterlarut, luas
penampang, tegangan yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatanion, pH,
viskositas, dan adsorpsivitas zat terlarut
2. Elektroforesis gel ialah elektroforesis yang menggunakan gel sebagai fase diamuntuk
memisahkan molekul-molekul. Awalnya elektoforesis gel dilakukan denganmedium gel
kanji (sebagai fase diam) untuk memisahkan biomolekul yang lebih besarseperti protein-
protein. Kemudian elektroforesis gel berkembang dengan menjadikanagarosa dan
poliakrilamida sebagai gel media.Dalam elektroforesis gel terdapat dua material dasar
yang disebut fase diam danfase bergerak (eluen). Fase diam berfungsi "menyaring" objek
yang akan dipisah,sementara fase bergerak berfungsi membawa objek yang akan dipisah.
Sering kaliditambahkan larutan penyangga pada fase bergerak untuk menjaga kestabilan
objekelektroforesis gel. Elektroda positif dan negatif diletakkan pada masing-masing
ujungaparat elektroforesis gel.
3. Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untukmemisahkan
asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida denganresolusi tinggi yang
dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer. Metode ini mulaidigunakan secara luas pada
akhir tahun 1940 untuk aplikasi dalam
berbagai bidang seperti bioteknologi, kimia, lingkungan, dan analisis farmasi.Elektrofore
sis kapiler menggunakan listrik bertegangan tinggi yang menyebabkansemua komponen
ion atau molekul netral bergerak ke katoda. Deteksi dapatdilakukan dengan teknik
pendeteksian spektrometri atau elektrokimia.
Teknik pemisahan ini dipengaruhi oleh tegangan listrik, koefisien difusi, panjang, dandia
meter pipa kapiler, serta konsentrasi sampel.
1. Komponen alat
a. Larutan elektrolit: larutan pembawa komponen umumnya buffer dengan pH tertentu.
b. Zat pendukung: tempat pemisahan terjadi. Biasanya berupa kertas(selulosa asetat,selulosa
nitrat), gel kanji, gel polikrilamid, busa poliuretan, agar-agar.
c. Elektroda: dengan anoda dan katoda yang dihubungkan arus listrik.Rangkaian Alat
ElektroforesisBerdasarkan bentuk alat, elektroforesis dibagi menjadi dua
Elektroforesis Planar2.
Elektroforesis Kolom

Pemisahan pada elektroforesis, selain disebabkan oleh fenomena


elektrokinetik, juga dapat disebabkan karena adanya filtrasi, yakni interaksi
dengan fasa diam.Pemisahan yang disebabkan karena interaksi tersebut
tidak disebut elektroforesis,melainkan "elektrokromatografi". Arus yang
digunakan pada elektroforesis adalaharus DC dengan nilai tegangan kurang
dari 1000 volt. Apabila digunakan lebih dari 1000 volt maka akan terjadi efek
pemanasan pada media gel. Efek pemanasantersebut disebut "efek Joule" yang disebabkan
karena adanya tumbukan partikelelektron. Efek pemanasan dapat dihilangkan dengan dua cara,
yakni:

a. Pendinginan2.
b. Efek Konveksi. Efek konveksi adalah suatu cara untuk membebaskan panasdengan
mengganti bentuk planar menjadi bentuk kolom atau kapiler. Kapiler yangdigunakan
dibuat dari silika yang bermuatan netral atau negatif. Bagian luarkapiler dilapisi dengan
polimer agar bersifat lentur

MANFAAT

Elektroforesis gel secara luas digunakan untuk memperkirakan ukuran fragmen DNA ,misalnya
dalam pemetaan pembatasan DNA kloning. Metode ini juga digunakan dalamdiagnosis genetika
molekuler atau sidik jari genetik melalui analisis PCR. Elektroforesisgel agarosa juga digunakan
untuk menyelesaikan DNA melingkar dengan perbedaansuperkoil topologi, dan untuk
menyelesaikan fragmen yang berbeda karena sintesis DNA.Selain menyediakan media yang
tepat untuk analisis ukuran fragmen, gel memungkinkan pemurnian fragmen DNA

Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenan atau gradasi


konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukkan mobilitas elektroforesis
spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat spesifik. Pemisahan
dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara spontan bercampur
kembali akibat sirkulasi konvektif. Pada elektroforesis, medan listrik dialirkan pada suatu
medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan.
Prinsip kerja dari elektroforesis berdasarkan pergerakan partikel-partikel bermuatan
negatif (anion), dalam hal tersebut DNA, yang bergerak menuju kutub positif (anode), sedangkan
partikel-partikel bermuatan positif (kation) akan bergerak menuju kutub negatif (anode) (Klug &
Cummings, 1994: A 6). Prinsip inilah yang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan
molekul-molekul berdasarkan muatannya sehingga pergerakan molekul-molekul tersebut pada
suatu fase diam (stationary phase) dalam sebuah medan listrik akan berbeda-beda. Oleh karena
partikel sol bermuatan listrik, maka partikel ini akan bergerak dalam medan listrik. Kemampuan
perpindahan pergerakan muatan molekul tersebut menuju ke arah kutub yang berlawanan
merupakan suatu parameter kecepatan dalam proses elektroforesis yang dinyatakan sebagai
mobilitas elektroforetik. Mobilitas elektroforetik merupakan laju perpindahan partikel bermuatan
dalam cm per detik yang disebabkan karena pengaruh medan listrik 1 V per cm, dinyatakan
dalam cm2V-1s-1. Mobilitas elektroforetik dapat ditetapkan hanya untuk elektrolit tertentu pada
kondisi pengujian yang tepat. Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis
dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary
electrophoresis) dan elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis
larutan, larutan penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar
tertutup dan dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan
melihat terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan
teknik elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai
media penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai
adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat. Adapun menurut
Sargent & George (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel dengan dua
buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah model horizontal,
karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan sangat sederhana,
relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan pemisahan yang lebih
baik. Elektroforesis biasanya memerlukan media penyangga sebagai tempat bemigrasinya
molekul-mulekul biologi. Media penyangganya bermacam-macam tergantung pada tujuan dan
bahan yang akan dianalisa. Media penyangga yang sering dipakai dalam elektroforesis antara
lain yaitu kertas, selulose, asetat dan gel. Gel poliakrilamid dan agarosa merupakan matriks
penyangga yang banyak dipakai untuk separasi protein dan asam nukleat. Beberapa faktor
mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein yakni: (Soedarmadji, 1996) 1. Ukuran
molekul protein Migrasi molekul protein berukuran besar lebih lambat daripada migrasi molekul
berukuran kecil. 2. Konsentrasi gel Migrasi molekul protein pada gel berkosentrasi rendah lebih
cepat daripada migrasi molekul protein yang sama pada gel berkosentrasi tinggi. 3. Bufer
(penyangga) dapat berperan sebagai penstabil medium pendukung dan dapat mempengaruhi
kecepatan gerak senyawa karena ion sebagai pembawa protein yang bermuatan. Kekuatan ion
yang tinggi dalam bufer akan meningkatkan panas sehingga aliran listrik menjadi maksimal. Hal
ini dapat mempercepat gerakan molekul protein. Kekuatan ion rendah dalam bufer akan
menurunkan panas sehingga aliran listrik akan sangat minimal dan migrasi molekul protein
sangat lambat. 4. Medium penyangga Medium pendukung ideal untuk elektroforesis adalah
bahan kimia inert yang bersifat relatif stabil, mudah ditangani dan mempunyai daya serap yang
baik, sebagai migrasi elektron atau penyaringan berdasarkan ukuran molekul seperti gel
poliakrilamid (Sudarmadji, 1996).

ELEKTROFORESIS GEL

Elektroforesis gel Elektroforesis gel digunakan untuk memisahkan atau melihat


kemurnian DNA atau protein yang tidak bisa diperoleh dengan metode lain seperti gradient
sentrifugasi. Media yang banyak dipakai dalam proses pemisahan ini adalah agarose atau
akrilamid. Agarose digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang lebih besar karena
memiliki ukuran partikel yang lebih besar. Sehingga daya pisah dari agarose (resolusi) lebih
kasar (lebih lemah) dibandingkan akrilamid. Akrilamid memiliki ukuran partikel yang lebih
halus sehingga daya pemisahannya lebih baik. Elektroforesis melalui gel agarosa atau
poliakrilamid merupakan Teknik ini merupakan teknik yang sederhana, cepat, dan dapat
memisahkan molekul yang diinginkan dari matriksnya yang tidak dapat dilakukan oleh prosedur
lainnya, seperti sentrifugasi gradient. (David G. Watson, 2007).

Jenis-jenis Elektroforesis Gel

1. Elektroforesis gel agarosa Metode standar yang digunakan untuk memisahkan,


mengidentifikasi dan memurnikan fragmen DNA adalah elektroforesis gel agorose.
Teknik ini sederhana, cepat terbentuk, dan mampu memisahkan campuran potongan
DNA sesuai dengan ukurannya secara akurat, dibanding dengan densitas gradient
sentrifugasi. (Maniatis T. et al, 1982) Agarosa yang disari dari ganggang laut merupakan
polimer dengan dasar struktur D-alaktosa dan 3,6 anhidro L-galaktosa. DNA dari 200
basa sampai 50 kilo basa dapat dipisahkan dengan gel agarosa dengan berbagai
konsentrasi agarosa. Gel agarosa biasanya dilakukan dalam konfigurasi horizontal dalam
kekuatan medan listrik dan arah tetap. (David G. Watson, 2007) Gel agarosa dibuat
dengan melelehkan agarosa dengan buffer dan kemudian dituangkan pada cetakan dan
diamkan sampai dingin. Setelah mengeras, agarosa membentuk matriks dengan kerapatan
yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnet diberikan antara kedua
ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH netral, bergerak ke anoda. Kecepatan
migrasi ini ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA, konformasi DNA, konsentrasi
agarosa dan besaran tegangan yang digunakan. (David G. Watson, 2007) Molekul DNA
untai ganda linear, yanag diletakkan pada salah satu ujung gel, bergerak melalui matriks
gel pada kecepatan yang berbanding terbalik terhadap log jumlah asam basa. Molekul
yang lebih besar bergerak lebih lama karena terjadi gesekan lebih besar. (David G.
Watson, 2007) Hal ini disebabkan DNA harus melewati pori-pori gel sehingga kurang
efisien lajunya daripada molekul yang lebih kecil.Fragmen DNA linear dengan panjang
tertentu bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda pada gel yang mengandung
konsentrasi agarosa berbeda. Cara yang paling mudah untuk mendeteksi adanya DNA
dengan menggunakan etidium bromide, suatu senyawa berfluoresensi yang biasanya
digunakan untuk mendeteksi DNA pada gel agarosa atau poliakrilamid. (David G.
Watson, 2007)
2. Elektroforesis Gel Poliakrilamid Akrilamid merupakan suatu monomer, yang jika ada
radikal bebas, biasanya diberikan oleh ammonium persulfat dan distabilkan oleh
TEMED, terjadi reaksi berantai sehingga monomer terpolimerisasi menjadi rantai
panjang. Gel poliakrilamid dibuat dengan cara menuangkan antar dua lempeng kaca yang
dipisahkan dengan pembatas dengan ketebalan tertentu. Gel poliakrilamid berukuran dari
5 cm sampai 50 cm panjangnya tergantung pada keperluannya dan dilakukan
elektroforesis dengan cara vertikal. (David G. Watson, 2007)
3. Elektroforesis Gel Poliakrilamid-SDS ( SDS-PAGE) Protein dapat dipisahkan
berdasarkan ukuran massanya dengan elektroforesis gel poliakrilamid dengan system
gerak. Sebelumnya, campuran protein dipanasi dengan natrium dedosil suldat (SDS),
suatu detergen anionik utnuk menyelubungi molekul protein. Penyelubungan ini
menyebabkan interaksi nonkovalen terganggu sehingga molekul protein dalam struktur
primer. Anion SDS berikatan dengan rantai utama dengan rasio satu molekul SDS untuk
dua residu asam amino. . (David G. Watson, 2007) Merkaptoetanol atau ditiotreitol juga
ditambahkan untuk mereduksi ikatan disulfida. Kompleks SDS dengan protein
terdenaturasi mempunyai jumlah muatan negatif yang sebanding dengan ukuran protein.
Muatan negatif yuang terdapat pada ikatan SDS ini jauh lebih besar daripada muatan
pada protein asli. Kompleks protein SDS kemudian dielektroforesis, sehingga semua
molekul protein bergerak menuju kutub positif. Ketika elektroforesis selesai, protein
dalam gel dapat ditampakkan oleh pewarnaan dengan perak atau zat warna seperti
Coonassie biru, yang akan menampakkan beberapa pita. (David G. Watson, 2007