Teori dasar

Protein adalah sumber-sumber asam amino yang mengandung unsur C, H, O dan

N yang tidak dimiliki oleh lemak atau karbohidrat. Protein adalah makromolekul
polipeptida yang tersusun dari sejumlah L-asam amino yang dihubungkan oleh
ikatan peptida, berbobot molekul tinggi dari 5000 sampai berjuta-juta. Protein
terdiri dari bermacam-macam golongan, makro molekul yang heterogen,
walaupun demikian semuanya merupakan turunan dari polipeptida dengan BM
yang tinggi. Unsur yang ada dalam hampir semua protein adalah hidrogen,
oksigen, nitrogen, dan belerang (Dennison, 2002,).

Ditinjau dari strukturnya, protein dibagi dalam dua golongan besar, yaitu
golongan protein sederhana dan protein gabungan. Protein sederhana adalah
protein yang hanya terdiri dari molekul-molekul asam amino, sedangkan protein
gabungan adalah protein yang terdiri dari protein dan gugus bukan protein.
(Sudarmaji , 1989.)

Analisis protein dapat dilakukan dengan dua metode, yaitu secara kualitatif dan
secara kuantitatif. Analisis protein secara kualitatif terdiri atas reaksi
Xantoprotein, reaksi Hopkins-Cole, reaksi Millon, reaksi Nitroprusida, dan reaksi
Sakaguchi. Sedangkan analisis protein secara kuantitatif terdiri dari metode
Kjeldahl, metode titrasi formol, metode Lowry, metode spektrofotometri visible
(Biuret), dan metode spektrofotometri U. (Anwar, 1992)

Fraksinasi dengan menggunakan salting out

Banyak metode yang digunakan untuk fraksinasi protein terutama berdasarkan

ukuran molekul dari protein. Sebagai contoh, protein yang diangkat dari larutan
dengan menambahkan garam, proses dari ukuran molekul protein yang lebih
besar ke ukuran yang lebih kecil. Peristiwa pemisahan atau pengendapan protein
oleh garam berkonsentrasi tinggi disebut "salting out". Metode "salting out" ini
mungkin bergantung pada fenomena fisik, dua fenomena tersebut yang penting
di antaranya adalah penghentian dari daya tarik dari permukaan protein oleh ion
garam dan perpindahan air dari sekitar molekul protein oleh kompetisi dari ion
dari garam dengan air (Cantarow and Schepartz, 1963).

Salting out merupakan metode yang digunakan untuk memisahkan protein yang
didasarkan pada prinsip bahwa protein kurang terlarut ketika berada pada
daerah yang konsentrasi kadar garamnya tinggi. Konsentrasi garam diibutuhkan
oleh protein untuk mempercepat keluarnya larutan yang berbeda dari protein
satu ke protein yang lainnya (Mayes dkk, 1990).

Pengaruh penambahan garam terhadap kelarutan protein berbeda-beda,

tergantung pada konsentrasi dan jumlah muatan ionnya dalam larutan. Semakin
tinggi konsentrasi dan jumlah muatan ionnya, semakin efektif garam dalam
mengendapkan protein (Yazid dan Nursanti, 2006).

Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan berat jenis

molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi yang
lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin
yang bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya
2500 rpm (rotation per minute) atau 3000 rpm (Holme and Peck, 1993).

Alat dan bahan

Alat Bahan
Kain penyaring 10 mM Tris-HCl (pH 7,4)
Tabung sentrifugasi 1 mM 2-Mercaptoethanol
50 ml 1 mM PMSF
Blender 1 mM EDTA
Tabung Ammonium sulfate (solid)
mikrosentrifugasi Daging ayam
Pipet tip Dapar Tris-PMSF:
Tabung falcon 50 ml 10 mM Tris-HCl (Ph 8.6)
Econopac kolom O,5 mM 2-
desalting mercaptoethanol
Kolom cibacron blue 1 mM PMSF
Pipet dusposable Dapar NAD :
10 mM Tris-HCl (Ph 8.6)
O,5 mM 2-
mercaptoethanol
1 mM lithium laktat
1 mM NAD
NADH buffer :
10 mM Tris-HCl (Ph 8.6)
O,5 mM 2-
mercaptoethanol
1 mM NADH

Posedur kerja

1. Presipitasi laktat dehidrogenase dari ayam dengan amonium sulfat

Penyiapan jaringan - potong 50 g daging dada ayam,

kemudian di potong kecil-kecil, dibuang jaringan ikat dan lemaknya.

Ekstraksi protein yang larut dimasukan potongan dada ayam dan 75 ml

dapar pengekstraksi dingin ke dalam blender, ditutup dan dihancurkan
jaringan dengan homogenesis. Dinyalakan blender 4x30 detik dengan jeda
minimal 10 detik untuk menurunkan temperatur homogenate.

Sentrifugasi dimasukkan homogenate kedalam empat tabung

sentrifugasi 50 ml yang telah didinginkan, pastikan tube tidak terlalu
penuh. Dimasukan ke dalam sentrifugasi.

Filtrasi dituangkan supernata ( cairanya) melalui kain penyaring kedalam

gelas kimia yang sudah didinginkan terlebih dahulu. Buah ampas daging
 ke tempat yang telah disediakan. Diukur dan catat volume supernatant,
simpan 3x0,5 ml aliqout

Presipitasi dengan ammonium sulfat secara perlahan lebih dari

15 menit ditambahkan 0,39 grams ammonium sulfat per ml
per supernatan ke dalam supernatan yang telah disaring sambil diaduk.
Pengerjaan tahap

2. kromatografi

Resuspensi pellet ammonium sulfat ditambahkan 1 ml dapar Tris-PMSF

ke pellet ammonium sulfat. Perlahan (jangan sampai terbentuk
gelembung) diaduk campuran tersebut hingga semua pellet larut.
Pencampuran dilakukan diatas es.

Diperiksa volume larutan. Dimasukkan larutan resuspensi ke dalam kolom

desalting ketika mendapatkan kolom, bagian atas frit akan ada larutan
dapar, dibuang larutan tersebut. Kemudian dimasukan sampel ke dalam
kolom, buang cairan yang keluar dari kolom.

Elusi protein dari kolom desalting dimasukan 4 ml Tris-PMSF ke dalam

kolom dan ditampung cairan yang dikeluarkan dari kolom.

Dicatat volume cairan yang dikeluarkan dari kolom, disimpan 3x0,1 ml

aliquot cairan hasil elusi, dimasukan fraksi ammonium sulfat desalting
kedalam kolom cibacron blue- setelah menyimpan aliqout, sisanya larutan
dimasukkan ke dalam kolom cibacron blue ditampung 5 ml fraksi.

Pembahasan

Pada praktikum kali ini dilakukan pemurnian dengan menggunakan daging

ayam pada bagian dadanya untuk mengetahui LDH. LDH adalah enzim
yang mengubah priuvat menjadi laktat termasuk golongan oksireduktase.
Awal nya daging ditimbang sesuai jumlah yang dibutuhkan, kemudian
daging tersebut potong kecil-kecil dengan hemogenasi dan dimasukkan
kedalam blender bertujuan untuk merusak jaringan yang berada di dalam
daging ayam tersebut. Setelah daging ayam dihancurkan dengan blender
dan ditambhakan Tris-PMS didalam es batu digunakan Tris-PMS agar
berada didalam suhu optimalnya dalam bentuk es agar berada dalam
suhu rendah. Penghalusan daging ayam bertujuan untuk mengeluarkan
protein termasuk LDH yang berada didaging ayam tersebut.

Langkah selanjutnya masukan daging ayam yang sudah hancur kedalam

tabung reaksi pastikan takaran sama rata atau seimbang bertujuan agar
saat sentrifugasi tidak ada tabung yang pecah karena adanya perbedaan
takaran masukan kedalam sentrifugasi yang bertujuan untuk memisahkan
antara pellet da supernatan yang berkaitan dengan perbedaan BJ. Dimana
hasil akan didapat pada bagian bawah tabung pellet dan pada bagian atas
supernatan.
Karena supernatan adalah hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jebis
paling rendah dan berwarna lebih jernih. Dan pada pellet merupakan
substansi yang dihasilkan pada sentrifugasi yang memiliki bobot jenis
paling tinggi posisinya berada pada bagian bawah mwarnanya lebih keruh
dari supernatan.

Hasil dari sentrifugasi difiltrasi kertas penyaring dan di ambil supernatan,

supernatan yang sudah di ambil diuku. Fungsi dari filtrasi adalah
memisahkan dari campuran berdasarkan ukuran partikelnya. Selanjutnya
supernatan ditambahkan ammonium sulfat yang sudah dihitung.
Pengadukan secara perlahan diatas kelas kimia yang berisi es fungsi dari
pengadukan agar tidak terjadi denaturasi LDH pada supernatan dan
ditambahkan ammonium sulfat berfungsi untuk mengurangi jumlah
molekul air yang berintetaksi dengan protein. Ketika ammonium sulfat
ditambahkan dalam larutan protein akan mencapai konsentrasi dimana
tidak ada lagi molekul air. Supernatan yang sudah ditambahkan
ammonium sulfat lalu dimasukan kedalam sentrifugasi.

Daftar pustaka

Dennison, C., 2002, A Guide to Protein Isolation, Kluwer Academic

Publishers, New York

Sudarmaji dkk. 1989. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Yogyakarta:

Penerbit Liberty

Anwar, F. 1992. Penetapan Zat Gizi Dalam Makanan. Bogor: IPB

Cantarow and Schepartz, 1963, Biochemistry, W.B Saunders Company,

Philadelphia

Mayes, P.A., Granner, D.K., Rodwell, V.W., dan Martin, D.W., 1990, Biokimia
Harper Edisi 20, Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta.

Yazid dan Nursanti, 2006, Penuntun Praktikum Biokimia Untuk Mahasiswa

Analis, Penerbit Andi, Yogyakarta

Holme, D.J and Peck Hazel, 1993, Analytical Biochemistry Second Edition,
Longman Scientific & Technical, New York.