Anda di halaman 1dari 6

MAKALAH

HPLC (High Performance Liquid Cromathography)

Oleh : Yanuar Adi P

NIM : 201532122

UNIVERSITAS ESA UNGGUL

FAKULTAS ILMU-ILMU KESEHATAN

JURUSAN ILMU GIZI

2017
I. PEMBAHASAN

A. Pengertian HPLC
Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang
tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.
HPLC secara mendasar merupakan sebuah perkembangan tingkat tinggi dari
kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom di bawah
pengaruh gravitasi, HPLC didukung oleh pompa yang dapat memberikan tekanan
tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuat HPLC dapat memisahkan
komponen sampel lebih cepat. Saat ini, HPLC merupakan teknik pemisahan yang
diterima secara luas untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu
sampel dalam berbagai bidang, antara lain : farmasi, lingkungan, bioteknologi,
polimer, dan industri-industri makanan. Beberapa perkembangan HPLC terbaru
antara lain : miniaturisasi sistem HPLC, penggunaan HPLC untuk analisis asam-
asam nukleat, analisis protein, analisis karbohidrat, dan analisis senyawa-senyawa
kiral.
Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan
kepolarannya, alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu
sebagai fasa geraknya. Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi
lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak.
Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya, dan kecepatannya untuk
sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda, hal ini akan teramati pada
spektrum yang puncak-puncaknya terpisah.
B. Fungsi HPLC
Beberapa fungsi HPLC dalam kehidupan :
HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri
farmasi dan pestisida.
Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar
dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.

Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin


Zipax-SAX.

Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.

Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah


biokimia.

Manfaat HPLC

Beberapa manfaat dari HPLC yaitu

1. HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri


farmasi dan pestisida.
2. Zat- zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar
dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.
3. Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang
dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori.
4. Morfin, heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin
Zipax-SAX.
5. Dapat memisahkan vitamin-vitamin yang larut dalam air.
6. Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah
biokimia.
C. Bagian-bagian HPLC
Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak
(Reservoir) pompa, alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi), kolom,
detektor, wadah penampung buangan fase gerak, dan suatu komputer atau
integrator atau perekam.
a. Wadah fase gerak (Reservoir)
Wadah fase gerak harus bersih dan lembam (inert). Wadah pelarut kosong
ataupun labu laboratorium dapat digunakan sebagai wadah fase gerak. Wadah ini
biasanya dapat menampung fase gerak antara 1 sampai 2 liter pelarut. Fase gerak
sebelum digunakan harus dilakukan deggasing (penghilangan gas) yang ada pada
fase gerak. Sebab adanya gas dalam fase gerak akan mengganggu detektor
sehingga akan mengacaukan hasil analisis. Fase gerak biasanya terdiri atas
campuran pelarut yang dapat bercampur yang secara keseluruhan berperan dalam
daya elusi dan resolusi. Daya elusi dan resolusi ini ditentukan oleh polaritas
keseluruhan pelarut, polaritas fase diam, dan sifat komponen-komponen sampel.
Untuk fase normal (fase diam lebih polar daripada fase gerak), kemampuan elusi
meningkat dengan meningkatnya polaritas pelarut. Sementara untuk fase terbalik
(fase diam kurang polar daripada fase gerak), kemampuan elusi menurun dengan
meningkatnya polaritas pelarut.
b. Pompa
Pompa yang cocok digunakan untuk HPLC adalah pompa yang mempunyai
syarat sebagaimana syarat wadah pelarut yakni: pompa harus inert terhadap fase
gerak. Bahan yang umum dipakai untuk pompa adalah gelas, baja tahan karat,
Teflon, dan batu nilam. Pompa yang digunakan sebaiknya mampu memberikan
tekanan sampai 5000 psi dan mampu mengalirkan fase gerak dengan kecepatan
alir 3 mL/menit. Untuk tujuan preparatif, pompa yang digunakan harus mampu
mengalirkan fase gerak dengan kecepatan 20 mL/menit.
Tujuan penggunaan pompa atau sistem penghantaran fase gerak adalah untuk
menjamin proses penghantaran fase gerak berlangsung secara tepat, reprodusibel,
konstan, dan bebas dari gangguan. Ada 2 jenis pompa dalam HPLC yaitu: pompa
dengan tekanan konstan, dan pompa dengan aliran fase gerak yang konstan. Tipe
pompa dengan aliran fase gerak yang konstan sejauh ini lebih umum
dibandingkan dengan tipe pompa dengan tekanan konstan. Tiga jenis pompa yang
digunakan dalam HPLC:
Pompa reciprocating
Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan
cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Piston berupa gelas
dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas
bawah terangkat dan pelarut masuk, sebaliknya ketika piston maju maka bola
bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa
didorong masuk ke dalam kolom.
Pompa displacement
Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang
dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan
aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas
pelarut.
Pompa pneumatic
Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. Pompa jenis
ini murah dan bebas pulsa. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan
tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada
viskositas pelarut dan takanan balik kolom.
c. Tempat Injeksi
Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan
disturbansi yang minimum dari material kolom. Sampel yang akan dipisahkan
dimasukkan ke dalam kolom secara otomatis atau manual melalui injeksi. Volume
injeksi sangat tepat karena mempunyai sampel loop dengan variabel volume
(misalnya 20 500 L).
d. Kolom
Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom
mikrobor. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk
berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.
Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan
kolom konvensional, yakni:
1. Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil
dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor
kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 l/menit).
2. Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor
lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa.
3. Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat,
karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas
misal sampel klinis.
Meskipun demikian, dalam prakteknya, kolom mikrobor ini tidak setahan kolom
konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin.
e. Detektor
Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor
universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum, tidak bersifat spesifik, dan
tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri
massa; dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit
secara spesifik dan selektif, seperti detektor UV-Vis, detektor fluoresensi, dan
elektrokimia.
Idealnya, suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut:
a. Mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel;
b. Mempunyai sensitifitas yang tinggi, yakni mampu mendeteksi solut pada kadar
yang sangat kecil;
c. Stabil dalam pengopersiannya;
d. Mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran
pita;
e. Signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran
yang luas (kisaran dinamis linier);
f. Tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak.