Anda di halaman 1dari 11

KarakterisasiEnzimSelulase PMP0126Y dariLimbah PengolahanAgar (Ekowati Chasanahetal.

KARAKTERISASI ENZIM SELULASE PMP 0126Y DARI


LIMBAH PENGOLAHAN AGAR

Characterization of PMP 0126Y Cellulase Enzyme from


Agar Processing Waste

Ekowati Chasanah1*, Isna Rahma Dini2, dan Nisa Rachmania Mubarik3


1
Balai Besar Penelitian dan Pengembangan PengolahanProduk dan Bioteknologi Kelautan dan Perikanan, KKP.
Jl.KSTubun,Petamburan VI,Jakarta 10260
2
Program StudiAgroteknologi Fakultas Pertanian, Universitas Riau, Riau
3
ProgramStudiBioteknologiPascaSarjanaIPB, Bogor
Korespondensi Penulis: ekowatichasanah@gmail.com

Diterima:29April2013Disetujui:10Oktober2013

ABSTRAK

Hasil penapisan bakteri penghasil enzim selulase terdahulu mendapatkan isolat PMP 0126
sebagai isolat yang berpotensi yang diisolasi dari limbah pengolahan agar skala UKM di
Pamengpeuk, Garut. Isolat tersebut ternyata belum merupakan koloni tunggal, terdiri dari 2 isolat
bakteriyaituPMP0126YdanPMP0126W.IsolatPMP0126Ymemilikikemampuanmendegradasi
selulosa yang lebih besar dibanding PMP 0126W. Tujuan dari penelitian ini adalah untuk
memproduksi dan mengkarakterisasi enzim selulase dari isolat PMP 0126Y, serta mengidentifikasi
isolat tersebut. Hasil penelitian menunjukkan bahwa enzim selulase diproduksi optimum pada
hari ke-3 kultivasimenggunakan medium cair berisi CMC 1%. Enzim kasaryang diperoleh dapat
bekerja optimal pada suhu 30 C dan pH 5, dapat ditingkatkan aktivitasnya dengan ion logam
dalam bentuk garam CaCl2 dan ZnCl2 5 mM.. Pemurnian dengan sistem penukar anion dapat
meningkatkan aktivitas enzim 15x dengan perolehan 20%. Dari hasil SDS-PAGE terlihat bahwa
ada 3 selulase dengan perkiraan berat molekul 39, 30, dan 14 kDa. Enzim kasar ini memiliki
kemampuan menghidrolisis limbah pengolahan agar sebaik ketika memecah substrat CMC,
yang mengindikasikan bahwa enzim dari isolat ini berpotensi sebagai kandidat agen sakarifikasi
pada produksi bioetanol. Identifikasi bakteri dengan 16S-rDNA menunjukkan bahwa isolat ini
memiliki kemiripan 96% dengan bakteri Chryseobacterium indologenes McR-1.

KATA KUNCI: limbah pengolahan agar, selulase, karakterisasi, isolat PMP 0126Y

ABSTRACT

From previous screening study, PMP 0126 has been identified as one of potentially isolate
from medium scale agar processing industriesin Pamengpeuk, Garut. However, PMP 0126 was
notpure yet,containing2isolates PMP0126YandPMP0126W.PMP 0126Yproduced higher
celullasecomparedtothePMP0126W.AimsofthisstudywastoproduceandcharacterizePMP
0126Ycellulaseandidentifytheisolate.Resultshowedthatthecellulasewasoptimallyproduced
on the third days of cultivation using 1% CMC medium. Crude enzyme worked optimally at
temperatureof30CandpH5,andtheactivitycouldbeimprovedbyadditionof5mMCaCl2and
ZnCl2. Purification using anion exchangercould improve the activity 15 times with yield of 20%.
PMP 0126Y produced 3 cellulases with estimated molecular weight of 39, 30 dan 14 kDa. The
crude enzyme could degrade the agar processing waste as good as CMC, indicating that this
enzymecouldbe used assaccharificationagentforbioethanolprocessing fromagarprocessing
waste. Identification study showed that this isolate was 96% similar to Chryseobacterium
indologenesMcR-1.

KEYWORDS: agar processing waste, cellulase, characterization, PMP 0126Y isolate

PENDAHULUAN Tahun2014.Pusat-pusatbudidayarumputlauttelah
dikembangkan di seluruh wilayah Indonesia dan
Kem enterian Kelaut an Perikanan telah rencana pengembangan skala usaha industri
mencanangkanproduksihasilkelautandanperikanan pengolahanrumputlautbaikyangtelahadamaupun
termasukrumputlaut,sebesar353%sampaidengan yangakandikembangkantelahdirencanakanoleh

103
JPBPerikananVol.8No.2Tahun2013:103114

DirektoratPengolahanHasilPerikanan,Kementerian NasionalGunungHalimun(TNGH).Isolasiselulase
KelautandanPerikanan(Anon.,2012). bakteri darilingkunganlautdarirumputlautUlva
Industri agar dilaporkan menghasilkan limbah lactucatelahdilaporkan olehTrivedi et al. (2011).
sebesar 6575%, yang masih memiliki selulosa Shanmunghapriya et al. (2010) telah mengisolasi
sebesar19,7%(Kimetal.,2008),selulosamerupakan selulasedarisponslautDendrillanigra,sedangkan
jenis karbohidrat terbanyak nomor 2setelahkitin. Gaoetal.(2010)melaporkanbakteriselulolitikdari
Salahsatualternatifpemanfaatanlimbahrumputlaut tanahsekitarmangrove.
dariindustripengolahanrumput laut yaitudengan Dari kegiatan sebelumnya, penapisan bakteri
memprosesselulosayangmasihterkandungdalam selulolitiktelahdilakukanutamanyadarirumputlaut
limbahdengan jumlah yang cukup besar menjadi danlimbahpengolahanrumputlaut(Munifahetal.,
etanol. Pemanfaatan limbah selulosa dan bakteri 2011).Darikegiatantersebutdidapatkansalahsatu
penghasil enzim penghidrolisis selulosa dapat bakteri yang memiliki potensi sebagai bakteri
memberikanpeluangpadapengembanganbioenergi selulolitik, yaitu isolat PMP 0126 yang berhasil
daribahanhayatilaut. diisolasidarilimbahpengolahanagar-agarrumputlaut
Proseshidrolisisselulosadapatdilakukandengan Glacilariasp.daridaerahPameungpeuk,GarutJawa
menggunakanasamdansuhutinggi.Prosesinirelatif Barat(Munifahetal.,2011).Idedilakukannyaisolasi
mahalkarenamembutuhkanenergiyangbesarserta bakteridarilimbahrumputlautiniyaitudiperolehnya
dapatmengakibatkandegradasiprodukmonosakarida bakteriselulolitikhasil isolasiuntukmendegradasi
yangdihasilkansehinggaproduk yangdihasilkan selulosadarilimbahrumputlautekonomismaupun
rendah.Selainitu,Riyanti(2008)melaporkanefisiensi rumputlautnonekonomissebagaiagensakarifikasi
proseshidrolisisdenganasammasihrendahkarena untukproduksibioetanol.Sebagaimanadilaporkan
proses yang dilakukan cukup panjang dan oleh FAO (Anon., 2013) bahwa keberhasilan
membutuhkanbanyaktahapan.Kekuranganlaindari penggunaan selulosa untuk sumber karbon yang
prosesiniantaralainyaitupenangananlimbahasam bersifat dapat diperbaharui (bioenergi) sangat
yang tidak mudah. Hidrolisis selulosa dengan tergantung dari teknologi proses yang secara
menggunakanenzimselulasemulaidikembangkan ekonomismenguntungkanuntukproduksiselulase.
padatahun1980-an(Coraletal.,2002).Hidrolisis Selulaseyangdiproduksisecaralokaldiharapkanakan
secaraenzimatikmelibatkanprosesyanglebihramah banyakmengurangibebanbiayaproduksibioenergi/
lingkungan, efisien, dan murah karena tidak bioetanol.
memerlukanenergitinggi. IsolatPMP0126ternyatabelummurni,danhasil
Enzimselulasemerupakansistem enzimyang pemisahanlanjutanmendapatkan2isolatbakteridari
terdiri atas tiga tipe enzim utama yaitu endo- - isolat PMP 0126, yaitu isolat bakteri 0126Y dan
glucanase(EC3.2.1.4),exo--glucanase(EC3.2.1.91) 0126W.Darihasilpengujiankualitatifmenunjukkan
dan-glucosidase(EC3.2.1.21).Endo--glucanase, bahwaisolatPMP0126Ymemilikikemampuanlebih
1,4- -D-glucan glucanohydrolase, CMCase, Cx: besardalammemecahselulosa,yaitumenghasilkan
random memutus rantai pada selulosa dan indeksselulolitiksebesar1,9dibandingisolatPMP
menghasilkan glukosa dan oligosakarida. Exo- - 0126Wyangmenghasilkanindeksselulolitiksebesar
glucanase, 1,4- -D-glucan cellobiohydrolase, 1. Berdasarkan hasil pengujian kualitatif tersebut,
avicelase,C1akanmenghidrolisisselulosadarisisi makaselanjutnyaisolatPMP0126Ydigunakanuntuk
nonreduksi,menghasilkanselobiosasedangkan- penelitian ini. Tujuan dari penelitian ini adalah
glucosidase, cellobiase akan menghidrolisis memproduksidanmengkarakterisasienzimselulase
cellobiosamenjadiglukosa(Crueger&Crueger,1984; yang dihasilkan oleh isolat PMP 0126Y serta
Anon.,2013).Ketigaenziminibekerjasecarasinergis melakukanidentifikasibakteritersebut.
mendegradasiselulosadanmelepaskangulareduksi
(selobiosadan glukosa) sebagai produkakhirnya.
BAHAN DAN METODE
Enzimselulaseakanmemutuskanikatanglikosidik-
1,4 di dalamselulosa yang memiliki ikatan-1,4-
glikosidikpadapolimerglukosanyasehinggamenjadi Penyegaran dan identifikasi isolat PMP
gulasederhanaturunannya. 0126Y

PenapisanselulasediIndonesiatelahdilakukan Isolat PMP 0126Y disegarkan dengan cara


di antaranya dari tanah (Meryandini et al., 2009; menumbuhkanisolatpadamediapadatberisinutrient
Lisdiyantietal.,2012).Mangunwardoyoetal.(2011) agar(NA)dandiinkubasipadasuhu37C(24jam).
telah melaporkan selulase dari yeast yang telah Identifikasi berdasar gen 16S-rDNA dilakukan
diisolasidaritanah,airsungaidansedimenTaman mengikuti Suwanto et al. (2000). Analisis Cluster

104
KarakterisasiEnzimSelulase PMP0126Y dariLimbah PengolahanAgar (Ekowati Chasanahetal.)

terhadap urutan (sekuens) basa pada gen hasil gula pereduksi per menit padakondisi pengujian.
amplifikasiPCRdilakukanmenggunakanEuropean AktivitasenzimdihitungberdasarkanIrawanet al.
Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk) dan (2008).
NationalCenterBiotechnologyInformation(NCBI),
sedangkan pembuatan pohon kekerabatan Pemurnian Enzim Selulase
(phylogenetictree)dilakukanmenggunakanprogram Pemurnian enzim dilakukan dengan metode
Treecon(VandePeer&DeWatcher,1993). penukarionmengikutiLi-Jungetal.(2010)dengan
modif ikasi. Pemurnian dilakukan dengan
Kurva pertumbuhan dan waktu produksi menggunakanAktapurifier.Sebagaifasediamnya
enzim adalahDEAESepharoseTMFastFlow(Amersham-
Bioscience,UpsallaSweden),danbuferTris-HCl0,05
KurvapertumbuhanisolatPMP0126Ydilakukan
MpH8dengangradienkonsentrasiNaCldalamTris-
mengikutiLee(2006)dengancaramenumbuhkan
Cl0,05MpH8sebagaifasegeraknya.Elusiprotein
isolatkedalam10mlnutrientbroth(NB)dandiinkubasi enzimtargetdilakukandenganmengalirkangradien
selama1214jam.Kulturdiinkubasipadasuhu30C NaCl0-0,5M.
di dalam penangas goyang (Shel Lab) dengan
kecepatan agitasi 150 rpm. Sampling dilakukan Analisis Elektroforesis SDS-PAGE dan
selama27jamdenganrentangwaktusampling3jam Zimogram
untukdiukurnilaiOpticalDensity(OD)padapanjang
600nm.Penghitunganjumlahkolonitotalpada SDS-PAGEdilakukanmenurutBollag&Edelstein
cawan(TPC)jugadilakukanuntukmemperkirakan (1991) dengan menggunakan 10% poliakrilamida
sebagaigelpemisahdan4%poliakrilamidasebagai
jumlah sel bakteri pada setiap nilai OD yang
gelpengumpulataupenahan.Elektroforesisdilakukan
dihasilkan.
padategangan100voltdan50mAdidalampiranti
Penentuan waktu produksi enzim selulase elektroforesis(AmershamBioscience,Swedia).
menggunakanstarter10%yangdilakukanpadaskala Zimogram dilakukan dengan mengembangkan
25mlmediacairyangmengandungCMC1%dalam metoda Nack-Shick et al. (2006). Substrat 0,1%
250mlerlenmeyer.Pengambilansampeldilakukan ditambahkanpadagel,dansetelahselesaiproses
setiap hari selama6 hari waktu inkubasi. Larutan elektroforesis,renaturasi dilakukanpada gelyang
sampel disentrifugasi pada suhu 4 C dengan mengandung substrat tersebut dengan cara
kecepatan9000xgselama10menit,dansupernatan merendamgeldidalam2,5%TritonX-100selama
yangdihasilkanberupaenzimkasarekstraseluleryang satujamsambildigoyangkonstan.Gelditiriskandan
kemudiandiujiaktivitasnya. direndamdalam0,05MbufersitratposfatpH5selama
1,52jamsambildigoyangperlahandalaminkubator
Pengujian aktivitas enzim goyang padasuhu 30 C. Kemudian gel diwarnai
dengan0,1%congoredselama30menit,selanjutnya
Pengujian aktivitas enzim dilakukan dengan
direndamdengan1MNaClselama15menit.Zona
menggunakanmetodeDNSWood(1988)dalamArifin
beningdisekitarpitamenunjukkanadanyaaktivitas
(2006)yangdimodifikasi.Substrat(1,8ml)dalam0,1
enzim.
MbufersitratfosfatpH5ditambahdengan0,2ml
enzimkasar,dikocokkuatdenganvortex,selanjutnya Pengukuran Kadar Protein
diinkubasiselama30menitpadasuhu30C.Reaksi
enzimdihentikandenganmencelupkan(10menit) Pengukuran kadar protein dilakukan dengan
campuran reaksi ke dalam penangas berisi air menggunakanmetodeBradford(1976).
mendidih. Setelah itu, diambil campuran reaksi
Karakterisasi Enzim
sebanyak 1 ml, ditambah dengan1 ml DNS, dan
dipanaskan dalam air mendidih selama15menit. Penentuan pH optimum dilakukan dengan
Setelahdingin,absorbansidiukurpada575nm. mereaksikan enzim dan substrat yang memiliki
Perlakuan kontrol dan blanko dilakukan secara berbagaitingkatanpHyaitupH3,4,5(0,05Mbufer
bersamaandengantahapanyangsama.Padakontrol, asetat),pH5,6,7(0,05Mbuffersitratfosfat),danpH
enzimyangakandireaksikandengansubstrattelah 7, 8, 9 (0,05 M bufer Tris HCl). Penentuan suhu
diinaktivasi terlebih dahulu dengan memanaskan optimumdilakukandenganmereaksikansubstratdan
enzim selama 15 menit dalam air mendidih. enzim pada tingkatan suhu antara 30 C sampai
Sedangkanpadablanko,larutanenzimdigantidengan dengan90Cdenganselang10Cselama30menit
akuadesuntukdireaksikandengansubstrat.Aktivitas waktuinkubasi.Pengukuranstabilitaspanasenzim
selulasedinyatakandalamsatuaninternasionalyaitu dilakukan dengan memanaskan enzim selulase
U/ml. Satu unit merupakan jumlah enzim yang selama15,30,45,60,90,120,dan240menitpada
dibutuhkanuntukmemecah1molselulosamenjadi suhuoptimumenzim.

105
JPBPerikananVol.8No.2Tahun2013:103114

Pengujian substrat spesifik dilakukan dengan nukleotidadaribakteriChryseobacteriumindologenes


mengujiselulasePMP0126Ypadaberbagaisubstrat galur McR-1. Gambar 1 memperlihatkan pohon
(CMCteknisdanCMCmurni,avisel,kertasWathman filogenetikyangmenggambarkanposisiisolatPMP
filterpaperNo.1,limbahrumputlautpengolahanagar 0126Y dengan beberapa bakteri genus
PT.Agarindo,limbahrumputlautpengolahanagar Chryseobacterium dan bakteri penghasil enzim
Pemeungpeukdanlimbahpengolahanalginatdari selulase.
rumputlautSargassum).Aktivitasdiukurpadakondisi
(suhudan pH)optimal enzim tersebut.Kestabilan Yi-Tsungetal.(2010)melaporkanbahwa6species
enzim pada bahan aditi f dil akukan dengan Chryseobacteriumyangsebelumnyamasukdalam
menggunakan5mMdan10mMionlogamKCl,NaCl genusFlavobacteriummerupakanbakteriyangnon-
(monovalen), CaCl 2. 2H 2O, MgSO 4. 7H 2O, ZnCl 2 motile, positif katalase, positif oksidase, positif
(divalen),danFeSO4.7H2O(trivalen). penghasil indol dan tidak mampu menggunakan
glukosa dalam fermentasi. Chryseobacterium
indologenesdapatditemukandialamsecaramudah,
HASIL DAN BAHASAN tetapibukantermasukbakteriyangkeberadaannya
IsolatPMP0126Yyangdigunakanpadapenelitian normal dan jarang yang bersifat patogen pada
merupakanhasilpemurnianulangisolatPMP0126 manusia,tetapibersifatpatogendiikan.Karenaitu,
penghasil enzim selulaseyang telah diisolasi dari keberadaanbakteri inidi limbah pengolahanagar
limbah pengolahan rumput laut hasil penapisan bukanindikasilimbahtersebutsudahtercemaroleh
sebelumnya (Munifah et al., 2011). Dari 2 hasil kotoranataupunpenangananmanusia,tetapilebih
pemurnianulangdiperoleh2isolatyaituPMP0126Y padakeberadaanbakteriiniyangmudahditemukan
danPMP0126P,selanjutnyaisolatPMP1026Ydipilih dialamdankebetulansesuaidengankondisilimbah
untukdigunakandalampenelitianinidandilakukan tersebut.Sampai dengansaatinibelumdiperoleh
identifikasiulang.Darihasilpewarnaangram,isolat informasi tentang selulase dari bakteri tersebut,
PMP1026YadalahbakteriGramnegatifberbentuk Chryseobacterium sp telah dilaporkan Riffel &
bat ang pendek. Berdasarkan identif ikasi Brandelli, 2002 dalam El-Ayouty et al. (2012)
menggunakanprimer16Sr-DNA,isolatPMP0126Y menghasilkankeratinase.Akantetapi,selulasedari
memilikikemiripansebesar96%dari1282nukleotida Flavobacteriumsp.F52telahdilaporkan(Tsujietal.,
yangoverlapped(bertumpangtindih)dengan1234 2013).

Gambar1.PohonfilogenetikisolatPMP0126Y.
Figure1.PhylogenetictreeofisolatPMP0126Y.

106
KarakterisasiEnzimSelulase PMP0126Y dariLimbah PengolahanAgar (Ekowati Chasanahetal.)

Hasilisolasiselulasedaritanahpeatmenghasilkan padafasestationerenzimtersebutakandirombak
bakteriselulolitikBacilluspumilus,Bacilluscereus, oleh isolat PMP 0126Y untuk mempertahankan
Paenibacilluselgii,danBacillussp.lainnya,dimana hidupnyadiantaranyasebagaisumberenergi.Pada
selulase yang dihasilkan dilaporkan bersifat waktu puncak tersebut, aktiv itas enzim yang
thermozyme(Lisdiyantietal.,2012).DokumenFAO didapatkan adalah 0,120 U/ml. Penelitian yang
CorporateDocumentRepositorytentangRenewable dilakukan oleh Lisdiyanti et al. (2012) yang
biologicalsystemsforalternativesustainableenergy mengisolasiselulasedaribakteriselulolitikdaritanah
productionmenyebutkanbahwafungi,Actinomycetes peat(gambut)menghasilkanselulasedenganaktivitas
danbakterimerupakanmikroorganismepenghasil 0,0213,082U/ml.Jikadibandingkandenganselulase
selulase yang representatif, dan untuk bakteri dari tanah peat, selulase dari limbah pengolahan
penghasilselulasemakajenisyangsudahtercatat rumputlautuntukproduksiagarmasihdalamkisaran
adalah Clostridium thermocellum, Ruminococcus rendah, meskipun masih dalam kisaran aktivitas
albus,Streptomycessp.(Anon.,2013).Trivedietal. selulase yang didapat dari tanah gambut (peat).
(2011)melaporkanbakteriselulolitikdarirumputlaut Produksienziminiselainditentukanolehjenissumber
UlvalactucayangmemilikikemiripandenganBacillus enzimjugasangatditentukanolehkomposisimedium
lectus strain SV6. Shanmunghapriya et al. (2010) (Deswaletal.2011)dankonsentrasisubstrat(Reczey
telahmengisolasibakteriselulolitikMarinobactersp. etal.1996).
(MSI032)darisponslautDendrillanigra,sedangkan Sel anjut nya enzim diproduksi dengan
Gaoetal.(2010)melaporkanVibriopenghasilselulase menggunakanwaktuproduksi3hari(Gambar2),suhu
daritanahsekitarmangrovediperairanCina. kultivasi30Cdidalampenangasgoyang(ShelLab)
Ketika ditumbuhkan pada media cair yang dengan kecepatan agitasi 150 rpm. Enzim
mengandungCMC1%, isolat PMP 0126Y segera ekstraseluler kasar yang diperoleh kemudian
masukpadafaselogaritmiksampaidenganjamke dimurnikan.Pemurniandilakukandenganpenukarion,
21(hari1),yangdilanjutkandenganfasestasioner denganmenggunakanmatriksDEAESepharoseFast
danfasedeclining(Gambar2).DariGambar2terlihat Flowsebagaifasediam,dangradienNaClsebagai
bahwa enzim selulase diproduksi mulai dari fase fase geraknya. Gambar 3 memperlihatkan profil
logaritmik dan maksimum pada fase stationer. Ini pemurnian enzim selulase PMP 0126Y, yang
mengindikasikan bahwa isolat PMP 0126Y yang memperlihatkan1puncakproteinpadafraksi49-51
diperolehdarilimbahpengolahanagarmemproduksi elusiNaCl0,406M.PengecekandenganSDS-PAGE
selulasesebagaialatuntukmemecahselulosayang danzimogrammemperlihatkanbahwahasilpemurnian
adadilimbahtempathidupnyauntukmendapatkan fraksi4951,52,dan55masihmemilikibanyakpita
sumberCdanNsederhanayangbisadigunakanisolat protein,yangmenandakanbahwapemurniandengan
tersebut untuk tumbuh. Produksi maksimal yang sistemtersebutmasihbelummampumemurnikan
terdeteksi pada fase stationer diduga merupakan secaramaksimal.Secaraumum,strategipemurnian
kumulatifdariproduksisebelumnyayangselanjutnya enzimmelibatkanlebihdari1tahappemurnian.Pada
NumberofBacteria(Log10cfu/ml)
SpeciificActivity(U/mg)
AktivitasSpesifik/

JumlahBakteri/

Waktu/Time(hari/days)
Aktivitas Spesifik Log Sel

Gambar2.KurvaproduksiselulasedanjumlahselbakteriPMP0126Yselamapertumbuhan.
Figure2.ProductioncurveandcellnumberofPMP0126Yisolateduringcultivation.

107
JPBPerikananVol.8No.2Tahun2013:103114

sistempemurnianyangdilakukanolehLi-Jungetal. menunjukkanbahwawaktuinkubasigelterbaikadalah
(2010), enzim selulasemurni terlihat sebagai pita 60menitdenganmenggunakanbufersitratfosfatpH
tunggalketikadigunakan2sistempemurnianyaitu 5,setelahtahapanrenaturasidenganlarutan2,5%
sistempenukarionyangdilanjutkandengansistem Triton X-100 selama 1 jam. Hasil zimogram
gelfiltrasi.HasilpemurnianselulasedariisolatPMP menunjukkan adanya tiga molekul protein yang
0126Y telah diringkas pada Tabel 1, yang memilikiaktivitasselulolitikdenganperkiraanberat
menunjukkan bahwa pemurnian dengan tahap molekul39,30,14kDayangdihitungberdasarkan
pemurnian tunggal DEAE SepharoseTM Fast Flow mobilitasrelatifterhadapstandarprotein(Gambar5).
tersebut mampu meningkatkan aktivitas enzim HasilpenelitiantentangselulasedariBacillussubtilis
sebesar16xdenganperolehan5%. YJ1melaporkanberatmolekulselulase32,5kDa.
SelulasedariBacillussubtilisYJ1dilaporkantelah
Hasil SDS-PAGE telah dikonfirmasi dengan dimurnikandengansistemyangsamayaitupenukar
analisiszimogram.Hasilzimogramditandaidengan ion, dengan Macro-Prep yang dilanjutkan dengan
terbentuknyazonabeningpadagelyangmenunjukkan sistempemurniandengangelfiltrasiBio-GelP-100
adanyaaktivitasselulaseyangdihasilkanpadagel kromatografi dan berhasil mendapatkan satu pita
akrilamida yang mengandung 0,1% CMC. Hasil proteinmurni.Perolehanyangdidapatdengansistem
optimasiuntukmendapatkanvisualisasiyangbaik tersebutadalah9,7%(Li-Jungetal.,2010).

Gambar3.ProfilelusiselulasemenggunakanpenukariondenganmatriksDEAESepharose.
Figure3.ElutionprofileofcellulaseusingionexchangeofDEAESepharosematrix.

Tabel1. PemurnianpartialselulasePMP0126Y
Table1. PartialpurificationofPMP0126YCelulase

Aktivitas Konsentrasi Aktivitas


Aktivitas/
Total/ Protein/ spesifik/ Hasil/
Volume Activity Kemurnian/
Tahap/Steps Total Protein Specific Yield
(ml) (U/ml) Purity
Activity Concentration Activity (%)
(U) (mg/ml) (U/mg)
Ekstrakkasar/
500 0.064 32.00 0.750 0.086 1.000 100
CrudeExtract
Ultrafiltrasi/
50 0.112 5.60 0.822 0.136 1.581 17.5
Ultrafiltration
Penukarion/Ion
exchanger (fraksi/ 12 0.143 1.72 0.105 1.362 15.84 5.4
fraction 49,50,51)

108
KarakterisasiEnzimSelulase PMP0126Y dariLimbah PengolahanAgar (Ekowati Chasanahetal.)

Gambar4. HasilelekroforesisSDSPAGEenzimdariPMP0126Y.(A:Penandaberatproteinrendah,B:
Ultrafiltrasi,C:Fraksi55,D:Fraksi49-51,E:Fraksi52).
Figure4. ResultofSDS-PAGEofPMP0126Ycellulasecrudeenzyme.(A:Proteinlowmolecularweight
marker,B:Ultrafiltrasi,C:Fraksi55,D:Fraksi49-51,E:Fraksi52).

Hasilkarakterisasienzimselulasemenunjukkan Hasilujistabilitaspadavariasisuhu30,40,dan
bahwaenzimkasardanenzimmurnidariisolatPMP 50CyangdiperlakukanpadaenzimselulasePMP
0126YmenunjukkanpHoptimumyangsamayaitu 0126Ymemperlihatkanbahwasampaidengan4jam
pH 5dengan buferyangsesuaiuntuk selulaseini pengamatanenzimselulaserelatifstabilpadaketiga
adalahbuferfosfat(Gambar6).Namundemikian, suhutersebutyangdiperlihatkandenganhasilbahwa
terdapat pergeseran suhu optimal; enzim kasar ketigaperlakuanpanastidakmenyebabkanpenurunan
memiliki suhu optimal untuk aktif pada 30C, aktivitasdibawah50%aktivitasawal(Gambar8).
sedangkan enzim yang telah dimurnikan secara DibandingkandenganselulasedariBacillusflexus
parsialdengankromatografipenukaranionmemiliki NTyangdiisolasidarirumputlautUlvaflexusyang
suhu optimum 40C (Gambar 7). Perbedaan ini dibusukkan,terdapatperbedaankaraktersepertiberat
disebabkanolehmasihterdapatnyamateri-materilain molekul,pHdansuhuoptimalenzim.Selulasedari
sepertigaram,proteinnonenzimdanlain-lain,yang limbahpengolahanagaryangdiproduksidariisolat
dapatberfungsisebagaipelindungenzim. PMP012YmemilikipHoptimal5danbekerjaoptimal

Gambar5. HasilzimogramPMP0126Y(M:MarkerproteinrendahA:Enzimhasilultrafiltrasi,B:Fraksi
KPA.
Figure5. ZymogramanalysisofPMP0126Ycellulase(Note:M=marker;A=crudeenzyme;B=enzyme
frompartialpurification).

109
JPBPerikananVol.8No.2Tahun2013:103114

Aktvitas Enzim/Enzyme Activity (U/ml)


0.16
0.14
0.12
0.10
0.08 Enzim kasar/
Crude enzyme
0.06
Enzimmurni/
0.04 Pure enzyme
0.02
0
3 4 5 5 6 7 7 8 9

Asetat/Acetat Fosfat/ Sitrat/Citrate


phosphate

pH danBufer yang Digunakan/pH and BufferUsed

Gambar6.PengaruhpHterhadapaktivitasselulasePMP0126Y.
Figure6.EffectofpHtoPMP0126Ycellulase.

padasuhu30C,mampuditingkatkanaktivitasnyaoleh terdapat tahapan penambahan CaO (5%) yang


Ca2+danMg2+padakonsentrasi5mMdansedikit ditujukansebagaiagenpemucatrumputlaut,yang
ditingkatkanolehadanyaFe2+dalambentukgaram dilakukanpadatahapawalpengolahan.Selanjutnya
klorida.SelulasedarirumputlautUlvaflexusmemiliki dalam proses ekstraksi agar, pH yang digunakan
ketahananterhadapalkalidangaram,pHdansuhu adalahpH5-6yangditujukanuntukmempermudah
optimal 10 dan 45C, serta dapat ditingkatkan
prosestersebutdenganpenambahanasamasetat
aktivitasnyaolehionlogamCd2+danLi2+dandihambat
ataufosfat.Karenaitudapatdimengertibahwabakteri
oleh adanya Cr2+, Co2+, Zn2 (Trivedi et al. 2010).
Perbedaankaraktertersebutdisebabkanolehbanyak yang tumbuh di limbah pengolahan agar akan
hal, diantaranya oleh sumber mikrobanya, serta beradaptasi dengankondisi inidanmengeluarkan
lingkungantempatmikrobatersebutdiisolasi.Pada enzimyangbekerjayangsesuaidengankondisiyang
selulaseyangdiperolehdarilimbahpengolahanagar, ada,diantaranyabekerjadenganbaikpadapH5dan
tampaknya proses pengolahan mempengaruhi adanyaionkalsium.SelainCa,ionMgjugamampu
karakterdariselulasenya.Peningkatanaktivitasoleh meningkatkanaktivitasselulaseyangdiisolasidari
ionCadidugakarenadalamprosespengolahanagar, limbahpengolahanagarini.
Aktivitas Selulase/Cellulase Activity(U/ml)

Ultrafiltrasi/
Ultrafiltration
Enzim murni/
Pure enzyme

Suhu/Temperature(C)

Gambar7.PengaruhsuhuterhadapaktivitasselulasekasardanmurnidariPMP0126Y.
Figure7.EffectoftemperatureoncrudeandrelativelypurePMP0126Ycellulase.

110
KarakterisasiEnzimSelulase PMP0126Y dariLimbah PengolahanAgar (Ekowati Chasanahetal.)

AktivitasRelatif/RelativeActivity(%)

PerlakuanPemanasan/HeatTreatment(menit/minute)

30 40 50

Gambar8.StabilitaspanasselulasePMP0126Ypadasuhu30C,40C,50C.
Figure8.HeatstabilityofPMP0126Ycellulaseon30C,40C,50C.
AktivitasRelatif/RelativeActivity(%)

Ionlogam/Metalion
5mM 10mM

Gambar9. Penambahanionlogam(5mMdan10mM)danpengaruhnyaterhadapaktivitasrelatifselulase
kasardariisolatPMP0126Y.
Figure9. Additionofionmetal(5mMdan10mM)anditseffecttorelativeactivitycrudePMP0126Y
cellulase.

Pengujian aktivitas selulase PMP 012Y pada biomasadarimakroalgaataurumputlautmemiliki


berbagai substrat menunjukkan bahwa aktivitas keuntungan dengan rendahnya lignin dan
tertinggidihasilkanketikasubstratyangdigunakan hemiselulosa. Dalam penelitian ini terlihat bahwa
adalahlimbahrumputlautdaripengolahanagaryang selulasePMP0126Ymampumenggunakanlimbah
diikutidenganlimbahrumputlautdaripengolahanagar- rumputlautyangtelahdiperlakukandenganNaOH
agarPT.Agarindo,keduanyatelahdipretreatment 6%sebagaisubstratsebaikCMCmurnidanteknis
dengan NaOH 6% (Gambar 10). Pre treatment (Gambar10).
ditujukanuntukmenyiapkansubstratagarlebihmudah Hasilpenelitianinimenunjukkanbahwaselulase
diakses oleh enzim selulase. Dibanding dengan PMP0126Yinimemilikipotensiuntukmenjadiagen
biomassa lignoselulosa dari limbah pertanian, pendegradasisubstratlimbahpengolahanrumputlaut,

111
JPBPerikananVol.8No.2Tahun2013:103114

CelullaseActivity(U/ml)
AktivitasSelulase/

SubstratSelulosa/CellulosaSubstrate
Gambar10. AktivitasselulasePMP0126Ypadaberbagaisubstrat(a.CMCmurni,b.CMCteknis,c.Avisel,
d.kertasWhatmanNo.1,e.limbahagar-agarPTAgarindoNaOH6%,f.limbahalginat,g.limbah
agar-agarPameungpeukNaOH4%,h.limbahagar-agarPameungpeukNaOH6%,dani.limbah
agar-agarPameungpeukH2SO41%).
Figure10. PMP0126Ycellulaseactivitytowardvarioussubstrate(a.pureCMC,b.technicalCMC,c.Avisel,
d.WhatmanNo.1,e.PTAgarindowastetreatedwithNaOH6%,f.Alginatprocessingwaste,g.
WastefromPameungpeukagarprocessingtreatedwithNaOH4%,h.WastefromPameungpeuk
agarprocessingtreatedwithNaOH6%,dani.WastefromPameungpeukagarprocessingtreated
withH2SO41%).

yangterlebihduludiperlakukandenganNaOH6%. sustainableenergyproduction.http:www.Publikasir/
Aplikasienziminidalamskalalebihbesardiperlukan 2013/bioethanol/3.2%20Cellulase%20production.
untukpengecekanefisiensienzimtersebutsebagai htm. Diakses pada tanggal 26 Juli 2013.
agenbiologidalamprosessakarifikasilimbahrumput Arifin,H.2006. Bacterial Cellulase from A LocalIsolate
lautpengolahanagar. Bacillus pumilus EB3. Tesis. Universitas Putra
Malaysia, Kuala Lumpur.
Bollag, M.D. and Edelstein, S.J. 1991. Protein Method.
KESIMPULAN New York: W iley-Liss.
Bradford,M.M.1976.ARapidandsensitivemethodefor
DariisolatPMP0126Yyangmemilikikemiripan the quantitation of micogram quantitaties of protein
96% denganChryseobacterium indologenes galur inutilizingtheprincipleofprotein-dyeBinding.J.Anal
McR-1telahdidapatkanenzimselulaseyangdapat Biochem. 72: 248254.
bekerjaoptimalpadapH5dansuhu30C.Enzim Choi, Chung, N.S.D.M., Ryu,C.H.,Yoon, K.S., Maeng,
selulasetersebutmampuditingkatkanaktivitasnya P.J., and Kim, S.H. 2006. Identification of Three
olehCa2+danMg2+padakonsentrasi5mMdalam Extracellular Proteases from Bacillus subtilis KCTC
bentukgaramklorida.KeberadaanZnCl2baikpada 3014. J. Microbiol. Biotechnol. 16(3): 457464.
konsentrasi5maupun10mMdapatmenghambat Coral,G.,Arikan,B.,Nisa,U.M.,andGuvenmez,H.2002.
aktivitas enzim. Isolat PMP 0126Y memproduksi Some properties of crude carboxylmethyl cellulase
paling sedikit 3 selulase dengan perkiraan berat ofAspergillusnigerZ10wild-typestrain.Turk.J.Biol.
molekul39,30,dan14kDayangdapatdideteksidari 26: 209213.
analisiszimogram.SelulasePMP0126Yinimemiliki Crueger,W.andCrueger,A.1984.Biotechnology.InBrock
potensisebagaiagensakarifikasiselulosayangada T.D. (ed.). Textbook of Industrial Microbiology.
Sunderland: MinuaerAssociates. 267276 pp.
padalimbahpengolahanrumputlautkarenamampu
menghidrolisis limbah rumputlaut sebaik substrat Deswal, D., Khasa, Y.P., and Kuhad, R.C. 2011 .
Optimization of cellulase production by a brown rot
CMC.
fungus Fomitopsis sp. RCK2010 under solid state
fermentation. Bioresour. Technol. 102: 60656072.
DAFTAR PUSTAKA Gao,Z.,Ruan,L.,Chen,X.,Zhang,Y.,andXu,X.2010.A
novel salt-tolerant endo-beta-1,4-glucanase Cel5A
Anonim. 2012. Roadmap Rumput Laut. Dirjen P2HP, in Vibrio sp. G21 isolated from mangrove soil. Appl.
KKP. Microbiol. Biotechnol. 87(4): 13731382.
Anonymous.2013.FAOCorporatedocumentRepository Irawan, B., Sutihat, dan Sumardi. 2008. Uji aktivitas
onRenewable biological systems for alternative selulase dan lipase pada mikrofungi selama proses

112
KarakterisasiEnzimSelulase PMP0126Y dariLimbah PengolahanAgar (Ekowati Chasanahetal.)

dekomposisi limbah cair kelapa sawit dengan Reczey,K.,Szengyel,Z.,Eklund,R.,andZacchi,G.1996.


pengujian kultur murni. Prosiding Seminar Hasil Cellulase production by Trichodermareesei.
Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat. Bioresour. Technol. 57: 2530.
Lampung: Universitas Lampung. 284291 pp. Riyanti, E.I. 2008. Biomassa sebagai bahan baku
Kim,G.S.,Myung,K.S.,Kim,Y.J.,Oh,K.K.,Kim,J.S.,Ryu, Bioetanol. Balai Besar Penelitian dan
H.J., and Kim, K.H. 2008. Methode of Producing Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya
Biofuel Using Sea Algae. World Intelectual Property Genetika Pertanian, Institut Pertanian Bogor, Bogor.
Organization, Seoul. Shanmunghapriya,S.,Kira,G.S.,Selvin,J.,Thomas,T.A.,
Lee, Y.K. 2006. Bioprocess technology In Microbial and Rani C. 2010. Optimization, Purification, and
Biotechnology:Principles and Application,Edited by Characterization of Extracellular Mesophilic Alkaline
Yun Kun Lee. W orld Scientific Publishing, sec.ed. Cellulase from Sponge-AssociatedMarinobactersp.
2372 pp. MSI032. Applied Biochemistry & Biotechnology.
Li-JungYin, Lin,H.H.,andXiao,Z.R.2010.Purification 162(3): 625640.
and Characterization of A Cellulase from Bacillus Suwanto,Yogiana,Suryanto,D.,Tan,I.,andPuspitasari,
Subtilis Yj 1. Journal of Marine Science and E. 2000. Selectes Protocols Training Course on
Technology. 18(3): 466471. AdvancesinMolecularBiologyTechniquestoAsses
Lisdiyanti,P.,Suyanto,E.,Gusmawati,N.F.,andRahayu, MicrobialDiversity.Bogor:SEAMEO-BIOTROP.p.22
W. 2012. Isolation and characterization of cellulase 31.
produced by cellulolytic bacteria from peat soil of Trivedi,N.,Gupta,V.,Kumar,M.,Kumari,P.,Reddy,CRK.,
Ogan Komering Ilir, South Sumatera. International andJha,B.2011.Analkali-halotolerantcellulasefrom
Journal of Environment and Bioenergy. 3(3): 145 Bacillus flexus isolated from green seaweed Ulva
153. lactuca. Carbohyd Polym. 83: 891897.
Mangunwardoyo, W., Aprilismulan, Oetari, A., and Tsuji, A., Tominaga, K., Nishiyama, N., and Yuasa, K.
Sjamsuridzal W. 2011. Screening Cellulose Activity 2013. Comprehensive enzymatic analysis of the
of Yeast Isolated from Soil, Sediment and W ater cellulolytic system in digestive fluid of the sea hare
Riverfrom Taman Nasional Gunung Halimun, West Aplysia kurodai. EfficientGlucose Release from Sea
Java, Indonesia. Malaysian Journal of Microbiology. Lettuce by Synergistic Action of 45 kDa
7(4): 210216. Endoglucanase and 210 kDa -Glucosidase. Plos
OneJournal. 8(6):e65418.
Meryandini,A.,Widosari,W.,Maranatha,B.,Sunarti,T.C.,
Rachmania N., dan Satria, H. 2009. Isolasi bakteri Van de Peer Y. and De Watcher. 1993. TREECON: a
selulolitik dan karakterisasi enzimnya. Makara Sains. software package for the construction and drawing
13(1): 3338. ofevolutionarytrees.Comput. Applic Biosci.9:177
182.
Munifah, I., Chasanah, E. and Fawzya, Y.N. 2011.
Screening of cellulolytic bacteria from Indonesias Yassin,M.,El-Ayouty,AmiraEL-said,andSaLama,A.M.
marine environment. Di dalam: Prosiding Seminar 2012.Purificationandcharacterizationofakeratinase
ISISM (International Seminar of Indonesian Society from the feather-degrading cultures of Aspergillus
forMicrobiology);Bogor,26Juni2011.Perhimpunan flavipes. African Journal of Biotechnology. 11(9):
Mikrobiologi Cabang Bogor, Bogor. 23132319.
Choi,N.S.,Chung,D.M.,Ryu,C.H.,Yoon,K.S., Maeng, Lina, Yi-Tsung., Jeng, Yuan-Yu., Lin, M.L., Yua, K.W.,
P.J., and Kim, S.H. 2006. Identification of three W ang, F.D., and Liu, C.Y. 2010. Clinical and
extracellular proteases from Bacillus subtilis KCTC microbiological characteristics of Chryseobacterium
3014.J. Microbiol. Biotechnol. 16(3): 457464 indologenes bacteremia.J. Microbiol Immunol Infect
43(6): 498505.

113